Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. הכנת מדיה הערה: הפרוטוקול מסתמך על השימוש בשילוב של שני כלי התקשורת נפרד: DMEM / F12 בתוספת תוסף שונה N2 וNeurobasal השלים עם תוסף B27, בדרך כלל בביחס של 1: 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תוספת N2 שונה על ידי ערבוב הרכיבים בשפופרת 15 מיליליטר. לא מערבולת או לסנן זה; מערבב על ידי היפוך הצינור עד הפתרון הוא ברור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי pipetting 7.2 מיליליטר של DMEM / F12, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של 25 מ&quot;ג / מיליליטר אינסולין (המורכב ב0.01 M HCl) ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך. זה לוקח כמה דקות עד שהפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 100 מ&quot;ג / מיליליטר apo-transferrin (מורכב במים), 33 μl של 0.6 מ&quot;ג / מיליליטר progesternone (מורכב באתנול), של 160 מ&quot;ג / מיליליטר (1 מ &#39;) פוטרסין 100 μl (מורכב במים ), 10 μl של 3 מ&quot;מ הסלניום נתרן (מורכבים במים) וμl 666 של 7.5% אלבומין בסרום שור ומערבבים היטב הצינור. Aliquot לתוך 2.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 °C עד 2 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התקשורת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מיליליטר של DMEM / F12 להוסיף 2.5 מיליליטר של N2. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מיליליטר של Neurobasal תקשורת להוסיף 5 מיליליטר של תוסף B27. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התקשורת מ1.2.1 צעדים ו1.2.2 ביחס של 1: 1. בחלק מהמקרים 1: ייתכן שתידרש 3 תערובת (בתוספת כ1: תערובת 1 בצעד 1.2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתערובת להוסיף 0.5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 0.2 מ&quot;מ) ושל 3.5 μl של 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי 0.1 מ&quot;מ) ומערבבים היטב בלי ללחוץ. אחסן את המדיה ב- C ° 4 עד 3 שבועות ולהימנע מחשיפה לאור. מיקס סופי זה נקרא N2B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ג&#39;לטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ג&#39;לטין 1% במי ultrapure וחיטוי ב 121 ° C, 15 psi, במשך 15 דקות. חשוב שהבקבוק משמש לכך הוא נקי לחלוטין מחומרי ניקוי או חומרי חיטוי, ולכן מומלץ שבקבוק חדש הואמשמש לזה ואי זה רק לשטוף במי ultrapure בין שימושים. Aliquot פתרון 1% ל -50 aliquots מיליליטר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם aliquot של ג&#39;לטין 1% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולהוסיף 500 מיליליטר של תמיסת מלח חם שנאגרו פוספט (PBS). מערבבים היטב וpipet מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של כל טוב או צלחת. לאפשר את הג&#39;לטין למעייל המשטח לפחות 30 דקות. </li></ol></li></ol> 2. ציפוי התאים הערה: פרוטוקול זה חל באופן שווה על ESC העכבר גדל בסרום% 10 עם גורם מעכב לוקמיה (LIF), החלפת סרום עם LIF או סרום ללא מדיה עם חלבון LIF והמוךפו&quot;גנטי עצם 4 (BMP4) או מעכבי MEK וGSK3 (תקשורת 2i) עם או בלי LIF. עם זאת, העיתוי והיעילות של הבידול עשוי להשתנות בהתאם לתקשורת ותאים (ראה דיון). לניסויים המוצגים כאן השתמשנו בקו 46C עכבר ESC (שיש לו כתב EGFP דפק לone של אללים Sox1 אנדוגני), גדל בGMEM עם סרום 10% וLIF. לקבלת תוצאות אופטימליות חשוב שהתאים הם ניתקו וreplated בתקשורת N2B27; פשוט המשתנה של תקשורת מGMEM / סרום / LIF לN2B27 תמיד תוצאות ביעילות בידול מופחתת בהשוואה לreplating התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התאים בGMEM עם סרום 10%, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ, חומצות אמינו לא חיוניות 1x, 0.1 מ &#39;2-mercaptoethanol, ו 100 יחידות / מיליליטר LIF 13. כדי לקבל תרבות subconfluent של העכבר ESC, צלחת 1 x 10 6 תאים לבקבוק תרבות T25 שייקח 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב תאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כאשר התאים subconfluent ומוכנים למעבר, לשטוף אותם פעמים PBS. הוסף 1 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה ולחזור לחממה עבור 2-5 דקות. למרות טריפסין ואנזימים אחרים יכולים לשמש גם לתא דיסוציאציה, הם יכולים להיות השפעה שלילית על קובץ מצורף תא כך צפיפות הציפוי צריכה להיות adjusted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים מתחילים להרים מהצלחת, הקש על הכלי כדי לסלק אותם להשעית תא בודדת. לאסוף את התאים לסכום כולל של 10 מיליליטר של תקשורת ותא דיסוציאציה מגיב וpipet לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים ב XG 300 דקות 3 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של N2B27 מראש חימם על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. כאשר pipetting ההשעיה למטה, pipet נגד הצד של הצינור, כדי למנוע יצירת בועות. ספירת התאים עם דלפק תא אוטומטי או haemocytometer ולהקליט את הריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעיה תא המכילה את המספר הרצוי של תאים ליחידת הנפח להיות מצופה בכל טוב בN2B27 מראש חימם. צפיפות של 10,500 תאים לכל 2 סנטימטר בצלחת 6 היטב (כלומר, 1 x 10 5 תאים לכל גם מנה 6 היטב) הוא אופטימלית. ראה טבלת 1 למספר הציע של תאים לכל 2 סנטימטר וPLAכרכי תקשורת טינג עבור מגוון רחב של כלי תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ג&#39;לטין מכלי התרבות וצלחת ההשעיה התא לפי הצפיפות הציעה ונפח בטבלה 1. אל מערבולת הצלחות כמו זה להתרכז התאים למרכז. מניחים את התרבויות בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות תקשורת כל 1-2 ימים על ידי החלפת כל התקשורת עם N2B27 הטרי. פיפטה בעדינות כמו שטיפת התאים עשויים להשפיע על צפיפות ולהפחית את יעילות בידול בימים הבאים. איפה כדאיות ראשונית לאחר הציפוי היא עניה, צלחת התאים ב1: 3 שילוב של תקשורת N2 ותוספת-B27 ולשנות את זה לN2B27 אחרי היומיים הראשונים. תאים יתחילו להבחין וצריכה להראות ביטוי Sox1 (גלוי על ידי הקרינה ירוקה של הכתב בקו 46C התא משמש כאן) בתוך 4-6 ימים. </li></ol> 3. Immunofluorescent מכתים NOTE: הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל סוג כלי. הנפח של כל מגיב מתואר בכל טוב של 6-גם צלחת וניתן לשנותם לכל שטח פנים. Replating אינו מומלץ בשל הכדאיות הנמוכה לאחר מכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני בידול ולתקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של 4% (V / V) paraformaldehyde, להשאיר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף וpermeabilize התאים עם 2 מיליליטר של PBS-T (שנאגרו מלוח פוספט עם 0.5% (V / V) tween-20) פעמיים. יכולים להיות כל הזמן בתאים PBS-T של עד 2 חודשים ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS-T עם 1 מיליליטר של PBS-T עם 10% (V / V) בסרום (מאותו המין כמו נוגדנים משני). דגירה שעה 1 בנדנדת הצלחת ב RT לחסום כל מחייב שאינו ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מיליליטר של PBS-T, והדגירה בIgG עכבר 500 μl נגד βIII טובולין (בדילול 1: 1,000 ב PBS-T עם סרום 10%). לשים על הנדנדה הצלחת, ולהשאיר O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהצעד הזה, תמיד להגן על כלי השיטמהאור. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של נוגדן שכותרת הקרינה אנטי העכבר IgG (בדילול 2 מיקרוגרם / מיליליטר PBS-T עם סרום 10%). שים את זה על הנדנדה הצלחת עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של DAPI (בדילול 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ב PBS-T) ולהשאיר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שוב ולשמור אותם בPBS-T. תאים מוכנים להצטלם ויכולים להישמר לתקופה של עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס. שים לב שאות ה- GFP מתעמעמת עם זמן, כך אין זה ראוי להשוות את עוצמת ה- GFP של תאים קבועים וחיים או של תאים קבועים בזמנים שונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li><li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li><li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice.">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול הבידול העצבי monolayer כבר בשימוש במשך יותר מעשור 6. הפרוטוקול הוא יעיל ביותר, מורכב מבינוני מוגדרים, ונעשה במערכת monolayer מה שהופך את המערכת מתאימה יותר לפרה-קליני (למשל, הקרנת סמים) משתמשת. עם זאת, ישנם כמה גורמים קריטיים הקובעים את יעילות בידול. מאמר זה מצביע על גורמים אלה והפתרון לכל מכשול. צפיפות של התאים לאחר ציפוי במצב הבידול היא אולי הגורם הקריטי ביותר. ציפוי התאים בצפיפות גבוהה מדי מפחית את יעילות בידול, ואילו ציפוי בצפיפות נמוכה מדי גורם למוות של תאים. תופעה זו היא כנראה עקב איתות גורם גדילת autocrine. Fgf4 הוא גורם גדילת autocrine שמפעיל את מפל MAPK ומניע את בידול ESC 11. LIF הוא ציטוקינים אחר המיוצרים על ידי ESC. היא מפעילה את מסלול STAT3 ומקדמת התחדשות עצמית &lt;sup&gt; 15. פרוטוקול זה עושה שימוש בN2B27 כדי להפוך לתאים עצביים. N2B27 מכיל גורמים שונים המאפשרים הישרדות ESC ומקדם צמיחת תאים עצבית, ואינו מכיל או LIF או BMP4 אשר מעכב בידול עצבי 6. בצפיפות הנכונה, איזון מתאים של איתות Fgf4 וLIF נשמר המאפשר ESC כדי להבדיל. בצפיפות גבוהה, כמות עודפת של LIF autocrine ובידול לעכב BMP. לעומת זאת, התאים בצפיפות נמוכה מדי לקויים הישרדות בתקשורת די מינימאלית אלה. לכן, כאשר מספר גדול של תאים ללא הבחנה מופיע מספר הציפוי צריך להיות מופחת, ואילו נדרש גידול של מספר תאי ציפוי אם המוות של תאים משמעותיים הוא ציין. בנוסף למספר התאים שיש כמה גורמים אחרים שמשפיעים בעקיפין צפיפות ציפוי. הגורם הראשון הוא ריכוז התא המקומי, תלוי בטכניקה המשמשת להפצה באופן שווה על פני התאיםאזור. מצאנו שמתערבלים גם הוא לא אידיאלי, שכן הוא מתרכז תאים למרכז היטב והופך את הצפיפות במרכז הגבוה מדי, ואילו בפריפרית הצפיפות נמוכה מדי. טכניקות אחרות ערבוב, למשל, ערבוב התקשורת עם התאים לפני ציפוי, או נדנדה מצד לצד הצלחת מומלצות. יתר על כן, כאשר כלי ממוקם בחממה, חימום לא אחיד של המדיום גורם כוח הסעה שמושך את התאים למרכז גם, וכתוצאה מכך חלוקת התאים בדפוס צלצול קונצנטריים. תקשורת נפח נמוך ביום הציפוי מומלץ להפחית את האפקט הזה. עוזב את הצלחת מחוץ לחממה למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף, כמו גם מתחמם הבינוני לפני הערבוב יכול גם לסייע בהשגת צפיפות ציפוי הומוגנית. שנית, סוג הכלי משפיע גם על ציפוי צפיפות. איור 1 ניתן לראות בבירור כי מספר התאים / גם לא יכול להיות באופן ליניארי SCAהוביל לשטח הפנים של כלי שונים (במילים אחרות, אותו מספר תאים / שטח פנים לא יכול להיות מיושם על כל סוגי כלי). כלי קטן יותר (עם יחס גדול יותר נפח / אזור) מושפע יותר על ידי מתח פן התקשורת שהופך את משטח קעור של מדיום, המניסקוס שנקרא. מתח הפנים דוחף את התאים לקצה של הבאר ופוחת צפיפות במרכז. בנוסף, מאז מדיה נפח בכלי הקטן הוא נמוך, התקשורת להתחמם מהר, צמצום כוח ההסעה. לכן, התאים בספינה קטנה יעברו לקצה על ידי השפעת המניסקוס, ולא לעבור למרכז על ידי כוחות הסעה. לפיכך, קטן הכלי, גבוה יותר צפיפות הציפוי הנדרשת כדי לקבל את הצפיפות האופטימלית במרכז. שלישית, המצב של התאים לפני הציפוי גם בעקיפין משפיע צפיפות ציפוי ויעילות בידול. מצאנו וריאציה של הצפיפות האופטימלית בכמה ניסויים. הניסויים עםשיעור תמותה גבוהה יותר ביום הראשון דרוש צפיפות גבוהה יותר לבידול יעיל. תרבויות ESC בסרום וLIF מורכבות מאוכלוסייה הטרוגנית של תאי pluripotent נאיביים, תאי pluripotent דרוכים, ואפילו מספר קטן של תאים מובחנים 16. יש תאים מסוגים אלה יכולת שונה כדי לשרוד ולהבדיל בתנאי בידול. מאז הפרוטוקול מכתיב במספר, אבל לא המדינה של התאים, כמה ניסויים עלולים להתחיל עם תאים מובחנים יותר שימותו בימים הראשונים, שהוביל לצפיפות נמוכה מהצפוי. כדי להימנע מוריאציה זו, תרבות של ESC עקבי נדרשת לוודא כי השיעור הקבוע בין כל מדינה נשמר. מלבד צפיפות, עיתוי הוא גורם נוסף כדי להשיג בידול יעיל. בפרסום זה, אנו מתארים את הדור של אבות עצביים בתוך 6 ימים. עם זאת, הזמן יכול להיות שונה בהתאם למצב שלתרבות ESC מתחילה. כפי שתואר לעיל, תרבויות ESC הן אוכלוסיות מעורבות שיכול להגיב באופן שונה למצב הבידול. לא רק הישרדות התא, אלא גם את העיתוי של בידול תושפע הרכב התרבות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רוב למשל תנאי תרבות ESC, בתקשורת N2B27 מכילה LIF וBMP4, או 2i וLIF. עם זאת, אם יש תאים נאיביים יותר בתרבות, תקופה ארוכה יותר עשויה להידרש לבידול יעיל. זאת, משום שתאים נאיביים יצטרכו יותר זמן כדי לעבור למצב דרוך ולאחר מכן להבדיל לאבות עצביים.

תאי גזע עובריים הם תאי pluripotent נגזרו מהעובר המוקדם עם היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה תוך השמירה על היכולת להתמיין לכל סוגי התאים בוגרים הבאים השבה לעובר בשלב מתאים (על ידי יצירת חזיון תעתועים), הזרקה למארחי syngeneic או מדוכאי חיסון (על ידי יצירת תפלצת) או בנושא המבחנה 1 רמזים מתאימים. הבידול במבחנה של תאי גזע העובריים של עכבר לשושלות עצביות תואר לראשונה בשנת 1995 ומעורב ההיווצרות של אגרגטים השעיה תאיים (גופי embryoid, EBS) בתקשורת סרום המכיל תוספת החומצה רטינואית מורפוגן 2-4. מאז מגוון רחב של פרוטוקולים פותחו כדי לאפשר בידול עצבי 5. רב עדיין לנצל צבירה, אחרים תרבות משותפים עם גרימת סוגי תאים וכמה כרוכים בשימוש בסרום ללא מדיה. כל הפרוטוקולים יתרונותND חסרונות ואת האופי המדויק של עצבי או תאים עצביים המיוצרים גם משתנים בהתאם לפרוטוקול בשימוש. הפרוטוקול האידיאלי יהיה חזק, ניתן להרחבה ולעשות שימוש באמצעי תקשורת ומצעים מוגדרים באופן מלא, להיות נוח לניטור לא פולשני של תהליך הבידול ולגרום לדור של אוכלוסיות טהורות של אבות עצביים יכול להיות בדוגמת ידי רמזים חיצוניים ולהבדיל לכל תת עצבי וגליה עם יעילות גבוהה ותשואה בזמן קצר יחסית. בעשרות השנים האחרונות שכבר משתמשים בשיטה ליצירת אבות עצביים ותאי עצב מהעכבר ESC בצפיפות נמוכה, תרבות monolayer חסיד סרום ללא 6-10. פרוטוקול זה ממלא רב של הקריטריונים המפורטים לעיל: בידיים שלנו את היעילות של בידול כבר די עקבית לאורך שנים רבות ומגוון של שורות תאים, וניתן לשנות אותו או למטה (אנו משתמשים בהצלחה כלי מ96-גם צלחות ל די קוטר 15 סנטימטריםshes) והתקשורת משמשת הם מוגדר היטב. התהליך ניתנים למיקרוסקופיה בהילוך איטי לניטור של הבידול ומגוון של רמזי דפוסים ניתן להוסיף כדי לגרום לדור של סוגים שונים של תת עצביים (למשל, ששש וFgf8 לנוירונים דופאמין 6). עם זאת, יש כמה אתגרים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. אחד ההיבטים המרכזיים הוא הכנה קפדנית של התקשורת. אנחנו תמיד להכין את התקשורת בבית למרות זמינותן של חלופות מסחריות. יש שינויים על תקן גרסאות זמינות מסחרי, אחד התוספים המשמשים (ראה פרוטוקול N2). לבסוף, אחד הצעדים החשובים ביותר ליישום מוצלח של שיטה זו היא צפיפות התאים האופטימלית בציפוי. זה בעיקר בגלל זמן שטבע autocrine של אחד מאותות התרמה (Fgf4 11) דורש כי תאים מספיקים נוכחים כדי לאפשר viabil האופטימליity ובידול, בבידול צפיפויות גבוהות מדי הנו פגום (אולי בחלק בשל ייצור autocrine של 12 LIF). לכן חשוב שהכנת שתי התקשורת וציפוי תא מבוצעות בזהירות ובעקביות כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, serum free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Reconstitute with sterile 0.01M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Reconstitute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin fraction V</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukaemia inhibitory factor</td>
			<td colspan="3">prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

היכולת להבחין בתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) לאבות עצביים מאפשרת המחקר של מנגנוני שליטה מפרט עצבי, כמו גם את הדור של סוגי תאים עצביים בוגרים למחקר נוסף. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבידול של ESC לאבות עצביים באמצעות, תרבות monolayer סרום ללא. השיטה היא מדרגי, יעילה וגורמת לייצור של תאים עצביים ~ 70% בתוך 4-6 ימים. זה יכול להיות מיושם על ESC מזנים שונים גדלו תחת מגוון רחב של תנאים. יכולים להיות מותר אבות עצביים להבחין נוספת לנוירונים וגליה או ניתח תפקודיים על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה או מולקולרי טכניקות. תהליך ההתמיינות ניתנים למיקרוסקופיה זמן לשגות ויכול להיות משולב עם השימוש בקווי כתב כדי לפקח על תהליך המפרט העצבי. אנו מספקים הוראות מפורטות על הכנת תקשורת וצפיפות תאי אופטימיזציה כדי לאפשר את התהליך לbהדואר חל על רוב קווי ESC ומגוון כלי תרבית תאים.

בניסוי זה, השתמשנו בקו תא 46C 14, תאי גזע עובריים של עכבר עם כתב Sox1-GFP אנדוגני, כדי לעקוב אחר בידול עצבי. באמצעות קו זה תא, ביטוי של Sox1, סמן עצבי, יכול להיות מזוהה על ידי הקרינה ירוקה. ציפוי צפיפות מהווה גורם קריטי להשגת בידול עצבי. תאי גזע עוברי של עכבר היו מצופים בצלחת 6-גם בצפיפויות שונות משתנות מ10,500 ל88,500 תאים / 2 סנטימטר. איור 1 א מציג את יעילות בידול מושגת על ידי צפיפות ציפוי שונה בצלחת 6 היטב. ביום 6 של בידול, תאים היו קבועים paraformaldehyde 4% ומוכתמים לβIII טובולין הסמן העצבי. בצפיפות האופטימלית (10,500 תאים / 2 סנטימטר), תאים מובחנים לאבות והנוירונים עצביים. זו נצפתה על ידי אות ניאון ירוקה מכתב Sox1-GFP וimmunofluorescent נגד הסמן העצבי, βIII טובולין. Loצפיפות ציפוי wer הובילה למוות של תאים בתוך 3 ימים. עם זאת, ציפוי בצפיפות גבוהה מדי (&gt; 36,500 תאים / 2 סנטימטר) הביאו בפרופורציה ירידה בתאים ירוקים ותאים חיוביים βIII טובולין. איור 1 מציג ניסוי שבוצע בצלחת 96-היטב שנדרשה על פי 10 צפיפות תאים גבוהה יותר ל להגיע האופטימלי (155,000 תאים / 2 סנטימטר) ומחוברות מדי (362500 תאים / 2 סנטימטר) רמה. צפיפות אופטימלית יכולה להיות שונה בין הכנות תקשורת, רכיב תקשורת וקבוצות תא, סוגי תאים, או תנאי תרבות קודמים. מומלץ לבצע אופטימיזציה של צפיפות ציפוי עבור כל ניסוי. טבלת 1 מספקת טווחים של צפיפות ציפוי יעילה בפלטפורמות שונות שיש לכלול בשלב אופטימיזציה. בטווח זה, זה צריך להיות אפשרי כדי לקבל צפיפות שנותנת יעילות בידול טובה בתוך 4-6 ימים. במהלך E הבידולSC לשנות בהדרגה המורפולוגיה שלהם. איור 2 מראה תא ומורפולוגיה מושבה מיום 1 ליום 6 לאחר ציפוי בצלחת 6-גם ב10,500 תאים / 2 סנטימטר. תאים היו בתרבית בתנאי בידול וצילמו כל יום. אין זה יוצא דופן לראות מוות של תאים משמעותיים בימים הראשונים בשל שינוי קיצוני במצב התרבות. עם זאת, התאים שנותרו עדיין מסוגלים להבחין. ביום 4, תאים התחילו להיות אבות עצביים כאות ניאון ירוקה מכתב Sox1-GFP הופיעו קודם. עם זאת, גם ביום 6, לא כל התאים Sox1-חיובי. קיומם של כמה תאים לא עצביים צפוי, בכל זאת, בתנאים הנכונים, רוב התאים יהיה עצביים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52823/52823fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. ההשפעה של צפיפות ציפוי על יעילות בידול. שני שונים<html> צפיפות של תאי Sox1-GFP כתב (46C) היו מצופה ומובחנת על פי הפרוטוקול במשך 6 ימים. בידול () בצלחת 6 היטב. בידול (ב &#39;) בצלחת 96-היטב. בר סולם:. 100 מיקרומטר <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52823/52823fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52823/52823fig2highres.jpg" width="450" /> איור 2. מורפולוגיות תא בתהליך הבידול. 46C ESC הובדלו ב10,500 תאים לכל 2 סנטימטר בצלחת תרבות 6 היטב וצילמו יומי לצפות לשינויים במורפולוגיה תא. בר סולם:. 300 מיקרומטר <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52823/52823fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpa</html style=";text-align:right;direction:rtl">dding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> פלטפורמה </td><td> טווח של צפיפות אפקטיבית (תאים / 2 סנטימטר) </td><td> טווח של מספר תא לצלחת </td><td> הצעתי ראשוני נפח תקשורת (μl) </td><td> הצעתי תקשורת נפח לאחר יום 1 (μl) </td></tr><tr><td> 6-גם צלחת </td><td> 10,500 - 36,500 </td><td> 99750 - 346750 </td><td> 1,000 </td><td> 2,000 </td></tr><tr><td> צלחת 24 גם </td><td> 15,600 - 46800 </td><td> 29,640 - 88920 </td><td> 500 </td><td> 1,000 </td></tr><tr><td> צלחת 96-היטב </td><td> 103500 - 260,000 </td><td> 33120 - 83200 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מוצעת ציפוי צפיפויות וכרכי תקשורת לגדלים שונים כלי. צפיפות הציפוי בטבלה זו נקבעה באמצעות שורת תאי 46C. לקבלת תוצאות אופטימליות צפיפות הציפוי של כל שורת פרט עשויה להיות adjusted.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture at JoVE.com

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K Views.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Video: Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.