We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes.">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li><li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells.">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li><li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+coregulation+of+5'TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR.">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication.">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li><li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+(eIF3)+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast.">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li><li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E.">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li><li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response.">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li><li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate.">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li><li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery.">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype.">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li><li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon.">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li><li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+translation+state:+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening.">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li><li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis.">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li><li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly(A)++mRNA+in+actively+translating+polyribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li><li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+5'+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress.">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li><li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation.">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity.">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li><li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+polyribosome+fractionation.">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרופיל Polysomal הוא טכניקה רבת עוצמה שמאפשרת כימות של מדינת תרגום של תמלילים מסוימים בתנאי טיפול שונים. זוהי טכניקה פשוטה מאוד באופן עקרוני ובכל זאת דורשת מספר שלבים של ביצוע, שחלקם הם קריטיים לייצור פרופילי polysome טובים. שלבים העיקריים אלה הם: 1) שימוש בכימיקלים וplasticware RNase חינם, 2) הכנה הדרגתיים סוכרוז טוב (הדרגתיים סוכרוז 10-50% בניסיון שלנו עובדים הכי טוב עבור יעילות פתרון 40 / 60S יחידות משנה וmRNAs עם ריבוזומים קשורים), ו- 3 ) תוך שימוש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי ולא מחובר יותר מ -80% על מנת ללכוד את השיעור הגבוה ביותר של תרגום. צעד אחרון זה צריך להילקח בחשבון כאשר עושים טיפולי תא ארוכים, כגון מציאה גן או ביטוי יתר, כך שהסכום של תאים לצלחת יהיה פונקציה של כמה התאים יהיו מחוברים בנקודת הסיום. בתוצאות presenטד כאן, polysome ניתוח הפרופיל היה כלי חשוב להערכת תפקיד PDCD4 בויסות התרגום של mRNAs XIAP וBcl-XL 12-מחסה IRES. העובדה שאנו לא צופים כל שינוי בפרופילי polysome הכלליים על PDCD4 לדפוק למטה (איור 1) אפשרה לנו להגיע למסקנה כי PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי בתנאים של הניסוי. אנחנו הבאים עשינו שימוש בניתוח RT-qPCR כדי לקבוע את חלוקת XIAP וBcl-XL mRNAs בתאים שטופלו עם PDCD4 או siRNAs שליטה. qPCR הוא שיטת בחירה של ניתוח פרופילי polysome, בניגוד לסטנדרטי RT-PCR או סופג צפון, משום שהוא מאפשר ללא כמו ניתוח חצי כמותית של הפצת mRNA ולגילוי שינויים דקים בtranslational יעילות בין טיפולים. השימוש בטכניקה זו, הצלחנו להראות כי ההפצה של mRNAs Bcl-XL XIAP ו( כאחוז מכלל mRNA היעד על פני גרadient) היה עבר בצורה משמעותית לpolyribosomes הכבד (mRNAs עם מספר גדול של ריבוזומים הקשורים בם) לאחר PDCD4 לדפוק למטה (1D איור, E), וכך מצביעה על עלייה בתרגום של mRNAs אלה. זה אושר גם על ידי עלייה ברמות חלבון XIAP וBcl-XL אבל לא ברמות RNA המצב היציב שלהם (איור 1F, G). חשוב לציין, הפצת polysome של הגרסה הלא-IRES של XIAP הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג &#39;). לחלופין, יעילות translational יכולה להיות מוצגת כיחס בין תוכן mRNA בpolysomes (בדרך כלל שברי 5 עד 10) לעומת monosomes (בדרך כלל שברים 2 עד 4) 14. השימוש בבקרות בכל הפרוטוקול חשוב באימות כל polysome פרופיל תוצאה, כפי שניתן לא בכוחות עצמם לייחס פסגות שנצפו מקריאות ספיגה ב 254 ננומטר ל- RNA ריבוזומלי (חומר ניקוישל, כגון טריטון X-100 מאוד לספוג באזור זה של הספקטרום ועלול לטשטש 40 / 60S פסגות בחלק העליון של השיפוע). מילויים ריקים ללא lysate ו / או עם חיץ lysate צריכים להפעיל כדי לקבוע את תרומתו היחסית של המאגרים לספיגה ב 254 ננומטר. Artefactual מבנים מסדר גבוהים יותר גם יכולים להוביל לפרשנות מוטעה של polysomes שבו יש באף עובדה (לדוגמא &quot;פסאודו-polysomes&quot; 20). Sequestering מגנזיום (המשמש בכל ההליך כדי לייצב 80S ריבוזומים) עם EDTA chelator קטיון דו הערכי הוסיף לlysates ולמאגר שהשיפוע (20 מ&quot;מ במשך 15 דקות) יגרום הפרדה של הריבוזום לקטן (40S) המרכיב אותה וגדול (60S תת-יחידות). לכן, אם פסגות ספיגה נרשמו ב 260 ננומטר הן אכן polysomes, טיפול EDTA יקרוס הפרופיל כזה שמקסימום יחיד יהיה שנצפה בחלק העליון של שיפוע המתאים לשחרור ה- mRNA ויחידות ריבוזומלי (מידע לא מוצג). ביחדעם קריסה מושרה EDTA של הפרופיל, כל המטרות הספציפיות נותחו על ידי qPCR צריך להימצא כעת בחלק העליון של השיפוע. מספר ריבוזומים הקשורים mRNA הוא לא תמיד אינדיקציה למידת היעילות שmRNA מסוים מתורגם. ואכן, יש הקשרים ספציפיים שבו תרגום פעיל בpolysomes הופך תקוע 21,22 שהקורא צריך להיות מודע. קביעה אם או לא תמלילים עוסקים באופן פעיל עם מכונות התרגום יכולים להיעשות על ידי) טיפול במדגם עם puromycin, שלא כמו EDTA, גורם ל&#39;ניגר &#39;של ריבוזומים שבאופן פעיל translocating פני mRNA, או ב) טיפול במדגם עם homoharringtonine אשר מעכב טרנסלוקציה של הריבוזום הראשון רק בקודון ההתחלה, שוב גורם ל&#39;ניגר &#39;של כל ריבוזומים translocating במורד הזרם. השימוש בתמלילי שליטה לניתוח qPCR הוא גם קריטי. אין התמיכה בבחירהtion של תמלילים שאינם מושפעים מהתנאים טיפול שונים, כגון גנים מסוימים במשק בית (GAPDH, אקטין, טובולין, Nucleolin), mRNAs ריבוזומלי (18S, RPL13A) או במקרה זה גרסה הלא-IRES של IRES XIAP, הוא חשוב ב האימות אם ההשפעה של הטיפול על תרגום היא ספציפית או כללי. תמלילי שליטה אלה יכולים לשמש כדי לנרמל את ההפצה של mRNAs ניתח כפי שנעשה כאן (mRNAs XIAP וBcl-XL היה מנורמל GAPDH mRNA ומבוטא באחוזים מכלל תוכן mRNA המיוצגים בסכום של תוכן mRNA בכל שבריר ) או לחלופין, יכול לבוא לידי ביטוי mRNAs היעד והשליטה כערכים מוחלטים ומוצג בנפרד. ניתוח qPCR של lysates הקלט (בדרך כלל 10% מנפח כולל) הוא צעד נוסף שישלוט על חלוקת mRNAs הספציפי. באופן אידיאלי, תוכן mRNA של תמליל ספציפי בlysate הקלט צריך להיות דומה לסכום של תוכן mRNA בכל 10 הברים ניתחו. לבסוף, צעד אופציונאלי לשליטה לפנול: שלב חילוץ כלורופורם הוא ספייק כל חלק polysome עם במבחנה mRNA כתב עיבד (כגון CAT, אצטיל כלורמפניקול transferase) שניתן לכמת בהמשך על ידי qPCR ויכול גם לשמש כדי לנרמל 14 נתונים. כמו בכל טכניקה, פרופיל polysome מציג כמה מגבלות. העובדה שבדרך כלל מינימום של 10 שברים (משמרות עדינות יותר ביעילות תרגום עשויה לדרוש יותר או 20) צריכה להיות שנאספו על מנת לקבל הפצות polysome נחמדה עושה את הצעד הזה הגבלה, במובן זה שרק למקסימום של 4 דגימות יכול להיות ניתח בכל פעם כדי שתוכל לטפל בנוחות מיצוי RNA וניתוח qPCR של 40 דגימות ובקרת 4 קלט בבת אחת. גודל המדגם יכול בקלות להוסיף עם כמה תמלילים להיות מנותחים וכמה qPCR משכפל לעשות, וזה יכול להיות יקר. מגבלה נוספת של פרופיל polysomal מבוסס qPCRnalysis הוא שזה יכול להיעשות רק על גישה מבוססת מועמד (שבו התמלילים להיות מנותחות ידועים מראש) ולא יכולים להיות מיושמים לניתוח הגנום של תרגום. עם זאת, בתחילת המאה ה -21, חוקרים החלו לחקור RNA polysomal שלהם ברמה גנומית באמצעות DNA microarrays 15 ולאחרונה עם רצף של הדור הבא 16,17. בגישה זו עוצמה, פרופיל polysomal מתבצע כפי שתואר בפרוטוקול זה אלא שבמקום לבצע ניתוח qPCR של שברים בודדים, monosomes שברים (בדרך כלל חלק 2-4) וpolysomes שברים (בדרך כלל שברים) הם אספו יחד ושינויים בתרגום העולמי נתח על ידי מערך DNA או RNA רצף הגנום. מכאן עם גישה זו, ניתן להעריך את כל mRNAs הפצה שמשמרות מpolysomes לmonosomes (ירידה בתרגום) או להיפך (עלייה בתרגום) על טיפול ספציפיment. אימות וכימות הפצת polysomes mRNA ספציפית אז יכולים להיעשות על ידי qPCR. שימוש אפילו יותר חזק של עיקרון פרופיל polysomal הוא פרופיל הריבוזום. הארכת תפוקה גבוהה נוספת של טכניקה זו דווחה לאחרונה, המאפשרת ניטור בו-זמני של מאות polysome שברים 23. זה מספק יתרון ברור כאשר חיטוט יעילות translational של אוספי מוטציה או במסכי RNAi בקנה מידה גדולה. פרופיל הריבוזום הוא טכניקה שמנצלת רצף של הדור הבא למפה שברי RNA מוגנים על ידי ריבוזומים (עקבות הריבוזום) העוסקים בסינתזה של חלבוני 24,25. בטכניקה זו, טרנסלוקציה הריבוזום יכולה להיות מעוכבת עם cycloheximide (הפיך) או emetine (בלתי הפיך) ואחריו תמוגה תא ועיכול RNase להניב אוכלוסייה של עקבות הריבוזום. הריבוזומים מועשרים, RNA הכולל מבודד, וריבוזומלי זיהום וRNA ריבוזומלי המיטוכונדריה מוסר.עקבות RNA של כ 26-28 נוקלאוטידים מבודדות, הפוך עיבד, הפך לספריית cDNA והרצף 26. בניגוד לפרופיל polysome סטנדרטי, גישה זו לא רק מזהה mRNAs הספציפי שמוסדרים translationally אלא גם מניבה מידע mRNA הספציפי ברזולוציה קודון כגון כיבוש המדויק וצפיפות של ריבוזומים לאורך תמליל ספציפי. זה מעניין בעיקר לmRNAs עם מצבים ספציפיים של תרגום כגון mRNAs IRES-מחסה, כפי שהוא יכול לתת מידע נוסף על מיקום בהריבוזומים לגיוס התמליל מתרחש.

רגולציה של סינתזת חלבון (תרגום) היא תהליך תאי חשוב שקשורה קשר הדוק להישרדות סלולרית. בהתחשב בעובדה שהתרגום צורך יותר מ -50% מהאנרגיה של התא, אין זה מפתיע שהתרגום מוסדר בחוזקה ושההפרעות בתרגום אינן נסבלות היטב. לעומת זאת, רבים תהליכים תאיים חריגים דורשים כי מכונות תרגום ופלט תרגום (כלומר proteome) צריכים להיות שונה. זה קורה לעתים קרובות במדינות תגובת לחץ ומחלות שונות, והוא כנראה הכי טוב שהודגם בסרטן. יתרון מפתח של שליטת translational הוא היכולת של תאים לתכנת מחדש במהירות את תפוקת החלבון בתגובה לטריגרים חיצוניים ופנימיים שונים, מנגנון כוונון ובכך בסדר שעצות האיזון בין הישרדות תא ומות 1. שני היבטים של שליטת translational מעניינים במיוחד; הבנה של הטבע של MEC הרגולציהאלמנטי hanism (ים) ובקרה המאפשרים לתרגום ספציפי, וזיהוי של mRNAs הספציפי ומוצרי החלבון שלהם, המשתתפים בתגובה התאית להדק המסוים שעורר תרגום סלקטיבי במקום הראשון. פרופיל Polysome הוא טכניקה המאפשרת לימוד אפקטיבי של שני התהליכים. המטרה הכללית של טכניקת פרופיל polysome היא ללמוד ולכמת את מצב התרגום של mRNAs המסוים בתנאים סלולריים שונים. העיקרון של השיטה הוא ללכוד תרגום mRNA על ידי &#39;&#39; הקפאה &#39;&#39; ריבוזומים פעילים תרגום בתמלילים שונים ונפרדים polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשרים להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר (מחויבת כמה ריבוזומים) ו גרוע מתורגם אלה (כפופים לריבוזומים אחד או שניים). בפרוטוקול ספציפי זה, cycloheximide האנטיביוטי שנקשר ל60S מקטע ריבוזומלי וחוסם את שחרורו של tRNA deacetylated מאתר E הריבוזום 2, משמש כדי לעכב טרנסלוקציה הריבוזום ולעכב ריבוזומים על mRNAs תרגום. עם זאת, סוכני חסימה אחרים כגון emetine שתרגום גם חוסם התארכות 3, ניתן להשתמש. בניגוד למערבי סופג ו -35 S-מתיונין טכניקות תיוג המודדות את התוצר הסופי של תהליך התרגום, polysome יש פרופיל את היתרון של מדידת עמותת ריבוזומים עם mRNAs באופן פעיל-המתורגם, ובכך מאפשר למחקר מפורט יותר של מנגנוני תרגום בתנאים שונים. לפיכך, הטכניקה ניתן להתאים בקלות ללמוד במיוחד מצבים שונים של תרגום 4-6, גורמי חלבונים מעורבים בויסות תרגום 7-9, תנאי לחץ משפיעים על סינתזת חלבון 1,10,11 או את ההשפעות של מבני mRNA כגון IRES או במעלה הזרם מסגרות קריאה פתוחות בסינטיסייזר החלבוןesis 12-14. כיום, polysome יישומי פרופיל הם אפילו רחבים יותר בשימוש במערכים DNA 15 או רצף של הדור הבא 16,17 לנתח mRNAs הקשורים polysomes.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

רגולציה של סינתזת חלבון מהווה נקודת שליטה מרכזית בתגובה תאית ללחץ. בפרט, יחידות בקרת RNA דיסקרטי הוצגו כדי לאפשר לתרגום סלקטיבי של mRNAs הספציפי, אשר בדרך כלל קשורים לחלבונים הנדרשים לתגובת לחץ מסוימת. זיהוי של mRNAs אלה, כמו גם האפיון של מנגנוני פיקוח אחראים לתרגום סלקטיבי היה בחוד החנית של ביולוגיה מולקולרית לכמה זמן. פרופיל Polysome הוא שיטת אבן פינה במחקרים אלה. המטרה של פרופיל polysome היא ללכוד תרגום mRNA על ידי משתק ריבוזומים פעיל תרגום בתמלילים שונים ונפרדת polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשר להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר ואלה תורגמו בצורה גרועה. אז יכולות להיות מאופיינות אלה נוספות על ידי שיטות ביולוגיה מולקולריות ביוכימי ומסורתית. חשוב לציין, עמ &#39;שילובolysome פרופיל עם גישות הגנומי תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח בקנה מידה גדול של הרגולציה translational.

יש לנו לאחרונה תיארתי תפקיד חדש למדכא גידול PDCD4 כמעכב תרגום סלקטיבי של IRES-מחסה mRNAs קידוד מעכבים אפופטוטיים XIAP וBcl-XL 12. פרופיל Polysome היה טכניקת מפתח כדי להדגים את המעורבות הספציפית של PDCD4 בתרגום תיווך IRES. HEK293 תאים היו transfected זמני לרוקן רמות אנדוגני של PDCD4 (איור 1 א), ואז העביר לpolysome ניתוח פרופיל. הבחנו כי רמות הפחתה של PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי, כמו להישפט על ידי חוסר השינויים בפרופיל polysome כאשר משווים siCTRL וsiPDCD4 תאים שטופלו (איור 1). באופן דומה, polysome הפצה של גרסה הלא-IRES של XIAP 19 הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג &#39;). בניגוד לכך, polysome הפצה של mRNAs שני IRES-מחסה, XIAP וBcl-XL, הייתה שונה באופן משמעותי. בהעדר PDCD4 ההפצה של שני mRNAs אלה מוסטת לribopolysomes הכבד (1D איור, E). מכיוון שזו אינה מלווה בשינויים ברמות מצב היציב של XIAP וBcl-XL mRNA (איור 1F) תוצאות אלו מראות משופרים תרגום של XIAP וBcl-XL בתאים עם רמות PDCD4 מופחתות, אשר אושר גם על ידי מערבי (איור סופג 1G). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> איור 1:. פרופיל Polysome מזהה PDCD4 כמעכב סלקטיבי של תרגום XIAP וBcl-XL () טופלו HEK293 תאים עם PDCD4 siRNA או שליטה (CTRL), ללא מיקוד siRNA, lysed ונתון ניתוח כתם מערבי עם אנטי PDCD4 ונוגדנים נגד Nucleolin כדי לוודא את מידת PDCD4 לדפוק למטה. (ב) PDCD4 ופל כמו ב() וlysates התא היו נתונים לpolysome פרופיל. פרופיל polysome נציג מוצג בפנל העליון; חלוקת הלא IRES XIAP (C), Bcl-XL (ד &#39;), וXIAP IRES (E) mRNAs ביחס לזה של GAPDH מוצג כאחוז מה- mRNA הכולל (% mRNA) בכל חלק. (F) יציב רמות ה- mRNA -state נמדדו על ידי RT-qPCR בPDCD4 siRNA או שליטה (CTRL) siRNA תאים שטופלו. (G) lysates מ (A) גם היו נתונים לניתוח כתם מערבי עם אנטי XIAP, אנטי-Bcl-XL, ו נוגדנים נגד Nucleolin. (NB. הנתונים המוצגים באיור 1 פורסם במקור ב -12) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling at JoVE.com

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Views.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Video: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Developmental Biology

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...