We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. רקמות קציר והקפאת רקמות שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם מנת יתר של isoflurane (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן). לבצע שלב זה במנדף ולהשתמש בשיטת בלימה משנית כגון ייבוש או צנצנת פעמון המכילה מקלון צמר גפן הטבול בisoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר מוות על ידי תקיפות לוחצים שודד דרכים. להשתמש בשיטה משנית של המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% כדי לצמצם את דבק של קווצות שיער רופפות על השרירים. לקלף את העור מהאיבר באמצעות מלקחיים עדינים כגון מס &#39;5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את השריר של עניין (tibialis קדמי (ת&quot;א) במקרה זה) מהעצמות מתחת, החל מהגיד ולהסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו השריר, לכסות אותו באוקטובר (מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך), ולהניח אותה שטוח על תבנית הקפאה חד פעמית שכותרת. ודא שהשרירים הוא בה נטייה פיזיולוגית נורמלית (ועד ראש טאייב) ללא מתיחה. לחלופין, להקפיא את השריר על ריבועי קלקר קטנים ולהצמיד אותו באמצעות סיכות חרקים כדי להבטיח את האורך הנכון של השרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל 2-methylbutane (איזופנטאן) בכוס פלדה באמצעות חנקן נוזלי. זה לוקח על 3 ממוצעת - 5 דקות. שמור ערבוב לסירוגין עד משקעים לבנים מתחילים טופס בתחתית והקירות של הכוס. הערה: כאשר זה קורה, הגיע איזופנטאן טמפרטורת הקפאה אופטימלית (-150 ° C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את התבניות המכילות שרירים ב2-methylbutane המצונן. להקפיא את השרירים קטנים כגון longus digitorum הסרעפת והפושטים (אדי) במשך 6 - 12 שניות ושרירים גדולים יותר כמו soleus הגסטרוקנמיוס (GS) והיד אחורית במשך 15 - 20 שניות. אין להקפיא את השרירים במשך זמן רב מדי שכן הדבר עלול להוביל לפיצוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמות הקפואות בקרח יבש וללתת להתאדות איזופנטאן (שים לב שתהליך זה לוקח בממוצע כ -15 - 20 דקות). לעטוף את הרקמות ברדיד אלומיניום ולאחסן אותם בuטמפרטורת ltra נמוכה (C -70 ° C עד -80 °) עד חתך. </li></ol> 2. Embedding הרקמות ב אוקטובר להכין בלוק רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תחבורה על קרח יבש לcyrostat כדי למנוע הפשרה. העברת רקמות לcryostat קאמרית (שנקבע ב -20 ל-24 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הפשרה מלאה של רקמות) ולתת להם לאזן במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מפרץ פלטייה קירור ב. אם cryostat אין קירור זה, להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות OCT. אל תתנו להפשרת שרירים בכל נקודה במהלך ההטבעה כמו זה יכול לגרום לנזק הקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שכבה דקה אחידה של אוקטובר בדיסק הדגימה ולתת לו מגניב. כאשר רוב OCT קפוא בתחתית ועדיין נוזליים על גבי, הכנס את הרקמה בכיוון הנכון (בניצב לאוקטובר לסעיפים ומקביל רוחביים לאוקטובר לסעיפים אורך). להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות אוקטובר לגעת בחלק unembeded של הרקמות עם שלוחה חוםractor ולחכות 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד שכבה דקה של אוקטובר סביב השריר, לרסס עם תרסיס קירור תרסיסים ולחלץ את החום כמו בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על הוספת אוקטובר במרווחים קטנים ובמהירות להקפיא ב- OCT באמצעות שילוב של תרסיס ספריי קירור וחולץ חום עד שכל השריר מכוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חולץ החום בחלק העליון של בלוק הרקמה ולחכות 5 דקות. </li></ol> 3. הכנת סעיפים וזיהוי הסעיפים מאזור אמצע בטן של השרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הדגימה על ראש הדגימה. הדק את הידית כדי לאבטח את הדיסק. ודא שהדיסק הדגימה הוא במגע טוב עם ראש הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את טמפרטורת החדר לבין -21 ו-24 מעלות צלזיוס ולחכות עד שטמפרטורת הסט מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות העובי (7 מיקרומטר); חתוך את הבלוק על ידי קידום או חוזרים בי לחסום באמצעות הגדרות גסות ועדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את החלקיםבטרום חימם שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובי על ידי לחיצה על גבי השקופית על הסעיפים, באמצעות המשיכה בין מטענים המנוגדים כדי להקל על הדבקות של החלקים לחתוך לשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את החלקים באמצע הבטן-ידי מדידת שטח חתך (CSA) של החלקים. האם תוכנת הדמיה באמצעות זה במחשב שמחובר למיקרוסקופ. הערה: תמונות בניגוד השלב נלקחות והיקף של כל השריר נמדד באמצעות פונקצית מעקב על התוכנה. זו תניב שני CSA כמו גם קוטר חמוס מינימום (מדד לגודל חתך סיבים שמתבטא במרחק הקטן ביותר בין שני משיקים מקבילים בצדדים מנוגדים של חלקיק) מדידות. הערה: כאשר מדידות CSA וקוטר חמוס מינימום מתחילות רמה, כבר הגיעה באמצע הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאי וארכיון השקופיות ב -80 ° C לצביעת עתיד. הערה: Oct לא צריך להסיר לפני staininנהלי g. ברגע שקופיות coverslipped, הם מוכנים להיות מוכתמים באופן מיידי. </li></ol> 4. מכתים הערה: בעוד שניתן למצוא נהלי צעד-אחר-צעד מפורטים בגיליון הנתונים של המוצר וצריך להיות בעקבות הליכים מכתים, ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה אישי להשיג צביעה אופטימלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגלל ההרכבה תקשורת (ראה טבלה) היא לא בליל עם מים, מייבשים שקופיות באמצעות ציונים גוברים של אלכוהול (2 דקות כל אחד ב -70%, 95%, ו 100% אתנול) ולנקות אותם עם קסילן (5 דקות) 100% על מנת להבטיח מגלשות לא להיות אטומות לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip סעיפים ולתת להם להתייבש. תמונה עם מיקרוסקופ מצויד בתוכנת הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies.">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li><li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica.">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li><li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscular+dystrophy.+I.+History,+clinical+status,+muscle+strength,+and+biopsy+findings.">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li><li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy.">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li><li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine.">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li><li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles.">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779 (2012).</li><li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy.">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li><li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice,+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A.">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li><li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy.">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14 (2014).</li><li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis:+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A.">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li><li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy.">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation.">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li><li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections.">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+'gold+standard'+for+immunohistochemistry.">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li><li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia.">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה שימשו ככלים מרכזיים בהבנת הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה בהפרעות עצבית-שרירית שונות. קלסי, ביופסיות שריר היו קבועות ראשונה בפורמלין ולאחר מכן משובצות בשעוות פרפין. בעוד קיבעון פורמלדהיד שומר ארכיטקטורת רקמה ומאפשר אחסון והובלת רקמה ב RT, זה גם מנטרל אנזימים וחלבונים crosslinks המחייב צעדים נוספים להשגת immunostaining מדויק. בעיה זו בוטלה עם השימוש בחלקים קפואים אך שיטה זו מציבה אתגרים טכניים ייחודיים בהשגת תוצאות אופטימליות מכתימה ו14,15 פרשנות מדויק. ראשית, זה חיוני כי דגימות יוקפאו מייד לאחר כריתה כירורגית כautolysis ופירוק מתחילים מייד לאחר ההסרה מהגוף. רקמות גם חייבת להיות קפוא במהירות וביסודיות לכמות הנכונה של זמן המשתנה בהתאם לגודל/ עובי של הרקמה. אם זה לא נעשה בצורה נכונה, להקפיא נזק יתרחש עיבוד הרקמות חסרות תועלת להערכה היסטולוגית. בעקבות הקפאה, רקמות חייבים להיות מאוחסנות באופן מיידי על קרח יבש ולאחר מכן הועברו לטמפרטורה נמוכה במיוחד (-80 ° C) מקפיא עד חתך. חשוב לציין כי רקמות לא צריכים להסיר מהמקפיא מבלי להיות על קרח יבש, כי הקפאה, הפשרה גם לפגוע במבנה רקמה. עוד הערה חשובה בעת ביצוע ניתוח היסטולוגית היא לטפל תמיד לנתח את אותו חלק מהרקמות של עניין כדי להבטיח אחידות בין ניתוח. ניתן לעשות זאת על ידי ביצוע חתכי שריר ניתוח midbelly. זהו החלק של השריר כי הוא עבה ולכן יהיה לי אזור החתך הגדול ביותר. על מנת להבטיח כי אתה אכן חתך midbelly, CSA הסעיפים הבאים יש למדוד באמצעות תוכנת הדמיה היסטולוגית. Measuremמציג צריך להמשיך להתבצע עד אזור החתך מתחיל רמה. ברגע שזה קורה, כבר הגיעה לאמצע הבטן; רק חלק זה של הרקמה צריך לשמש לניתוח היסטולוגית כדי להבטיח אחידות בין השוואות. לאחר חתך הושלם ושקופיות שהוכנו, הם צריכים להיות מותר לייבוש על RT עבור 1 - 2 שעות. ייבוש מאפשר לדבקות ראויה של הסעיף לשקופית וגם מונע את עודפי מים להתגבש בעקבות העברה למקפיא -80 מעלות צלזיוס. חשוב לציין כי שקופיות צריכים גם להיות מטופלות רק על קרח יבש בעת בחירת שקופיות לניתוח כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים. ברגע שקופיות שנבחרו לצביעה, פרוטוקולים כלולים עם הכתם צריך להיות ראשון ואחרי על בסיס ניסיון עד תוצאות אופטימליות הושגו. בעת ביצוע immunostaining, חשוב לעשות שקופיות בטוחים לא להתייבש לאורך כל ההליך. ייבוש של שקופיות יכול לגרום לאינטראקציה חולפתשל להישאר ללא פגע הבא דגירה. אינטראקציות אלה לא ניתן להסיר במהלך שוטף ולגרום לכתמים ספציפיים. ניתן להימנע מייבוש על ידי שמירה על שקופיות באווירת humidified. ביצוע incubations עם קטעים מכוסים parafilm ושקופיות על מגבת נייר לחה אטומה בקופסא שקופיות קטנה מספיק כדי להבטיח שקופיות לא יבשות בכל נקודה במהלך ההליך. היסטולוגיה היא כלי חיוני בהדמית מורפולוגיה והיבטים שונים של פתולוגיה. בעוד טריוויאלי קצת, זה הוא בעל החשיבות הגדולה ביותר לטפל גדול בהכנת רקמות לשמש להיסטולוגיה. מכריתה להקפאה, חתך וצביעה, יש לטפל ברקמות באופן שימנע נזק הקפאה ויניב התמונות מדויקות ביותר אפשריות. ללא שימור נכון, מכתים לא משקף במדויק פיזיולוגיה ולכן להוביל לפרשנות שגויה.

בדיקה של היסטולוגיה השריר משחקת תפקיד קריטי בהבנת סוגים שונים של הפרעות עצבית-שרירית של 1-4. בשילוב עם טכניקות אחרות, זה מאפשר לחוקרים לקבל מושג טוב יותר של הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה וגם יכולים להיות חיוני כדי להעריך את היעילות של התערבות טיפולית 5-10. עם זאת, כדי להיות מדויק, הרקמות צריכה להישמר בצורה הנכונה על מנת לשמר את המצב הפיזיולוגי מייד לפני הכריתה. זה דורש זהירות רבה במהלך ההסרה, שימור, חתך, וצביעה. ניתן להכין רקמות בשתי דרכים שונות למחקר מיקרוסקופי אור. השיטה, פרפין פורמלין הקבוע הראשון משובץ קטעים (FFPE), דורש רקמות להיות קבועים בפורמלין שנאגרו טבעי 10% לפני שמוטבעים בשעוות פרפין 11,12. צעד הקיבעון עוזר לשמר מורפולוגיה טובה יותר, אבל יחסי ציבור אנדוגני קישורים גם צולביםoteins לפיכך מחייב נהלים אחזור אנטיגן המורכב עבור immunostaining ומבטל את האפשרות של מכתים האנזימטית בסעיפים כגון 12. חלקים קפואים, לעומת זאת, לא צריכים להיות מראש קבועים או מעובד; לכן, חלבונים יכולים לשמור תצורות ביולוגיות יליד 13,14. יתר על כן, חלקים קפואים גם לאפשר לזמן אספקה ​​מהיר, שלעתים יש צורך, למשל באבחון תוך הניתוחי של סרקומות וביופסיות כירורגיות אחרות 15. עם זאת, אם לא נעשה כראוי, בשיטה זו היא נוטה להקפיא נזק, אשר מציג שינויים בארכיטקטורת שרירים מה שהופכים את החלקים שאינם ראויים לבדיקה היסטולוגית. מאמר זה מתאר את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר על מנת להשיג צביעה אופטימלית לבדיקה נאותה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica CM 1850&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 
			Richard Allen Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 50i&#160;</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Olympus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Nikon Imaging Software Basic Research</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. 
			Phone: +1-631-547-8500 
			Image J, Metamorph</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>14043-220-05</td>
			<td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td>
			<td>JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>4583</td>
			<td>Sakura Inc.</td>
			<td>Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA 
			Leica Microsystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze It</td>
			<td>23-022524</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable tissue mold</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorfrost plus slides</td>
			<td>9991001</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>650501-4L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>HC-1300-1GL</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methyl butane</td>
			<td>M 32631-SL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HC-7001GA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 280</td>
			<td>8311-4</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Gill #3</td>
			<td>CS402-1D</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 
			VWR Scientific</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

הערכה היסטולוגית של ביופסיות שריר שימשה ככלי הכרחי בהבנה של ההתפתחות וההתקדמות של הפתולוגיה של הפרעות עצבית-שרירית. עם זאת, על מנת לעשות זאת, טיפול נכון צריך לקחת כאשר מוציא ושימור רקמות להשיג צביעה אופטימלית. אחת שיטות לשימור רקמות כרוכה תיקון רקמות בפורמלין ולאחר מכן הטבעתם בשעוות פרפין. שיטה זו שומרת מורפולוגיה היטב ומאפשרת לאחסון לטווח ארוך ב RT, אבל הוא מסורבל ודורשת טיפול בכימיקלים רעילים. יתר על כן, תוצאות קיבעון פורמלדהיד בקישור צולב אנטיגן, אשר מחייב פרוטוקולים אחזור אנטיגן לimmunostaining היעיל. להיפך, חתך קפוא אינו דורש קיבוע ובכך שומר על קונפורמציה אנטיגן ביולוגית. שיטה זו גם מספקת יתרון בולט בסיבוב מהיר סביב זמן, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד במצבי צורך הערכה היסטולוגית מהירה כמו intraoperative ביופסיות כירורגיות. כאן אנו מתארים את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר להדמיה עם כתמים היסטולוגית וחיסוניים שונים.

ההגדרה לקציר והקפאת רקמות שניתן לראות באיור 1. רקמות נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS להימנע (איור 1 א) ייבוש. כאשר רקמות נבחרו לשמש לניתוח היסטולוגית הם צריכים להיות טבולים בOCT ומונחים על תבנית cryo בכיוון הנכון וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר כדי להבטיח מורפולוגיה מדויקת (איור 1). תרחיף של איזופנטאן המתאים להקפאה רקמה יכול להיות מושגת על ידי קירור איזופנטאן בחנקן נוזלי וערבוב עד משקעים לבנים קטנים יופיעו בתחתית. בשלב זה, התקשורת מתאימה להקפאה (איור 1 ג). יש להקפיא רקמות 6-15 שניות באיזופנטאן המצונן בהתאם לגודל / העובי של הרקמה (1D איור). בעקבות הקפאה, השרירים יופיעו לבנים של גיר ובשלב זה צריך להיות מאוחסן בקרח יבש ולאחר מכן הועברו ל-80 &lt;&gt; מקפיא מעלות צלזיוס חזק. הגדרת cryostat ומרכיבים הנדרשים להכנת בלוק השריר על ידי הטבעת הרקמה ב אוקטובר בהדרגה מוצגות באיור 2. יש להגדיר cryostat בין -20 ו-24 מעלות צלזיוס (איור 2 א). OCT והקפאה-זה צריך להיות זמין כדי ליצור בלוק מתאים לחתך. בתוך cryostat צריכים מברשות קטנות כדי לתפעל ולשטח סעיפי קיצוץ לשקופית עושה כמו גם פינצטה לטיפול בגוש הרקמה כי זה לא צריך להיות נגע עם ידיים על מנת להבטיח את הרקמה נשאר קפואים (איור 2). יש להוסיף באוקטובר וה רקמות כדי ליצור בלוק חתך אבל יש להקפיא מייד עם הקפאה-זה לרסס ואז התקרר עוד יותר עם ​​חום חולץ בתמונה כאן (איור 2 ג). לסעיפים רוחביים, רקמה צריכה להיות ממוקמת בראש הדגימה כך שהוא בכיוון מאונך ללהב (איור 2 ד). Seצריך להיות מותאם ttings להשיג עובי חלק הרצוי (5-10 מיקרומטר בהתאם לרקמות). אם קפוא בצורה נכונה את פני הרקמה צריכה להיות גיר לבן ואילו רקמות שהוקפאה בצורה לא נכונה או מופשר בתהליך ההרכבה תופיע אדום / ורוד. איור 3 מראה רקמות נציג לדגימות טיפלו בצורה לא נכונה (איור 3 א) ודגימות מטופלות כראוי (איור 3) . אזור בטן אמצע נקבע על ידי מדידת CSA וקוטר חמוס מינימום באמצעות מיקרוסקופ מצויד באופטיקה בניגוד שלב ותוכנת ניתוח תמונה. מסך נציג של תוכנת ניתוח מוצג באיור 4. Hematoxylin ו eosin תמונות צבעוניות של ביופסיה קפוא כראוי ומחולקת יחד עם ביופסיה פגומה הקפאה של tibialis קדמי שרירים (ת&quot;א) מוצגים באיור 5. סעיפים שמעובדים כראוי יצטרך morpholo העקביGY ואפילו מכתימים לאורך (איור 5 א). שלא כדין מעובד שרירים שניזוקו או הקפאה בטרם עת מופשר תופיע לי הפסקות מרובות במורפולוגיה ויש את המראה של &quot;חיטה גרוסה&quot; (איור 5). איור 6 מציג תא humidified לimmunostaining האופטימלי. שקופיות צריכה להיות מכוסות בparafilm, המשיכו על מגבת נייר רטובה, ואטומות בקופסא קטנה, כדי למנוע התייבשות של חלקים במהלך immunostaining. איור 7 מציג מדגם שקופיות אימונוהיסטוכימיה שהוכנה כראוי ומוכתמת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig1highres.jpg" width="500" /> רקמות איור 1. הכנה ולהגדיר להקפאה רקמה תקינה. (א) נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS. (ב) רקמות selectedfor היסטולוגיתניתוח טבול בOCT ומונח על תבנית cryo בכיוון הנכון (מהבטן לגיד) וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר. Slurry (C) של איזופנטאן המתאים לרקמות. הערה: משקעים לבנים קטנים יופיעו בתחתית. רקמה קפואה לאחר הטבילה באיזופנטאן (ד &#39;). הערה:. הופעת גיר לבנה <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הגדרות cryostat ומרכיבים דרושים לחתך. () Cryostat להגדיר בין -20 ו-24 מעלות צלזיוס עם ספריי קירור OCT ותרסיס זמינים. (ב) בתוך ההגדרה של cryostat להשלים עם מברשות קטנות כדי לתפעל ולשטח secti לחתוךתוספות לשקופית עושה, כמו גם לטיפול בפינצטה של ​​גוש רקמה. (ג) בלוק רקמה קפוא מוכן להיות מקורר עם חולץ חום (חץ לבן). בלוק רקמות (ד) נקבע בהרכבת הראש מוכן לחתוך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. רקמות נציג של שרירים השתמרו בצורה נכונה ולא נכון. () כיאות קפוא או טיפל (ב) כראוי קפוא וטיפלו שריר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt= Src &quot;איור 4&quot; = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,793 / 52793fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; קביעת איור 4. של אזור חתך רוחב של שריר ת&quot;א באמצעות תוכנת הדמיה ניקון. צילום המסך של תמונה לעומת שלב סעיף שרירים שכבר הקיפה באמצעות לדמיין תוכנה למדידת CSA וקוטר חמוס דקות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig5highres.jpg" width="700" /> איור 5. נציגי תמונות של שרירי H &amp; E מוכתמות הוכנו כראוי ושלא כדין. () כראוי מעובד סעיף. סעיף שריר הקפאה פגומה מעובד כיאות (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig5highres.jpg" target="_blank">אנא CLI</a>CK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig6highres.jpg" width="600" /> איור 6. תא humidified המתאים לimmunostaining. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig7highres.jpg" width="350" /> שקופית אימונוהיסטוכימיה 7. דוגמא איור של שקופיות. שקופיות מוכנות כראוי ומוכתמות כבר מוכתמת בפיברונקטין (ירוק) ו DAPI (כחול). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52793/52793fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis at JoVE.com

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

31.7K Views.  Boston University. Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Video: Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

מיו מכני ניתוח בשרירי השלד מבודדת

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Assay המבוסס תא זרימת cytometry תפוקה גבוהה לזיהוי נוגדנים לN-מתיל-D-aspartate קולטן דופמין או-2 קולטן בסרום אדם

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

הערכת אולטראסאונד מבוססת של עורקים הכליליים זרימה והזרימה כלילית ריזרב שימוש בדגם עומס יתר הלחץ בעכברים

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

בן אנוש<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; ביופסיה בשרירי השלד שימוש וייל-בלייסלי Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world. Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and calcification, develop in the coronary arteries, aortic valve, aorta, and peripheral conduit arteries and are the hallmark of cardiovascular disease. In humans, imaging with computed tomography allows for the quantification of vascular calcification; the presence of vascular calcification is a strong predictor of future cardiovascular events. Development of novel therapies in cardiovascular disease relies critically on improving our understanding of the underlying molecular mechanisms of atherosclerosis. Advancing our knowledge of atherosclerotic mechanisms relies on murine and cell-based models. Here, a method for imaging aortic calcification and macrophage infiltration using two spectrally distinct near-infrared fluorescent imaging probes is detailed. Near-infrared fluorescent imaging allows for the ex vivo quantification of calcification and macrophage accumulation in the entire aorta and can be used to further our understanding of the mechanistic relationship between inflammation and calcification in atherosclerosis. Additionally, a method for isolating and culturing animal aortic vascular smooth muscle cells and a protocol for inducing calcification in cultured smooth muscle cells from either murine aortas or from human coronary arteries is described. This in vitro method of modeling vascular calcification can be used to identify and characterize the signaling pathways likely important for the development of vascular disease, in the hopes of discovering novel targets for therapy.

Vascular calcification is an important predictor of and contributor to human cardiovascular disease. This protocol describes methods for inducing calcification of cultured primary vascular smooth muscle cells and for quantifying calcification and macrophage burden in animal aortas using near-infrared fluorescence imaging.

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

דיסקציה של הלבלב העכבר עבור ניתוח היסטולוגית והגדרת פרופיל מטבולי

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...