Special thanks to the personnel of the University of Georgia Health Center laboratory for their continuous support of our work on isolating human neutrophils. This work was supported by the start-up fund of Dr. Rada provided by UGA Office of Vice President for Research.

הדירקטוריון סקירה מוסדיים מאוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה אישרה את המחקר הסובייקט האנושי לאסוף דם היקפיים ממתנדבים בריאים (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 מתנדבים חתם על טופס הסכמה מדעת נדרש לפני לקיחת הדם. המחקר מבוצע במאמר זה תואם עם הקווים המנחים האתיים מחקר רפואי, כולל בבני אדם של הצהרת הלסינקי. 1. ניתוק של נויטרופילים מן היקפיים ודם (איור 1) הערה: ישנן מספר דרכים כדי לבודד נויטרופילים מדם היקפי. הפרוטוקול הבא מספק אפשרות אחת. פרוטוקול זה מניב כמויות גדולות של נויטרופילים אדם שאינו מופעל מסוגל לשחרר נטס על גירוי חיצוני. השתמש 40 מ&quot;ל דם מלא המתקבל מתנדבים בריאים ידי venipuncture. 7,9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot דם 20 מ&quot;ל לשני צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל. הוסף 10 מ&quot;ל 6% Dextran. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 דקות העברה לויקוציטים-ריקיםהשלב העליון h בלי לקחת שום כדוריות דם אדומות pelleted לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל נקי, למלא אותו עם PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 XG 10 דקות. Resuspend גלולה ב 4 מ&quot;ל סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שיפוע Percoll 5 שלבים של 85% -80% -75% -70% -65% בשני צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ההשעיה לויקוציטים מ&quot;ל שכבת 2 על גבי אחד שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 800 XG במשך 30 דקות עם בלמים כבויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל התאים (נויטרופילים) בשכבות על% 75% / 80 ו -70% / 75% ממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים שטפו תאים PBS (350 XG, 10 דקות, RT) ולספור תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> מדידה 2. קינטיקה של תאי DNA שחרור שימוש microplate fluorimeter הערה: שיטה זו מאפשרת מדידה של שינויים הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר מעיד על שחרור DNA על פורמט microplate 96-היטב (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן השעיה של נויטרופילים במדיום assay (HBSS +1% (v / v) עצמיים סרום + 5 גלוקוז מ&quot;מ) בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μmol / L של צבע DNA מחייבת קרום חדיר. מערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים האדם Aliquot (50 μl / טוב) על 96-היטב בתחתית שחור, שקוף microplates. ודא מדיום assay מכסה את כל תחתית הבאר. אם לא, הקש על צלחת בעדינות בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את נויטרופילים המכיל צלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין תמיסות של גירויים במחיר כפול של הריכוזי הסופי שלהם כדי לשמש (37 ° בינוני assay החם C). כביקורת חיובית נטו להשתמש נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר phorbol-myristate-אצטט (PMA) עבור 4 שעות כדי לעורר שחרור NET מקסימלי. 5,8 גירוי PMA עבור 4 שעות מבטיחה שחרור NET מקסימאלי, תוך היווצרות NET ספונטנית נשאר 5,8 נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את microplate fluorimeter לשקילה (4 שעות, 37 ° C, 530 ננומטר עירור 590 ננומטר עבור פליטה). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר נויטרופילים ידי הוספת פתרון הגירוי 50 μl 50 השעיות נויטרופילים μl. השתמש 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​saponin אחד טוב כדי למדוד אות שחרור DNA מקסימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת בקורא ולמדוד שינויים הקרינה עבור 4 שעות ב כל 2 דקות עם לא רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים, לחשב עליות מנורמלות קרינה לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרינת בסיס פחת מן ערכי נקודות קצה עבור כל הבארות כולל saponin (איור 2 א &#39;, ב&#39;). עליית קרינת saponin צריכה להיות האות הגבוהה ביותר. זה נקרא &quot;שחרור DNA המקסימאלי&quot; (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי שחרור DNA בדגימות ידועות על ידי חלוקת עליות קרינה של דגימות ידועות על ידי שחרור DNA מקסימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע תוצאות של משכפל ולהציגם כמו &quot;% של שחרור DNA המקסימאלי&quot; (איור 2 ג). </li></ol></li></ol> 3. כימות של בנטוation ידי MPO-דנ&quot;א-DNA HNE מבחני ELISA הערה: אלה מבחנים שונים (דנ&quot;א MPO) או הקים (HNE-DNA) במעבדה שלנו לכמת היווצרות NET ידי מדידת רמות של מתחמי MPO-דנ&quot;א HNE-DNA 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 96-היטב גבוהה יכולת קשירה צלחות ELISA לילה עם נוגדנים לכידת (50 μl / טוב): אנטי-MPO (דילול 1: 2,000) או אנטי-HNE (1: 2,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות לשטוף ELISA שלוש פעמים עם PBS (200 μl / טוב) ולחסום אותם עם BSA 5% ו -0.1% אלבומין בסרום אדם עבור שעה 2 ב RT (200 μl / טוב). לשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים זרע על 96 גם microplates בצפיפות של 100,000 תאים / היטב במדיום assay 100 μl, וממריץ היווצרות NET. דגירת תאים: 4 שעות עבור 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עיכול DNase מוגבל על ידי הוספת 2 U / DNase מיליליטר supernatants נויטרופילים, לערבב אותם היטב. שמור אותם ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את DNase לאחר 15 דקות על ידי הוספת 11 μl 25 מ&quot;מ EGTA (הריכוז הסופי 2.5 מ&quot;מ). לערבב היטב. אסוף supernatants צינורות microfuge נקי. דגימות ספין להיפטר פסולת התא XG ב 300 דקות 5 ב RT. העבר supernatants שלהם לתוך צינורות microfuge נקיים. ולשמור אותם על הקרח עד מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aliquot של &quot;תקן NET&quot; שהוכן קודם לכן. הערה: הסטנדרטית NET הוא שילוב של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים PMA מגורה המתקבלים לפחות 5 תורמים אנושיים שונים, עצמאיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש באותה רמה במשך זמן רב, לאסוף aliquot נפח גדול של supernatants נויטרופילים מכל תורם יחיד. איסוף למשל 2 מ&quot;ל של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים מגורה PMA תגרום 200 aliquots (10 μl כל אחד) מספיק 200 צלחות ELISA. נתונים המאפיינים את תקן NET נמצאים איור 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר PMA עבור 4 שעות ולהחיל DNase לעכל כדי supernatants שלהם על פי השלבים 3.4-3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף, בריכה, aliquot (10 μl) וחופשיze (-20 ° C) supernatants נויטרופילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את &quot;NET סטנדרטי&quot;, הפשרה אחד aliquot / תורם המתקבל לפחות חמישה תורמים נפרדים, לערבב אותם ולשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל דגימות מופשרות ולהשתמש נרות חדשים לניסוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1: דילול סדרה 2 של התקן-NET ב PBS + EGTA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות מתעכלות DNase1 (סטנדרטי supernatants הידוע) פי 20 ב PBS + EGTA ו aliquot אותם על צלחות ELISA מצופות נוגדנים ללכוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ELISA במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פתרון נוגדן איתור (100 μl / טוב): נוגדן אנטי DNA מצומדות peroxidase חזרת (1: 500, העכבר). דגירה עבור שעה 1 בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ארבעה שוטף עם PBS להוסיף מצע peroxidase TMB: 100 μl / היטב, 30 דקות. צבע הכחול הוא אינדיקציה לפעילות peroxidase (רשתות נוכחיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור תגובה על ידי הוספת 100 μl / טוב 1 M HCl. הפתרונות כחולים יצהיבו (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו ספיגה ב 450 ננומטר באמצעות פוטומטר microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים, לחשב את כמות MPO-DNA או מתחמים-DNA HNE בהשוואת לתקן NET. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את ערך צפיפות אופטית רקע של המדיום assay מכל המדגמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הערכים הספיגים (ציר ה- X) של דגימות תקן בדילול נגד תוכן NET היחסי (ציר ה- Y) (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מגוון nonsaturated של עקומת סטנדרט זה להקים קו המגמה (להשתמש בכושר מעריכי הטוב ביותר מהתוכנה בשימוש) (איור 5 א). המשוואה של קו מגמה זו קובעת את ההמרה של ערכי OD כדי כמותיים סכומי נטס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את ערכי OD המדודים של האלמונים למשוואת המגמה אונליין מ 3.13.3 זה תיתן את כמות הרשתות במדגם הידוע כאחוז התקן-NET (איור 5 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשבממוצעים של משכפל (triplicates) ולהציג את הנתונים הסופיים כמו &quot;כמות MPO-DNA או מתחמי-DNA HNE (% לסטנדרטים)&quot; (איור 5 ג). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li><li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li><li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation.">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps,+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase.">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205 (2013).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li><li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy.">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li><li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li><li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction.">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

רשתות מייצגי מנגנון חדשני מרתק שבו נויטרופילים להרוג פתוגנים. 1 למרות שהספרות של הנטס כבר ברציפות ההרחבה בעשר השנים האחרונות מאז גילויין, מספר שאלות חשובות הקשורות לתפקידם בביולוגיה, מנגנון ויסות עדיין אינן ברורות. יש במתודולוגיה שתפותח למדוד נטס, זה מנגנון מיקרוביאלית מאוד ייחודי. מאמר זה מתאר את השיטות שבהן ניתן להשתמש כדי לכמת נטס באופן תפוקה גבוהה. את assay הראשון כדלקמן קינטיקה של הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר. assay זה מספק כמות גדולה של מידע על המדרון ומהירות שחרור דנ&quot;א נויטרופילים. מידע זה חיוני בחקירות לומדות מוקדם איתות אירועים המוביל להיווצרות NET. כל המידע הזה הוא אבד מבחני סיום מדידים שחרור DNA בסוף הדגירה. הדנ&quot;א התאי לצבוע המבוסס assay אינו ספציפי עבור רשתות. זהרק מודד שחרור DNA. כדי לאשר נטס, זה מקובל לבצע immunofluorescence על נויטרופילים יוצרי NET ולהראות שיתוף לוקליזציה של DNA או בטושים גרגיר (MPO, HNE) או היסטונים. כימות של נתוני immunofluorescence היא אף מאוד משעממת וסובייקטיביים. כאן, שינוי של assay ELISA שפותחו בעבר גילוי מתחמי MPO-DNA מוצג. מדידה assay ELISA דומה מתחמי HNE-DNA המייצגים אמצעים NET ספציפיים מתואר גם. 3,5 מבחני שניהם מתאפיינים בפרוטוקול מפורט ומלא. 5 מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA ELISA הם כמותיים NET ספציפיים בעת ובעונה אחת תכונות. 5 אלה אינן מתקיימים בכל דרך שוטפת אחרת. המבחנים קלים לבצע ולספק נתונים לשחזור. 5 צעד עיכול DNase מוגבל כלול המבטיחים טיפול מהיר ואחיד של רשתות ישירות על נויטרופילים. 5 מבחנים אלה מתאימים כדי comלקלף כמה דגימות בעת ובעונה אחת. במדידות חדשות, בקרה הוא הראה כי מחזורי הקפאה / פשרה ו פרוטאזות אינן משפיעות על התוצאה של מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA. לא ידוע, עם זאת, אם חלבונים ידועים נקשרים ל- DNA ברשתות (כולל היסטונים ול&quot;ל-37) 1,11 יפריע מבחנים אלה. צעדים קריטיים של הפרוטוקולים שהוצגו הם כדלקמן. חשוב לקצור נויטרופילים הנמצאים במצב מנוחה, רגיעה ואינו לשחרר כמות גדולה של רשתות באופן ספונטני. חוסר צעד תמוגה hypotonic להסיר תאי הדם האדומים בפרוטוקול בידוד נויטרופילים המוצג הינו חיוני כדי להשיג נויטרופילים שאינם מופעלים. כדי לעכב הפעלת נויטרופילים לאחר שהתאים היו מטוהרים, זה חשוב גם resuspend נויטרופילים בתווך המכיל סרום של התורם שלהם. כדי להשיג תאים רדומים הוא גם חיוני להשתמש ריאגנטים pyrogen- וזיהום ללא במהלך הכנת נויטרופילים. Spontaשחרור NET neous של נויטרופילים במהלך assay לשחרור DNA התאי יכול לקרות גם. הוספת 1% סרום אוטולוגי למדיום assay חשוב למנוע זאת. גבוהות או נמוכות מנות של סרום אוטולוגי יכולות להיבדק כדי לקבל תוצאות אופטימליות. זה קריטי במהלך מבחני ELISA MPO-דנ&quot;א HNE-DNA שפורסמו DNA לא צריך להיות יותר מדי מתעכל על ידי DNase משום שהיא תגרום לאובדן מוחלט של האות. לכן, המינון האופטימלי צריך להיקבע עבור כל אצווה DNase חדשה. הפרמטרים של מערכת העיכול DNA יכול להיות שונה מעט כדי להשיג את ELISA הגבוהה ביותר אותות אפשריים. כמו כן, חשוב לערבב את DNase ורשתות ביסודיות כדי להבטיח כי DNase תהיה גישה ברורה ל- DNA. כאשר קצירת נטס מתעכל, לשטוף הבאר נרחבת כדי לאסוף את כל הרשתות. מגבלת זיהוי DNA של מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA הוא סביב 10-20 DNA ng / ml (איור 5). רמות סרום ו- DNA פלזמה ללא לנתקאל מאות עד אלף ng / ml דווחו מחלות (סרטן, זאבת אדמנתית מערכתית, זיהום שריר הלב) כי קושרו עם היווצרות NET נורמלי. 12-14 הדבר מצביע על כך מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA ELISA גם יש פוטנציאל כדי להיות מסוגל לכמת נטס בדגימות קליניות בבני אדם. יישום עתידי זה של מבחני ELISA MPO-דנ&quot;א HNE-דנ&quot;א יאפשר לקשר כמותית וגבעות כדי בהיווצרות המחלה.

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.1 The core of NETs is nuclear DNA.1 This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.1 The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.2 NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release. 
Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.1 Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.1 MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.2 NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).6 Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.6
Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human Neutrophil Elastase&#160; Rabbit Ab&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>481001</td>
			<td>1:2000X coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-496</td>
			<td>1:2000X coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-104-159-001</td>
			<td>1ug/ml used for digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mM EGTA/ PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM EGTA/PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell death detection ELISA Anti-DNA POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11544675001</td>
			<td>1:500X&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eon Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 All-in-One microplate software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>analytical tool (ELISA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox orange</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>S11368</td>
			<td>0.2% final concentration/volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Hepes</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>Use 10 mM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Use 5 mM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8139</td>
			<td>100nM final used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (pH 8.5-9.5)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 1644</td>
			<td>Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>D1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well assay plate black plate clear bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput measurement of extracellular dna release and quantitative net formation in human neutrophils in vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

הנתונים בכתב היד הזה לתאר את שיטת בידוד נויטרופילים, פרוצדורות, ותוצאות נציג נוכחיות עם הסבר של ניתוח נתונים. איור 1 מציג את צעדי סדרתי של הכנת נויטרופילים אדם. פרוטוקול זה מייצג רק דרך אפשרית אחת של בידוד נויטרופילים. זה מניב כמויות גדולות של נח נויטרופילים מסוגל לשחרר נטס על גירוי. איור 2 מראה כיצד assay לשחרור DNA מבוסס-הקרינה עובד. באמצעות קינטיקה קורא microplate קרינה של שחרור דנ&quot;א נויטרופילים אדם המיושמים 96 גם microplates. איור 3 מסביר כל צעד של ניתוח הנתונים. ראשית, לחשב אות DNA מקסימלי נויטרופילים שטופלו saponin (איור 3 א). גידול הקרינה תמיד מחושב כהפרש בין ערך הקרינה הגבוה ביותר ורמת קרינת רקע ( <strong&gt; איור 3 א). זה מחושב עבור כל טוב. הדוגמא מראה נתוני נציג של נויטרופילים אדם עזבו הלא מגורה או מופעל עם PMA או פ aeruginosa (PAO1) (איור 3B). פ aeruginosa מעורר היווצרות נטו PMNs האדם. 5,8,10 הוכח עם מספר פ aeruginosa זנים כולל PAO1 כי חיידקים בלבד (ללא נויטרופילים) לא יחייבו את צבען לגילוי DNA בשימוש. 8 PAO1 פ aeruginosa התקבל ATCC, בתרבית לילה בינוני לוריא- Bertani, שנקטפו בשלב מאוחר מעריכי, שטף במדיום assay והשתמשו לעורר נויטרופילים על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 (איור 3B, C, 4B, C). הממוצעים של גידול הקרינה של בארות לשכפל מחושבים, מנורמלים על קרינת מקסימלית (saponin) והם כפי שבאו לידי ביטוי &quot;שחרור DNA (% ממשקל מקסימאלי)&quot; (איור 3 ג). איור 3D מציג פלורסנט נציגתמונות דעך של נויטרופילים מטופל או PMA-מגורה. איור 4 א מתאר את ערכת מסביר את העקרונות של מבחני ELISA MPO-דנ&quot;א HNE-DNA. איור 4B מראה תמונות immunofluorescence נציג nonstimulated, PMA- ו נויטרופילים אדם המופעל PAO1. תאי DNA מראה מורפולוגיה NET טיפוסי ושיתוף localizes עם MPO ו- H4 היסטון citrullinated, סמן של היווצרות NET. 6 איור 4C מראה MPO-DNA ושחרור HNE-דנ&quot;א נויטרופילים האדם תחת קורת, התנאים הקודמים (כמו איור 3B, 3C ו -4 ב). IThe &quot;NET&quot; שיטות ELISA מתאפיינים בעבר. 5 בקצרה, 2 U / ml טיפול DNase (המקבילה של 1 מיקרוגרם / ריכוז מ&quot;ל של DNase בשימוש) במשך 15 דקות ב RT הביא את האותות MPO-דנ&quot;א HNE-DNA הגבוהה ביותר . 5 דגימות ריצה (100 ng / נתיב) על ג&#39;ל agarose חשף כי אורך DNAבתשואות לטווח kb נמוך אות ELISA אופטימלי. 5 DNA overdigestion (DNase מינון גבוה יותר מ -20 U / ml) או להשמיט גם את תפיסתם או נוגדן זיהוי ביטל את אותות ELISA. 5 בנוסף, כאן המבחנים ואת &quot;התקן NET-&quot; מאופיינים נוסף (איור 5 א). The Net-רגיל מכיל על דנ&quot;א תאיים הממוצע 19.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(נמדד על ידי שימוש בתקן עם ריכוזי DNA ידוע), 399 ng / ml MPO ו HNE 103.4 ng / ml (מסחרי ELISAkits) (n = 8). בהתבסס על משקל מולקולרי הכולל של MPO (84 KDA) ו HNE (29.5 KDA) והעובדה 1 מיקרוגרם DNA מכיל 9.91 x 10 14 נוקלאוטידים, Net-רגיל מכיל 109 HNE מולקולות 147 מולקולות MPO ל -1,000 נוקלאוטידים (DNA kb ). כפולת ניסויי דילול סדרה של NET-התקן גילו כי הטווח הדינמי של שני מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA ELISA הוא בין 19.0 - 609,0 ng /ריכוזי המ&quot;ל DNA (איור 5). דילולים נמוכים יותר פי 32 של תקן NET ביאה לרוויה בעוד דילולים של גבוה 1,024 פי לא היו שונים מן הרקע (איור 5 ב). טיפול של תקן NET עם מעכבי פרוטאז לא לשנות תוצאותיה שהשיגו מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA המציין כי פרוטאזות אינם מפריעים מבחנים אלה (איור 5 ג). לפיכך, תוצאות שהושגו המדגם הזהה NET הסטנדרטי ידי ELISA MPO-DNA או HNE-DNA מבחני מתואמים חזק עם השני (איור 5D). כדי להראות כי supernatants PMN הקפוא יכול לשמש גם מבחנים אלה מבלי לאבד יעילות, כמה aliquots של NET-התקן נותר ללא טיפול או אחרים נחשפו אחד או שני מחזורי הקפאה / פשרה בצעו ב -20 ° C או -80 ° C (1 מרווח hr). אף אחד מהטיפולים ההקפאה / הפשרה השפיעו על תוצאות MPO-DNA או HNE-DNA (איור 5E). לסיכום,NET-התקן קובע נקודת התייחסות אמינה מבחני NET-לכימות אלה המאפשרים השוואת כמותית של תוצאות NET בין ניסויים עצמאיים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig1.jpg" /> איור 1:. בידוד של האדם נויטרופילים גרנולוציטים נויטרופילים בודדו מדם היקפי של מתנדב על פי הפרוטוקול המתואר. דם המכילה קרישה שמשה לבודד נויטרופילים ידי שקיעת Dextran צנטריפוגה שיפוע. דם ללא נוגד קרישה שימש להכנת בסרום. הכדאיות של ההכנות נויטרופילים נבחנת על ידי assay הרחקה כחול Trypan. טוהר נויטרופילים נבחן על ידי cytospin או cytometry זרימה (CD16, CD66abcd תאים פעמים חיוביים). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig2.jpg" /> איור 2:. עקרונות של Assay תאי DNA שחרור (א) הקרינה מתקבל רק נויטרופילים אשר פלזמה ממברנות הגרעין נפרץ ואת צבע קרום חדיר ה- DNA מחייבת יכול להיקשר ל- DNA שלהם. (ב) assay מבוצע על 96-היטב שחור microplates באמצעות fluorimeter microplate. (ג) fluorimeter רושמת עקומות קרינה בזמן אמת בכל טוב. אחת התוצאות נציג לראות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח של נתוני שחרור DNA (. <strong&gt; א) סאפונין משמש כדי ליצור את הערך המרבי מאז אותה לחלוטין lyses נויטרופילים וחושף DNA שלהם. קינטיקה של קרינה נגרמת saponin מוצגת. (ב) קינטיקה של שחרור DNA נויטרופילים המושרה על ידי PMA (100 ננומטר) וחיידקים (Pseudomonas aeruginosa PAO1, 10 משרד הפנים). (C) מנורמל מרוכז נתוני שחרור DNA שהושגו אחד ניסויים באמצעות quadriplicates. (ד) תמונות קרינת נציג של נויטרופילים אדם מטופל PMA מגורה (אורנג Sytox, דגירת hr 4). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig4.jpg" /> איור 4: MPO-דנ&quot;א HNE-DNA ELISA מבחנים:. עיקרון ואת נציג תוצאות (א) תכנית להסבירing איך עבודת מבחני MPO-דנ&quot;א HNE-DNA ELISA. (ב) נציג תוצאות של תמונות immunofluorescence המוכנות על נויטרופילים אדם חשופים 100 ננומטר PMA או פ aeruginosa זן PAO1 (10 משרד הפנים) עבור 4 שעות. תאי DNA (DAPI, כחול) שיתוף לוקליזציה ברשתות עם MPO (ירוק) ו- H4 היסטון citrullinated (אדום). תוצאת נציג אחד, n = 3. (ג) שחרור NET נמדדה נויטרופילים אדם חשופים לאותה גירויים כנ&quot;ל על ידי מבחני ELISA MPO-דנ&quot;א HNE-DNA. ממוצע ± SEM, n = 3. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig5.jpg" /> איור 5: אפיון של &quot;NET הסטנדרטי&quot; (א) דילולים הסידוריים. (1: 2) תקן NET הוכנונתון MPO-DNA ELISA. ערכי OD נמדדים הם זממו נגד% של תוכן NET הסטנדרטי. אדום &quot;X&quot; מציין ערך OD נמדד של מדגם לא ידוע. החץ האפור מציין כיצד &quot;ריכוז NET&quot; (כחול &quot;X&quot;) של מדגם לא ידוע יקבע באמצעות מגוון המרכזי של עקומת סטנדרט מצויד. (ב) ריכוזי DNA בדגימות NET סטנדרטיים בדילול סדרתי נקבעו זממו נגד ערכי OD המדוד של מבחני ELISA MPO-DNA או HNE-DNA. תחומים אפורים לציין את הטווח הדינמי של המבחנים. (ג) הטיפול מעכב פרוטאז (קוקטייל מעכבי פרוטאז, 1%) אינה משפיעה על התוצאה של מבחני MPO-DNA או HNE-דנ&quot;א (סטנדרטיים NET). ממוצע ± SEM, n = 2. (ד) המתאם של תוצאות MPO-דנ&quot;א HNE-דנ&quot;א (OD 450 ננומטר) של בדילול סדרתי &quot;רגיל-NET&quot; דגימות טווח דינמי שלהם (ראה 5B). (E) מחזורי הקפאה להפשרה (-20 ° C או -80 מעלות צלזיוס; one או שתיים) אינו משפיע על התוצאות של MPO-דנ&quot;א מבחני HNE-דנ&quot;א (NET-רגיל, ממוצע ± SEM, n = 2). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro at JoVE.com

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

13.0K Views.  University of Georgia. High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Video: High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

הקמתה של

כמותי

תפוקה גבוהה ג'ין תיוג ב

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית