This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והטיפול האתיים בבעלי חיים, ועל-פי פרוטוקול שימוש בבעלי החיים אושר IACUC. תחזוקת קו 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי BAF3 תרבות במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ובינוני תרבות בילה של תאי Wehi. לגדל תאי HEK293T בDMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר). שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. </li></ol> 2. פלסמיד בנייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את העכבר JAK2 ואיזופורם JAK2-V617F שבעור בpMSCV-פור-GW על ידי LR clonase באמצעות הליך שיבוט רקומבינציה סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבניית וקטור הביטוי בלוציפראז (pMSCV-לוק-הדובדבן-GW) המשמש ב- viההדמיה vo, להגביר לוציפראז מוקטור pLVX-ט-ON על ידי PCR באמצעות פריימרים (לוק-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG ולוק-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) ואחריו עם שיבוט בpENTR-SD-TOPO ליצור pENTR-לוק, המשמש להעביר את הגן בלוציפראז בוקטור retroviral, pMSCV-דובדבן-GW על ידי שיבוט תיווך רקומבינציה באמצעות clonase LR. </li></ol> 3. הכנת ספריית מוטציה אקראית, הקרנה וזיהוי המוטציות 3.1) אקראי mutagenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באורך מלא שיבוט של סוג בר JAK2 ומוטצית V617F לתוך וקטור retroviral pMSCV-הפור-GW באמצעות טכנולוגיית שיבוט רקומבינציה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד JAK2-V617F להפוך, XL-1 אדום, E. תאי coli, שהוא פגום במנגנוני תיקון DNA ובכך מאפשר להם לשלב מוטציות אקראיות בעת השכפול. באופן ספציפי יותר, לערבב 50-100 ng של DNA (DNA של יותר מ -100 ng מקטין את יעילות שינוי) עם 100 μl של תאים מוסמכים בצינור פוליפרופילן טרום צונן וטופחו על קרח למשך 30 דקות, בעדינות מתערבלת כל 5 דקות. לכיסוי ספרייה טוב, להשתמש 05:56 צינורות של תאים מוסמכים. הערה: DNA של יותר מ -100 ng מקטינה את יעילות שינוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הצינור באמבט מים ב 42 ° C להלם חום של 45 שניות ולדגור על קרח במשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום SOC (tryptone 2.0%, 0.5% תמצית שמרים, 0.05% NaCl, 10 מ&quot;מ MgCl2, 10 מ&quot;מ MgSO4, ושל 0.4% D-גלוקוז). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב225-250 סל&quot;ד 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט מצינור אחד בארבעה 10 סנטימטרים צלחות LB-אגר המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. דגירה הצלחות ל16-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מושבות גלויות, לאסוף אותם על ידי גירוד הצלחות עם מגרד צלחת סטרילית. תאי בריכה מכל DNA צלחת ופלסמיד המבודד באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מסחרית. הערה: בדרך כלל מושבות קטנות ולקחת 18-24 שעות כדי להיותגלוי כי אלה הם זני חיידקים הגדלים לאט. בשלב זה, להעריך את ההטרוגניות של מוטציות בספרייה על ידי עיכול הגבלה עם חותך תכוף כגון Sau3A1 או Taq1 או רצף. </li></ol> 3.2) ייצור Supernatants retroviral והתמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני transfection, צלחת 4 x 10 6 תאי 293T HEK על 100 מנות סנטימטר בDMEM המכילות 10% FCS, פניצילין / סטרפטומיצין וL-גלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את המדיום וtransfect התאים עם ספריית pMSCV-JAK2-V617F mutagenized. לכל צלחת 10 סנטימטרים, לערבב 10 מיקרוגרם של ה- DNA (5 מיקרוגרם של ספריית פלסמיד ו5 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה retroviral, pCLEco) עם 40 μl של FuGENE להיקף כולל של 400 μl באמצעות תקשורת DMEM חופשית בסרום. דגירה תמהיל DNA ושומנים בדם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר 20 דקות להוסיף הטיפה המורכבת DNA שומנים בדם חכם על גבי תאי HEK293T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שש שעות, לשנות את תקשורת transfection wה- i תקשורת טרי ודגירת הצלחות במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס לייצור וירוס. לאחר 48 שעות של דגירה, לאסוף supernatants ויראלי המסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר acrodisc. </li></ol> 3.3) בחירה של שיבוטים עמידים במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למוטציות JAK2-V617F תרופה עמידות, transduce 100 מ&#39;BAF3 תא עם של supernatants וירוס שיש כייל נגיף של 0.5-1 x10 6 100 מיליליטר. באופן ספציפי יותר, לערבב 10 8 תאים עם של supernatant וירוס 100 מיליליטר להיקף כולל של 300 מיליליטר באמצעות תקשורת RPMI, סרום המכיל 10% ו -24 מיקרוגרם / מיליליטר של polyberene (ריכוז סופי של ployberene הוא 8 מיקרוגרם / מיליליטר). להפיץ מערבלי תאים אלה במספר רב של שש צלחות היטב (4-5 מיליליטר לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחות ב 1,250 XG למשך 90 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בריכת התאים יחד ומערבבים עם Ruxolitinib ובינוני המכילים אגר רך ומצופה בsix צלחות גם. עבור כל ריכוז תרופה, לערבב 10 מיליליטר של תאי transduced BAF3 (10-20 מיליון תאים) עם הכמות המתאימה של Ruxolitinib בשפופרת 50 מיליליטר. מרכיבים את הנפח 40 מיליליטר באמצעות RPMI המכיל סרום 20%. הוסף 10 מיליליטר של אגר 1.2% לתאים, mixcarefully וצלחת בשש צלחות גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. פיק המושבות עמידות באמצעות טיפים פיפטה 0.2 מ&quot;ל ותת-תרבותם בנפרד ב 24 צלחות גם במשך 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי BAF3 העמידים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות בטמפרטורת חדר. לבודד את הדנ&quot;א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הדנ&quot;א הגנומי מסחרית. PCR להגביר אורך מלא JAK2 cDNA משל פריימרים הגנומי DNA באמצעות (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG וmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) וארוכת תבנית להרחיב מערכות PCR איכות גבוהה 100 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את מוצרי ה- PCR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. בלו 3.4 kb של להקת DNA המייצג מסגרת קידוד JAK2 ולבודד את ה- DNAבאמצעות ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית. רצף באורך המלא של cDNA באמצעות 8 פריימרים פנימיים (P1 - P8) פורש רצף הקידוד ורצפים לנתח באמצעות תוכנה מסחרית. </li></ol> 4. במבחנת אישור של מוטציות עמידות שיבוטים תא רבים לשאת מוטציה יותר מאחד, כדי לבדוק את תרומתו של כל מוטציה בפנוטיפ התנגדות, ליצור גרסאות שנבחרו על ידי מוטגנזה מכוונת באמצעות פלסמיד pMSCV-JAK2V-617F כתבנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע mutagenesis האתר מכוון על פלסמיד pMSCV-JAK2-V617F באמצעות ערכת mutagenesis מסחרית וoligonucleotides נועד ליצור מוטציות נקודה. לאשר את זהותם של שיבוטים מוטציה על ידי רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאי BAF3 עם רטרווירוסים נעשה באמצעות פלסמידים מוטציה אחריו עם בחירה באמצעות puromycin ב1μg / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 10 4 תאי BAF3-JAK2-V617F (50 μl של RPMI עם 10% FCS) לבאר כל צלחת גם 96. נפרדly להוסיף 50 μl של תקשורת ruxolitinib המכיל את הבארות על פני הצלחת (הריכוז הסופי: 0, 1, 3, 5, 10, ו -20 מיקרומטר), ודגירת הצלחות במשך 60 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את כדאיויות תא על ידי הוספת 10 μl של מגיב WST-1 לכל ואחרי היטב עם דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות. שיא הספיגה ב A450 באמצעות קורא צלחת. לבצע את כל מבחני בשלושה עותקים ועלילה בממוצע ספיגה נגד INCB018424 ריכוזים. לבצע עקומת sigmoidal מיטבית באמצעות אלגוריתם הולם עקומה ליניארית. ציון ריכוז התרופה וכתוצאה מכך 50% כדאיות תא כIC50 הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, צלחת שישה מ&#39;BAF3 תאים לבטא גרסאות JAK2 בשש צלחות גם במדיום RPMI המכיל סרום 10% עם עלייה בריכוזים של ruxolitinib וטופחו במשך 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, וlyse ב -20 מ&quot;מ טריס-Cl (pH 7.5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 5 מ&quot;מ EDTA, 1 המ&quot;מ EGTA, 1 פלואוריד מ&quot;מ נתרן, 2 מ&quot;מ נתרן Vanadate, ו -5% גליצרול בתוספת מעכבי מעכבי פרוטאז קוקטייל וphosphatase. Sonicate ההשעיה תא 1 דקות ואחריו תוספת של חיץ טעינת ג&#39;ל 5x (350 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 6.8], 500 מ&quot;מ DTT, 15% SDS, 10 מ&quot;מ Benzamidine, 5 מ&quot;מ EDTA, 5 מ&quot;מ EGTA, 5 מ&quot;מ נתרן Vanadate , קוקטייל פרוטאז, 50% גליצרול, ו0.001% bromophenol כחול) וdenaturation על 70 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור את החלבונים על 8% ג&#39;ל polyacrylamide SDS בתנאי denaturing. בצע immunoblotting עם STAT5 אנטי-phopsho חד שבטי עכבר. להפשיט את הכתמים וreprobed עם נוגדן אנטי SATA5 polyclonal ארנב. דמיינו את הלהקות באמצעות ריאגנטים ECL בהתאם להמלצתו של הספק. </li></ol> 5. בVivo אישור ב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאי BAF3 להביע לוציפראז ודובדבן (transduced עם רטרווירוסים עשויים pMSCV-לוק-cherר&quot;י GW) עם וירוסים להביע JAK2-V617F וריאנטים עמידים. בחר תאים ששורדים בחירת puromycin לביטוי של JAK2 וריאנטים התנגדותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שני מיליון תאים / דובדבן BAF3-לוק ומתרחבים ביצוע JAK2-V617F וריאנטים העמידים שלה ב -200 μl של PBS על 6 עכברי BALB / C באמצעות הזרקה לוריד זנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה ימים של השתלות תאים, להזריק עכברים עם Ruxolitinib (100 מ&quot;ג / קילוגרם) פעמיים ביום במשך שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה פליטת אור מבוסס לוציפראז עם מערכת הדמיה. . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להכין פתרון luciferin ידי המסת 300 מ&quot;ג ל- 25 מיליליטר של מים סטריליים deionized, aliquot בנפח ובחנות קטנים יותר. הערה: luciferin החנות ב -80 ° C ולהגן מפני אור עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 250 μl לכל עכבר על ידי IP כדי להשיג 125 מ&quot;ג / קילוגרם בכל עכבר. להרדים את העכברים מאותה קבוצה יחד באמצעות isoflurane בשאיפה (1.5% -2.0%) בקופסא אטומה. החל משחה וטרינר על העין אלקטרוני למניעת יובש. הערה: הזמן שלוקח לעכברים לישון (10-15 דקות) אפשרה פעילות luciferin לשיא. שמור את הזמן עקבי בין הקבוצות, כדי למנוע וריאציה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכברים מייד לבמת חדר הדמיה ולשמור על הרדמה בisofluorane 1.5-2% במהלך הליכי הדמיה. עכברי תמונה עם חשיפת שניות רציפה 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, ו -300. צלם תמונות ולכמת עוצמת פליטת אור באמצעות רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. בעקבות הדמיה להחזיר את העכברים חזרה לכלוב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל, הכולל תאים bonemarrow in vivo קציר chimerism. להרדים את העכברים עם CO 2 דקות 5 אחריו עם נקע בצוואר הרחם. לקצור את העצמות ולמחוץ ב 4 מיליליטר PBS הקר כדי לאסוף את מח העצם. נתח את התאים חיוביים דובדבן אחוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות FACS. לאסוף עשרים אלף אירועים מכל מדגם. </li></ol>

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

ההצלחה הקלינית של גליבק בטיפול CML הפגינה לא רק את הפוטנציאל של מיקוד קינאז האודם על ידי מעכבי מולקולה קטנים, אבל מגבלות גם חשפו טיפול ממוקד: חזרה קליני והופעה של מוטציות עמידות לתרופות בגן המטרה. זיהוי מוטציות התנגדות מסייע בניהול ופיתוח טובים יותר של מעכבי הדור הבא קליניים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לזהות מוטציות עמידות לתרופות בגן הממוקד. שיטה זו משתמשת בספריית פלסמיד mutagenized באופן אקראי שנבנתה בE. coli, כדי לבטא את חלבוני המוטציה. הספרייה לאחר מכן הציגה בBAF3 תאים (רגישים לשינוי על ידי אונקוגן), אחריו עם בחירה של שיבוטים תא בנוכחות של חומרים כימותרפיים. רצף של גן ממוקד משיבוטים עמידים מזהה מוטציות מקנות התנגדות. לבסוף, מוטציות המזוהים מחדש על ידי אתר מכוון mutagenesis כדי לאמת אותם לעמידות לתרופות. באמצעות אסטרטגיה זו הגדרנו את הספקטרום של המוטציות בJAK2 וBCR / ABL המקנות התנגדות לRuxolitinib וגליבק, בהתאמה. אנו מזוהים יותר ממאה מוטציות בBCR / ABL. חוץ מזה, זיהוי כל המוטציות העיקריות שזוהו בחולים, שיטת ההקרנה שלנו אפשרה לנו לזהות החלפות רומן של שאריות הן בתוך ומעבר לתחום קינאז. מעניין, כל המוטציות מהמסך שלנו זוהו בדגימות מטופל אך תהליך זה לקח כמעט יותר מ -10 שנים 15, הממחיש את היכולת של מסך זה כדי לצפות מוטציות שתהווינה עמידות לתרופות קליניות בעייתית וכך. בעוד הקרנה עמידה באמצעות mutagenesis האקראי מספקת יתרונות רבים בהשוואה לשיטות אחרות, יש בעיות פוטנציאליות להיות מודעת כאשר בעקבות הליך מיון. לכל הקרנה, מומלץ מאוד לBAF3 תאים להיות תלוי באופן מלא ביעד שנגדו רזהעמדה הוא ביקש. כישלון או תלות חלקית בגן המטרה עשוי שלא לפתח שיבוטים עמידים נכונים וסביר להניח לפתח חיוביים שגוי. לדוגמא, ארבעה מחקרים שונים שבוצעו הקרנה עמידה נגד מעכבי JAK2 באמצעות BAF3 תאים transduced עם או EPO או קולטני MPL כדי להקל על תלות JAK2-V617F 16-19. רק שמונה מוטציות עמידות מוגבלות לkinase תחום זוהו ממסכים אלה, אם כי שיבוטים עמידים רבים פיתחו שחסרי מוטציות, ככל הנראה בשל הופעתה של תוצאות חיוביות שגויות, שיוחסה לheterodimerization של JAK1 וJAK3 עם קולטנים ציטוקינים. לכן, כדי למנוע אובדן של תלות JAK2 בצענו הקרנה עמידה בBAF3 רגיל שהראתה מבחר חזק של שיבוטים עמידים נגד Ruxolitinib וכל שיבוטים אלה הראו נוכחות של מוטציות עמידות. בהתבסס על תצפיות אלה, במטרה לרתום את מלוא הספקטרום של מוטציות עמידות, אנו ממליצים שתא BaF3ים צריך להיות תלוי באופן מלא בkinase הממוקד כדי למנוע את ההופעה של תוצאות חיוביות שגויות, כפי שהיה מקובל בהקרנות עמידות קודמות שבוצעו נגד מעכבי JAK2 16,17. בנוסף, הוא קריטי כדי למנוע תנאי תרבות בתפזורת שבו תאי מחסה מוטציות שונות הם אספו יחד ואפשרו להרחיב בתרבות הנוזלית, שכן זה יכול להוביל לדומיננטיות משובטים של כמה גרסאות מאוד עמידות בפני תרופה. לדוגמא, במהלך בחירה ראשונית לimatinib-התנגדות של mutagenized BCR-ABL בתרבות נוזל בכמות גדולה, מצאנו רק 4 מוטציות שהיו מיוצגות מספר פעמים בתוך 100 הראשונים מבודדים רצף. לכן, הקרנה באמצעות אגר רך מאפשרת שיבוטים גדלו איטיים בדרגות צנועות יותר של עמידות לתרופות שניתן להפיק שלא להיות מזוהה באמצעות תרבות בתפזורת. מסיבה זו, מומלץ לגדול תרבות בתפזורת לפני הבחירה רק ל14-16 שעות, ואחריו עם בחירת תרופה ללא IL3 באגר רך. באקס שלנוperience, גדל תרבויות מעבר 36 שעות לאחר התמרה ויראלית נוטה להיות נשלטת על ידי שיבוטים שגשוג מאוד, אשר מהווה סיכון לאבד שיבוטים גדלו איטי (בחולשה טרנספורמטיבי). כמו כן, שימוש בתאים מנקודתי זמן קודמת כגון 6-8 שעות לאחר התמרה ויראלית נוטות לבחור עבור שיבוטים טרנספורמטיבי או overexpressing מאוד, ובכך גורם להטיה ומצג שווא בזהות ובתדירות של שיבוטים התנגדות. לכן, אנו ממליצים על שימוש בתאים שגודלו עבור התמרה 14-16 לאחר שעות נגיפיות להקרנה, המספק מבחר הדוק של שיבוטים בודדים ומונעת דומיננטיות משובטים נצפו בדרך כלל בתרבויות נוזל בכמות גדולה. זה חיוני כדי לאשר את היכולת של מוטציה מועמד להקנות עמידות בבידוד, שכן חלק השיבוטים זוהו יש מוטציות רבות. עבור מסך JAK2-V617F, אנחנו מחדש ברוב של המוטציות שזוהו מספריית mutagenesis האקראי שלנו באמצעות mutage אתר מכווןNesis. לאחר שהציג את מוטציות בודדות לתוך תאים טריים, הם היו אז גדלו בנוכחות של תרופות שונות כדי לקבוע IC50s עבור כל מוטציה. גם בדקנו שתי גרסאות שונות עמידות להתנגדות in vivo על ידי ניטור פליטת אור כדי לאשר את היכולת של מוטציות בודדות אלה כדי לגרום לעמידות לתרופת in vivo נוסף. לאור ההצלחה של טיפול אנטי-kinase בטיפול בסוגי הסרטן שמגולוון גל של מעכבי קינאז במרפאות, חשוב לזהות את ההתנגדות קלינית הבעייתית מקנות מוטציות לטוב ניהול מטופל ופיתוח תרופות שיכולים למקד אותם. אסטרטגית הקרנה זו שמשה בהצלחה לזהות מוטציות בBCR / ABL, JAK2 וFLT3 20; עם זאת, אנו מאמינים שזה יהיה בדרך כלל החלים על מגוון רחב של חומרים אנטי-נאופלסטיות.

קינאז החלבון הם אנזימים רגולטוריים מרכזיים של מסלולי העברת אותות תוך-תאיים שלכאורה לווסת כל פונקציה סלולרית. בקרה נאותה של איתות kinase בתיווך היא קריטית להומאוסטזיס ופיתוח, אשר רובם מסתמך על רגולציה ראויה של קינאזות, phosphatases והשפלה שלה על ידי UPS (מערכת היוביקוויטין פרוטאזום). קינאז deregulated נמצא במרכז הבמה של סוגי סרטן רבים ומעורב בשורה של מחלות בבני אדם 1. הגנום אנושי מקודד יותר מ -500 קינאז חלבון שנקשר, במישרין או בעקיפין, ל~ 400 מחלות אנושיות 2. תצפיות אלה תמכו ברעיון למיקוד טיפולי של קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנים 3-5. ההפגנה של מעכבי קינאז ABL, כגון גליבק, בטיפול בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) סיפקה את ההוכחה של מושג לגישה זו 6,7. תצפית זו מהפכה בנמלים לא רקi-kinase טיפול אלא גם נאכף הרעיון לזהות נגעים הגנטיים במחלות אחרות גידולים למיקוד טיפולי, שתובלנה לגילוי של מוטציות סרטניות בJAK2 מפוליציטמיה (PV) וחולים עם שאתות myeloproliferative (MPN). תגלית זו עוררה עניין רב בטיפול בMPNs על ידי מיקוד JAK2 במעכבי קינאז מולקולה קטן. עכשיו, כמעט תריסר של מעכבי JAK2 נמצאים בניסויים קליניים ואחד מהם אושר לאחרונה לטיפול במיילופיברוזיס ראשוני. בעוד מיקוד ספציפי של קינאזות שעור על ידי מעכבי מולקולה קטנים בסרטן להביא תוצאות מבטיחות, היא גם סובלת ממפתחים עמידים לטיפול. למעשה, עד כה, חולים שטופלו במעכבים קינאז, כגון גליבק, ארסתי, Erlotinib וdasatinib פיתחו מוטציות התנגדות בעיקר על ידי רכישת מוטציות בתחום קינאז שתרופה מיועדת ל8-10. התנגדות כתוצאה ממוטציה בגן מדגישה את המגבלות of ממוקדת טיפול יחיד נגד קינאז שהעור, ומייצגת את האתגר הבא בהתפתחות של סרטן כימותרפיה יותר ויותר מוצלחת. השלכות מכניסטית ופונקציונליות של עמידות לתרופות צריכות לספק רציונל לבחירה ועיצוב של תרכובות משלימות לפיתוח תרופות. מוטציות שזוהו באמצעות מסכי במבחנה, הראו רמה גבוהה של מתאם עם אלה שנמצאו בחולים. לכן, הקרנה במבחנה למוטציות המעניקות סמים התנגדות לזוגות יעד תרופה ניתנו באסיסטים פיתוח קליניים או פרה-קליניים בזיהוי דפוסי ההתנגדות שעלול לגרום להישנות קלינית. זיהוי של מוטציות אלה הוא לא רק מועיל בניטור החולים לתגובת סמים ולהרע, אלא גם חיונית לעיצוב של מעכבי הדור הבא חזקים יותר. לדוגמא, פיתוח של מעכבי BCR / ABL הדור הבא, Nilotinib וPonatinib, התאפשרו בגלל MEC יותרהבנות hanistic צברו מmutagenesis, מבני, ומחקרים תפקודיים. מוקדם יותר, יש לנו דיווחו על התוצאות של המסך שלנו באמצעות mutagenesis של BCR / ABL האקראי כדי לחשוף את הספקטרום של מוטציות המקנות עמידות למעכבים כגון 11,12 גליבק, 12 PD166326, ו -13 AP24163. התוצאות לא רק זיהו את המוטציות המקנות הישנות התנגדות ומחלה קלינית, אלא גם סיפקו את הבנת מכניסטית של עמידות לתרופות ולעקרונות המסדירים את תפקוד kinase 11,14. כאן אנו מספקים פירוט מתודולוגיים נוסף, באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כדי לאפשר יישום רחב יותר של אסטרטגית הקרנה זו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">name of Materials/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:116px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:453px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell and Tissue culture&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaF3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td>
			<td>A gift from Ross Levine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-V617F-Cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pMSCV-Luciferase-puro.GW</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penn/Strep</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Atlanta biological</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 1X</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1XPBS</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3369</td>
			<td>5mg/ml stock in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trapan Blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Cellgro (corning)</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INCB018424 (Ruxolitinib)</td>
			<td>ChemieTeK</td>
			<td>941678-49-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45uM acro disc filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70um nylon cell stariner</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XL-1 red E.Coli cells</td>
			<td>Agilent Tech</td>
			<td>200129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SOC</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B90920s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>100mg/ml stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terrific broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E-3119-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dneasy Blood&#38; tissue kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Expand long template PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1168134001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wizard Sv gel and PCR clean up system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pure Yield plasmid mini prep system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &#38; OmniMAX 2 Competent Cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12535029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gateway&#160; LR Clonase Enzyme mix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortor pestle</td>
			<td>Coor tek&#160;</td>
			<td colspan="2">60316 and 60317</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflorane (Isothesia TM)</td>
			<td>Butler Schien</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TC-10 automated cell counter</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td></td>
			<td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

הגילוי של BCR / ABL כאונקוגן נהג בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) הביא לפיתוח של גליבק, אשר, למעשה, הוכיח את הפוטנציאל של מיקוד kinase בסרטן על ידי יעילות טיפול בחולי CML. תצפית זו חוללה מהפכה בפיתוח תרופות למקד קינאז שהעור מעורב בגידולים ממאירים שונים אחרים, כגון, EGFR, B-RAF, KIT וPDGFRs. עם זאת, חסרון עיקרי אחד של טיפולים אנטי-kinase הוא ההופעה של מוטציות עמידות לתרופות טיוח היעד להפחיתה או איבדה את הזיקה לסמים. הבנת המנגנונים המועסקים על ידי גרסאות עמידות לא רק עוזרת בפיתוח מעכבי הדור הבאים, אלא גם נותנת תנופה לניהול קליני באמצעות רפואה אישית. דיווחנו אסטרטגית retroviral וקטור מבוססת הקרנה לזהות את הספקטרום של ההתנגדות המקנה מוטציות בBCR / ABL, אשר סייעה בפיתוח הדור הבא BCR / ABL מעכבים. באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כאן אנו מתארים בשיטות הקרנה חוץ גופית שמנצלות את תאי BAF3 העכבר מבטאים את ספריית המוטציה האקראית של קינאז JAK2.

הופעתה של מוטציות גנטיות מהווה אתגר גדול עבור הטיפול אנטי kinase הממוקד. מחקרי מוטאציות, מלבד מתן תובנות מכניסטית ופונקציונליות שהם סייעו בבחירה ועיצוב של פיתוח תרופות מהדור הבא, גם מאפשר ניהול קליני טוב יותר ועשויים בעתיד להיות מועיל יותר לטיפול מותאם אישית. בניסוי זה, אנו מציגים הקרנה למוטציות ruxolitinib התנגדות בkinase JAK2-V617F (איור 1). אנו נבנו וקטור pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway על ידי החדרת העכבר באורך מלא JAK2-V617FcDNA לpMSCV-הדובדבן-GW. מומלץ להשתמש במאכסן (XL-1 זן אדום של E. coli) לפתח מוטציות אקראיות על הבחירה הפופולרית ביותר של שיטה, שהוא PCR, בשל מגבלותיה הקשורים לברי הטיה רצף וגן גדול יותר קשים כדי להגביר . ספריית DNA mutagenized באופן אקראי הייתה transfected לתאי HEK293T לייצור רטרו-וירוס. vir מוטציה אלהשימושים שמשו ל, transduce תאי BAF3 שנבחרו לצמיחת מושבה ברכה-אגר בהעדר IL-3 עם 1 או 5 מיקרומטר של Ruxolitinib. בתנאים אלה, מושבות נובעות רק מהתאים הנושאים cDNAs JAK2V-617F שמבטא גרסה פונקציונלית ועמידה של קינאז. אחרי 10 - 14 ימים, מושבות בודדות מופרדות היטב נקטפו, אשר מגוון בגודלם, והרחיב אותם בתרבות הנוזלית. הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד מהתאים אלה. Provirus נמצא על ידי הצלה ישירה או על ידי PCR. Proviruses התאושש היו רצף לזהות מוטציות (איור 1). ניתוחי רצף בוצעו באמצעות חבילת DNASTAR של Lasergene. בגלל שיבוטים תא רבים נשאו מוטציה יותר מפעם אחת, אנו ממליצים בחום אימות מוטציות אלה בבידוד על ידי שני במבחנה ובמבחני vivo (איורים 2 ו -3). כדי לאמת את הפעילות של גרסאות בבידוד,גרסאות שנבחרו נוצרו על ידי אתר מכוון mutagenesis של רצף JAK2V-617F. גרסאות אלו מחדש לתאי BAF3, ונמדדו ביכולת התפשטות תאים במינון של Ruxolitinib שונה כדי להעריך IC50 (ערכי IC50, איור 2 א). מבחני ביוכימיים מבוצעים לphosphotyrosine או phospho-STAT5 על ידי ניתוח immunoblot על lysates החלבון של תאי BAF3 שהודגרו עם הגדלת מינון של Ruxolitinib כדי לשלול כל התנגדות יעד את תיווך (איור 2). מוטציות מציגות ערכי IC50 משופרים וautophosphorylation המתמשך בריכוזים גבוהים יותר ובכך Ruxolitinib אישרו להיות גרסאות עמידות בפני תרופה. מכיוון שרבי מוטציות עמידות להראות תגובת מינון משתנה, ולכן זה הכרחי כדי לבדוק אם מוטציות אלה תקנינה גם בהתנגדות vivo. בדרך כלל, אנו ממליצים לבחון רק 2 -3 גרסאות שונות לניסויי in vivo, כפי שהם יקרים ומייגע. כדי לאמת את התנגדות in vivo, תאי BAF3 הונדסו לבטא גרסאות JAK2-V617F ולוציפראז / דובדבן, כדי לאפשר מעקב in vivo. עכברים הוזרקו 1-2 מיליון תאי דובדבן חיוביים (להביע גרסאות JAK2 ולוציפראז), ואחריו הזרקת Ruxolitinib במשך שבועיים. אחרי שבועיים, עכברים הם צילמו לפליטת אור-זרז לוציפראז (איור 3), וגם לchimerism BAF3 בbonemarrow ודם היקפי על ידי מדידת הקרינה של תאים חיוביים דובדבן (איור 3). עכברים להביע JAK2-V617F רגישים לRuxolitinib, ואילו גרסאות עמידות להראות תוספת מתקדמת בפליטת אור על פני תקופת טיפולים, ובכך מצביעה על כך שתאי BAF3 להביע גרסת JAK2-V617F עמידים לטיפול Ruxolitinib in vivo. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51984/51984fig1highres.jpg" /> <strong&gt; איור 1: תכנית לסינון מוטציות ההתנגדות נגד מעכב kinase Ruxolitinib. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51984/51984fig2highres.jpg" /> איור 2:. תכנית מראה באימות מבחנה באמצעות מבחני תלויים מינון שגשוג תאים (א) ומערבי (B) סופג <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51984/51984fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51984/51984fig3highres.jpg" /> איור 3: ייצוג סכמטי של לוציפראז in vivo באמצעות אימות זרז מדידת פליטת אור. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51984/51984fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר</a>גרסה של נתון זה.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוטציות עמידות במבחנה.

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוט?...

Video: A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

הזרקת. עוברים stephensi ליצור מלריה עמידים יתושים

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Assay הקרנת פלורסנט לזיהוי מאפננים של ערוצים GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

RNA Catalyst ככתב להקרנת סמים נגד RNA עריכה בtrypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...