We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

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The authors have nothing to disclose.

Polysomaler Profilierung ist eine leistungsfähige Technik, die zur Quantifizierung der Zustand der Übersetzung der spezifischen Transkripte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen ermöglicht. Es ist eine sehr einfache Technik im Prinzip doch mehrere Schritte der Ausführung, von denen einige kritische zur Herstellung guter Polysomen-Profile erfordert. Diese wichtigen Schritte sind: 1) mit RNase-frei Chemikalien und Kunststoffgeschirr, 2) Vorbereitung gute Saccharosegradienten (nach unserer Erfahrung ein 10-50% Saccharosegradienten funktionieren am besten, für die effiziente Lösung von 40 / 60S-Untereinheiten und mRNAs mit gebundenen Ribosomen) und 3 ) unter Verwendung von Zellen, die exponentiell wachsen und nicht mehr als 80% konfluent, um zu erfassen die höchsten Raten der Übersetzung. Dieser letztere Schritt ist zu berücksichtigen, wenn dabei lange Zellbehandlungen, wie beispielsweise Knock-down oder Überexpression genommen werden, so dass die Menge der Zellen an der Platte wird eine Funktion, wie viel sich die Zellen am Endpunkt konfluent sein. In den Ergebnissen presented hier Polysomen-Profil-Analyse war ein wichtiges Werkzeug für die Bewertung Pdcd4 Rolle in der Translationsregulation der IRES-tragenden mRNAs XIAP und Bcl-xL 12. Die Tatsache, dass wir keine Änderung der allgemeinen Polysom ​​Profile auf Pdcd4 knock-down (1B) nicht beachten konnten wir feststellen, dass Pdcd4 nicht globalen zellulären Übersetzung unter den Bedingungen des Experiments beeinträchtigen. Als nächstes verwendet RT-qPCR-Analyse, um die Verteilung des XIAP und Bcl-xL-mRNAs in Zellen, die mit Pdcd4 oder Kontroll siRNAs behandelt bestimmen. qPCR ist ein Verfahren der Wahl für die Analyse von Polysomen-Profile, im Gegensatz zu Standard-RT-PCR oder Northern-Blot, weil es für eine quantitative anstatt semi-quantitative Analyse der mRNA Verteilung und zum Nachweis von feinen Verschiebungen in Translationseffizienz zwischen den Behandlungen. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, dass die Verteilung der XIAP und Bcl-xL-mRNAs (ausgedrückt als Prozent des gesamten Ziel-mRNA durch die gradient) signifikant in schwere Polyribosome (mRNAs mit einer großen Anzahl von Ribosomen mit ihnen verbunden sind), nachdem Pdcd4 knock-down (1D, E) verschoben wird, was auf eine Erhöhung der Übersetzung dieser mRNAs. Dies wurde weiter durch eine Erhöhung der XIAP und Bcl-xL-Protein-Spiegel, aber nicht in ihrer stationären RNA-Niveaus (1F, G) bestätigt. Wichtiger ist, die Polysomen Verteilung des nicht-IRES-Variante von XIAP war unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Alternativ kann die Translationseffizienz als das Verhältnis der mRNA-Gehalt in Polysomen (üblicherweise die Fraktionen 5 bis 10) gegenüber monosomes vorgestellt (üblicherweise die Fraktionen 2 bis 4) 14. Die Verwendung von Steuerelementen im gesamten Protokoll ist bei der Validierung keine Polysom ​​Profilierungsergebnis wichtig, da von Absorptionswerte bei 254 nm beobachtet Spitzen können nicht auf eigene Faust, um die ribosomale RNA (Reinigungsmittel zurückzuführens, beispielsweise Triton X-100 stark absorbieren in diesem Bereich des Spektrums und kann 40 / 60S Spitzen an der Spitze des Gradienten verdecken). Lassen Gradienten ohne Lysat und / oder mit Lysatpuffer müssen ausgeführt werden, um den relativen Beitrag der Puffer zu der Absorption bei 254 nm zu bestimmen. Artefakt Strukturen höherer Ordnung können auch zu Fehlinterpretationen von Polysomen, wo es in der Tat keine (zB &quot;pseudo-Polysomen&quot; 20) führen. Maskierungs Magnesium (während des gesamten Verfahrens zur Stabilisierung von 80S Ribosomen) mit der zweiwertige Kationenchelator EDTA zugegeben, um Lysate und dem Gradienten-Puffer (20 mM für 15 min) wird die Trennung des Ribosoms in seine Komponenten kleinen (40S) führen und große (60S ) Untereinheiten. Wenn somit Absorptionspeaks bei 260 nm aufgezeichnet sind zwar Polysomen, EDTA-Behandlung das Profil, so dass ein einziges Maximum wird in der Nähe der Oberseite des Gradienten, die zu mRNA und die ribosomale Einheiten frei entspricht beachten kollabieren (Daten nicht gezeigt). Übereinstimmendmit EDTA-induzierten Zerfall des Profils, sollten alle der besonderen Ziele durch qPCR analysiert jetzt an der Oberseite des Gradienten gefunden werden. Die Anzahl der Ribosomen mit einer mRNA assoziiert ist nicht immer ein Indikator dafür, wie effizient diese bestimmte mRNA übersetzt wird. Tatsächlich gibt es bestimmte Kontexte, in denen aktive Übersetzung auf Polysomen wird ins Stocken geraten 21,22, die der Leser bewusst sein sollten. Bestimmen, ob oder nicht Transkripte werden aktiv mit der Translationsmaschinerie in Eingriff kann durch eine geführt werden) Behandeln der Probe mit Puromycin, die im Gegensatz EDTA, bewirkt &#39;run-off &quot;von Ribosomen, die aktiv in einem mRNA translozieren sind, oder b) Behandeln der Probe mit Homoharringtonin die Translokation nur der ersten Ribosom am Startcodon hemmt, was wiederum zu &quot;Run-off&quot; aller nachgelagerten Translokationseinheit Ribosomen. Die Verwendung von Steuer Transkripten qPCR-Analyse ist ebenfalls kritisch. Das Selection von Transkripten, die nicht durch unterschiedliche Behandlungsbedingungen wie einige Housekeeping-Gene (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNAs (18S, Rpl13a) oder in diesem Fall der Nicht-IRES Variante des XIAP IRES betroffen sind, ist in wichtigen Überprüfung, ob die Behandlung die Wirkung auf Übersetzung ist spezifisch oder generalisiert. Diese Steuer Transkripten verwendet werden, um die Verteilung der mRNAs analysiert, wie es hier gemacht normalisieren (XIAP und Bcl-xL-mRNAs wurden auf GAPDH-mRNA normalisiert und als Prozentsatz der Gesamt-mRNA-Gehalt durch die Summe der mRNA-Gehalt in jeder Fraktion vertreten ) oder alternativ können Ziel- und Steuerungs mRNAs als Absolutwerte angegeben und gesondert auszuweisen. qPCR-Analyse der Eingangs Lysaten (in der Regel 10% des Gesamtvolumens) ist ein weiterer Schritt, der für die Verteilung von spezifischen mRNAs steuern wird. Idealerweise sollte der mRNA-Gehalt einer spezifischen Transkripts in der Eingangs Lysat vergleichbar mit der Summe der mRNA-Gehalt in den Fraktionen 10 analysiert werden. Schließlich, Ein optionaler Schritt, um für die Phenol steuern: Chloroform Extraktionsschritt besteht darin, jeden Polysom ​​Fraktion mit einem in vitro transkribiert Reporter mRNA Spike (wie CAT, Chloramphenicolacetyltransferase), die anschließend von qPCR quantifiziert werden wird und kann sogar verwendet werden, um die Normalisierung Daten 14. Wie bei jeder Technik stellt die Polysomen Profilierung einige Einschränkungen. Die Tatsache, dass in der Regel ein Minimum von 10 Fraktionen (subtilere Veränderungen der Translationseffizienz erfordern 20 oder mehr) benötigen, um schöne Polysom ​​Distributionen gesammelt macht dieser Schritt Begrenzung, in dem Sinne, dass nur maximal 4 Proben kann zu einem Zeitpunkt analysiert, um in der Lage, bequem hand RNA-Extraktion und qPCR-Analyse von 40 Proben und 4 Input-Kontrollen auf einmal sein. Die Stichprobengröße kann leicht bis mit, wie viele Transkripte analysiert werden und wie viele qPCR repliziert zu tun, und das kann teuer werden. Eine weitere Einschränkung eines qPCR-basierte polysomaler Profilierung einnalysis ist, dass sie nur auf einen Kandidaten-basierten Ansatz (wobei die Transkripte zu analysierende im Voraus bekannt sind) und kann nicht für genomweiten Analyse von Übersetzungs angewendet werden erfolgen. Doch zu Beginn des 21. Jahrhunderts begannen die Ermittler ihre polysomaler RNA an genomischer Ebene mit Hilfe von DNA-Microarrays zu verhören 15 und in jüngerer Zeit mit der nächsten Generation Sequenzierung 16,17. In diesem leistungsfähigen Ansatz wird polysomaler Profilierung durchgeführt, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, außer, dass anstatt der Durchführung qPCR Analyse der einzelnen Fraktionen, monosomes Fraktionen (in der Regel Bruch 2-4) und Polysomen Fraktionen (meist Fraktionen) werden vereinigt und Variationen in der globalen Übersetzung analysiert durch DNA-Microarray oder des gesamten Genoms RNA Sequenzierung. Daher bei diesem Ansatz ist es möglich zu beurteilen, alle mRNAs, deren Verteilung verschiebt sich von Polysomen zu monosomes (Abnahme der Übersetzung) oder umgekehrt (Erhöhung der Übersetzung) auf ausdrückliches treatment. Validierung und Quantifizierung spezifischer mRNA Polysomen Verteilung kann dann durch qPCR erfolgen. Eine noch leistungsfähigere Nutzung der polysomaler Profilierung Prinzip ist Ribosom Profilierung. Weitere Hochdurch Erweiterung dieser Technik wurde kürzlich berichtet, dass zur gleichzeitigen Überwachung von Hunderten von Polysomen Fraktionen 23 ermöglicht. Dies stellt einen klaren Vorteil beim Antasten Translationseffizienzen von Mutantensammlungen oder in einer groß angelegten RNAi-Screens. Ribosom Profiling ist eine Technik, die ausnutzt Next Generation Sequencing, um RNA-Fragmente von Ribosomen (Ribosomen Fußabdrücke) geschützt in der Proteinsynthese 24,25 engagiert abzubilden. Bei dieser Technik kann Ribosomentranslokation mit Cycloheximid (reversibel) oder Emetin (irreversible), gefolgt von Zell-Lyse und RNase-Verdau, um eine Population von Ribosomen Fußabdrücke ergeben gehemmt werden. Ribosomen sind angereichert, die Gesamt-RNA isoliert und verunreinigen ribosomale und mitochondriale ribosomale RNA wird entfernt.RNA Fußabdrücke von ca. 26-28 Nukleotiden werden isoliert, revers transkribiert, in eine cDNA-Bibliothek umgewandelt und sequenziert 26. Im Gegensatz zu Standard Polysom ​​Profiling, dieser Ansatz nicht nur identifiziert spezifische mRNAs, die translational reguliert werden, sondern auch liefert mRNA-spezifische Informationen bei Codon Auflösung wie die genaue Besetzung und Dichte der Ribosomen entlang einer spezifischen Transkript. Dies ist besonders interessant für mRNAs mit bestimmten Arten der Übersetzung wie IRES-beherbergen mRNAs, wie es mehr Informationen darüber, wo auf dem Transkript Ribosom-Rekrutierung auftritt geben könnte.

Regulation der Proteinsynthese (Translation) ist ein Schlüssel zellulären Prozess, der eng mit zellulären Überleben verknüpft ist. Da Übersetzung verbraucht mehr als 50% der Energie Zelle, ist es nicht verwunderlich, dass Übersetzung ist streng reguliert, und dass Störungen in der Übersetzung nicht gut vertragen. Umgekehrt sind viele aberrante zelluläre Prozesse erfordern, dass Translationsmaschinerie und Übersetzungs Ausgang (dh Proteom) müssen geändert werden. Dies ist häufig in verschiedenen Stressantwort und Krankheitszuständen der Fall, und ist wahrscheinlich am besten in der Krebsbeispielhaft dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil der Translationskontrolle ist die Fähigkeit von Zellen, sich schnell neu zu programmieren, die das Protein Ausgabe in Reaktion auf verschiedene externe und interne Trigger, wodurch eine Feinabstimmung Mechanismus, neigt das Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Tod 1. Zwei Aspekte der Translationskontrolle sind besonders interessant; Verständnis der Natur des Regelungs mechanism (s) und Kontrollelemente, die für bestimmte Übersetzung zu ermöglichen, und die Identifizierung von spezifischen mRNAs und deren Proteinprodukte, die in der zellulären Reaktion auf den Trigger, insbesondere selektive Translation in erster Linie ausgelöst teilzunehmen. Polysomen-Profilierung ist eine Technik, die effektive Untersuchung beider Prozesse ermöglicht. Das übergeordnete Ziel des Polysom ​​Profiling-Technik ist, um zu studieren und zu quantifizieren Übersetzung Zustand spezifischer mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen. Das Prinzip der Technik ist es, die mRNA-Translation durch &#39;&#39; Einfrieren &#39;&#39; aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte (von mehreren Ribosomen gebunden) erfassen und schlecht übersetzt Einsen (mit einem oder zwei Ribosomen gebunden). In diesem speziellen Protokoll, das Antibiotikum Cycloheximid, die das bindet60S ribosomalen Untereinheit und blockiert die Freisetzung von deacetyliertes tRNA aus dem Ribosom E Park 2, wird verwendet, um Ribosomentranslokation hemmen und Stall Ribosomen an der Übersetzung mRNAs. Aber auch andere Blockierungsmittel, wie Emetin, die auch Blöcke Translationselongation 3, können verwendet werden. Im Gegensatz zu dem Western Blotting und 35 S-Methionin-Markierungstechniken, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses zu messen, Polysomen-Profilierung hat den Vorteil der Messung Ribosomen Verbindung mit aktiv-translatierte mRNAs, wodurch für eine genauere Untersuchung der Übersetzungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen. Daher kann die Technik leicht an spezifisch untersuchen verschiedene Modi der Übersetzung 4-6 werden die Übersetzungsregelung 7-9, Stressbedingungen beeinflussen die Proteinsynthese 1,10,11 oder die Auswirkungen von mRNA-Strukturen wie IRES oder stromaufwärts beteiligten Proteine ​​Faktoren offene Leserahmen auf die Protein synthESIS 12-14. Heutzutage sind Polysom ​​Profilierung Anwendungen noch breiteres mit dem Einsatz von DNA-Microarrays 15 oder Next-Generation-Sequencing 16,17 zu analysieren Polysomen-assoziierte mRNAs.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regulation der Proteinsynthese stellt einen wichtigen Kontrollpunkt in der zellulären Antwort auf Stress. Insbesondere wurden diskreten RNA Regulationselemente gezeigt, die selektive Translation bestimmter mRNAs, die für Proteine ​​codieren typischerweise für eine bestimmte Stressantwort erforderlich zu ermöglichen. Identifizierung dieser mRNAs als auch die Charakterisierung von regulatorischen Mechanismen für die selektive Translation verantwortlich ist, an der Spitze der molekularen Biologie seit einiger Zeit. Polysom ​​Profilierung ist ein Eckpfeiler Verfahren in diesen Studien. Das Ziel Polysom ​​Profilierung ist es, mRNA-Translation durch Immobilisierung aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte erfassen und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte und schlecht übersetzt Einsen. Diese können dann durch traditionelle biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert werden. Wichtig ist, dass die Kombination von polysome Profilierung mit hohem Durchsatz genomische Ansätze erlaubt eine groß angelegte Analyse der Translationsregulation.

Wir haben kürzlich eine neue Rolle für das Tumorsuppressor Pdcd4 als selektiver Inhibitor der Übersetzung IRES-tragenden mRNAs Apoptoseinhibitoren XIAP und Bcl-xL 12. Polysom ​​Profilierung war eine Schlüsseltechnik, um die spezifische Beteiligung von Pdcd4 in IRES-vermittelte Übersetzung zu demonstrieren. HEK293-Zellen wurden transient transfiziert endogenen Pdcd4 (1A) führen und dann einer Profilanalyse Polysomen. Wir haben beobachtet, dass die Reduzierung des Niveaus Pdcd4 nicht globalen zellularen Übersetzung beeinträchtigt, wie durch das Fehlen von Änderungen der Polysomen-Profil im Vergleich siCTRL und siPDCD4 behandelten Zellen (1B) beurteilt. Ebenso Polysomen Verteilung nicht-IRES Variante XIAP 19 unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Dagegen Polysomen Verteilung der beiden IRES-tragenden mRNAs, XIAP und Bcl-xL, signifikant verändert. In der Abwesenheit von PDCD4 die Verteilung dieser beiden mRNAs in schweren ribopolysomes (1D, E) verschoben. Da dies nicht durch Veränderungen in der Steady-State-Niveaus von XIAP und Bcl-xL mRNA (1F) diesen Ergebnissen begleitet weisen eine verbesserte Übersetzung von XIAP und Bcl-xL in Zellen mit vermindertem Pdcd4 Ebenen, die durch Western Blot (Abbildung bestätigt wurde 1G). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Fig. 1: Polysomen Profilierung identifiziert Pdcd4 als selektiver Inhibitor von XIAP und Bcl-xL-Übersetzung (A) HEK293-Zellen wurden mit Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) behandelt, nicht-Targeting siRNA, lysiert und mit Anti-Pdcd4 Western-Blot-Analyse unterzogen, und Anti-Nucleolin Antikörper, um das Ausmaß des Pdcd4 knock-down zu überprüfen. (B) Pdcd4 wurde verkleinert, wie in (A) klopfte undZelllysate wurden einer Profilierung Polysom. Repräsentative Polysom ​​Profil wird im oberen Bereich angezeigt; Verteilung des XIAP IRES nicht (C) wird Bcl-xL (D) und XIAP IRES (E) mRNAs relativ zu der GAPDH als Prozentsatz der Gesamt-mRNA (% mRNA) in jeder Fraktion gezeigt. (F) stetig -state mRNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR in Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) siRNA behandelten Zellen gemessen. (G) Die Lysate aus (A) wurden auch Western-Blot-Analyse mit anti-XIAP, anti-Bcl-xL und ausgesetzt Anti-Nucleolin Antikörper. (NB. Die dargelegten Daten in Abbildung 1 wurden ursprünglich in 12 veröffentlicht) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Aufrufe.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Serie: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Forschung

Biochemie

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Entwicklungsbiologie

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biologie

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...