DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.

הערה: כל הניסויים שתוארו כאן היו בהתאם להנחיות ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) ואושרה על ידי בית החולים לבעלי חיים למחקר לילדים (קשת), בוסטון, מסצ&#39;וסטס. 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורסת 1,000x IL-4: מדוללים ציטוקינים IL-4 עד 20 מיקרוגרם / מיליליטר בH 2 O או 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA). לוותר ב200 aliquots μl 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1,000x אנטי CD40: השג מהיצרן ברמה של 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר, חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת גירוי תא B: כדי 425 מיליליטר של מדיום RPMI-1640, להוסיף 75 מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי (FCS), 10 מיליליטר של 1.0 חיץ M HEPES, מניית L-גלוטמין 5 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין: מניית סטרפטומיצין, 5 חומצות אמינו μl מיליליטר מינימאלי חיוני בינוני שאינו חיוני (MEM-NEAA), ו -3.5 של 2-mercaptoethanol. שמור תקשורת ב 4 C עד שבוע. הוספת IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) מייד לפני השימושרק להיקף המדיה הדרושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% FCS-FACS מאגר: הוסף 10 מיליליטר של FCS ל -490 מיליליטר של 1x PBS. לשמור על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2x טריפסין-EDTA: לדלל 5 מיליליטר של 10x פתרון טריפסין-EDTA מניות (טריפסין 5.0 גר &#39;, EDTA 2.0 גר&#39; לכל ליטר) ב 20 מיליליטר של 1x PBS. חנות טריפסין-EDTA ב2x עובד aliquots ב 4 מעלות צלזיוס. לאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עגל בסרום עוברי: שמור FCS המופשר ב 4 C עד שבועיים. מניחים על קרח 15 דקות לפני ההליך מכתים cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורמלין שנאגרו ניטראלי: הכן פתרון 10% פורמלין (paraformaldehyde 3.7%). פורמלין הוא רעיל ולכן להתמודד עם זה מתחת למכסת מנוע קטר מעבדה כשהוא לבוש PPE המתאים. פורמלין לאחסן בטמפרטורת חדר בארון אחסון כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנול: מתנול החנות המוחלט (100%) ב -20 ° C עד שהתאים מוכנים להיות permeabilized. הערה מתנול שהוא דליק וצריך להיות מאוחסן במקפיא מתאים. </li></ol> 2.טיהור והפעלה של תאי B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטחול עכבר טרי שנקטפו, להכין השעיה תא בודדת על ידי הלחיצה בעדינות את האיבר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר. בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר, לאסוף תאים ב 10 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את גלולה supernatant וגלול ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing הצפת למשך 5 דקות. לנטרל עם 13.5 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגנטי נפרד (אופציונאלי) תאי B באמצעות אנטי CD45R (B220), שכותרת חרוזים, בעקבות פרוטוקול טיהור MACS לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר תאי B מטוהרים ברמה של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת גירוי תא B חימם המכילה IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 ימים על 37 מעלות צלזיוס. התחל עם 8 מיליליטר של התרבות מחולק ל 2 בארות של צלחת תרבות 6 היטב (4 מיליליטר כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק cultuמחדש מדי יום כדי לשמור על 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. התאם את הריכוז על ידי פיצול לתוך בארות אחרות ודילול התרבות עם תקשורת גירוי B תא המכילה IL-4 הטרי ואנטי-CD40. </li></ol> 3. trypsinization, קיבוע, וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עד 1.0 x 10 7 של תאים בתרבית בצינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 10 מיליליטר של PBS להסיר את החלבון שיורית מתקשורת אוסף תא. חזור על שלב צנטריפוגה ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בהיקף הנותרת לאחר decanting (כ -100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 800 μl של טמפרטורת חדר 0.1% (2x) טריפסין-EDTA לתאים. לוותר לאט בזווית של 45 מעלות כלפי מטה בצד של צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינור ומערבבים בעדינות על ידי הטיית הצינור כך הנוזל פועל לאורכו של זמן צינור 5-6s. משקע סיבי, לבן עלול להיווצר בפתרון. הגבל את זמן trypsinization לתחת דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תגובת trypsinization עם 1 מיליליטר של FCS הקר. לדלל את FCS מייד על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, אז למזוג supernatant ולהחזיר את הצינורות לקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בהיקף הנותרת לאחר decanting. במידת צורך, להביא נפח עד עם PBS הקר 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף, להוסיף 800 μl של 10% פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין לתאים וpipet למעלה ולמטה. הצינור יחמם על התוספת של פורמלין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מיקסר מערבולת benchtop במהירות רועדת עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר 9 מיליליטר של (-20 ° C) מתנול הקר לpipet סרולוגיות 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הצינור המכיל את התאים על פני מיקסר המערבולת בעדינות להתחיל שקיןg התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתנול קר לצינור, כך שהוא נופל dropwise על גבי התאים תוך הצינור עדיין רעד כל כך שמתנול הוא הערבוב ברציפות. לאחר 2 מיליליטר הראשון של מתנול מהירות מחלק יכולה להיות מוגברת לזרם איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הצינור לשבת על קרח למשך 30 דקות כדי להשלים את permeabilization. לחלופין, ניתן לאחסן את התאים ב -20 ° C עד חודש. </li></ol></li></ol> 4. הקרינה מכתים לIgG1 ומיתוג IgE כיתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ולמזוג את פתרון מתנול. משקע לבן עשוי גלולה עם התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של בטמפרטורת חדר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים. חזור פעם אחת. הערה: כביסה גלולה עם טמפרטורת חדר PBS מתמוססת משקע נוסף שעלולות להיווצר לאחר שלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה נוספת עם 10 מיליליטר של 2% חיץ FCS-FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ דוגמאות ל96-גם סיבוב צלחת תחתונהו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant ולשים את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ב -60 μl של 2% חיץ FCS-FACS לכל גם עם דילולים הנוגדן הבאים: Anti-IgM הרשתית / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות של מכתים, לשטוף את הצלחת עם 150 μl של 2% חיץ FCS-FACS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב400 μl של 2% חיץ FCS-FACS וpipet דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS 5 מיליליטר. </li></ol> 5. השתמש באסטרטגית gating בעקבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד CD45R (B220) תאים חיוביים מאוכלוסיית הלימפוציטים פיצוץ ממוקמת על חלקת FSC / SSC (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהתאים החיוביים B220, להשתמש בעלילת IgE וIgG1 לחשוף האוכלוסיות המתאימות. </li></ol>

<ol>
	<li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism.">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li><li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE+in+allergy+and+asthma+today.">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li><li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunoglobulin E. Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li><li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production.">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li><li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation.">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li><li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+(Fc+epsilon+RII/CD23):+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression.">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4.">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li><li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses.">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions.">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li><li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li><li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S&#181;+to+S&#949;+recombination.">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct S&#181; to S&#949; recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li><li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination.">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li><li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk.">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li><li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades.">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).</li><li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li><li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH.">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li><li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo.">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li><li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies.">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li><li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE(+)+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition.">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li><li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgE(+)+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li><li>He, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE++B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response.">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li><li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI.">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li></ol>

The authors have no disclosures.

גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B היא אופציונלית, ונתונה לשיקול דעתו של הנסיין כדי לקבוע אם הוא היית מועיל. הפרדה מגנטית חיובית של תאי B באמצעות CD45R (B220), שכותרת חרוזים מנוצלים כאן. לאחר הפרדה, מומלץ לבדוק את טוהר התא על ידי FACS, כך שריכוז תאי B יכול להיות מותאם ל1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר לציטוקינים נכונים וגירוי נוגדן. כמו כן יש לציין כי IL-4 חלבון שעבר מחזורי הפשרת הקפאה / אולי ירידה בפעילות. Trypsinization של תאים לפני הקיבוע וpermeabilization מאפשר לaccurאכלתי מדידה של מיתוג בכיתה באמצעות cytometry זרימה (איור 2). trypsinization התקין של התאים חיוני ליישום המוצלח של הליך זה. כFCS יכול לעכב טריפסין, לשטוף PBS 1x מתבצע לפני שלב trypsinization. מצאנו דגירה 30 שניות בטמפרטורת חדר מספיקה לעיכול מלא. משכי זמן ניכר יכולים להשפיע על כדאיות תא. לפני הניתוח, זה חיוני כדי לשטוף את התאים מספר פעמים עם PBS להסיר עקבות מתנול. שריד מתנול עשוי לשנות נוגדן מחייב 13 ויכול לזרז חלבונים מFCS המשמשים בניתוח cytometric זרימה במורד הזרם 14. בהקשר זה, בשיטות permeabilization אחרות (כלומר saponin) עשויות להיות חלופה לשימוש מתנול. מתנול הוא ממס אורגני שמתמוסס שומני קרום, ואילו חומרי ניקוי לשבש שלמות קרום 15. הטבה לpermeabilization מתנול היא היכולת של אחסון מורחבשל תאים קבועים ב -20 ° C 14. ישנן מספר מגבלות שכדאי לזכור בעת שימוש בהליך זה. בגלל טריפסין שאריות חלבון דבק, כמה כתמי FACS עשויים להיראות שונים לאחר טיפול, או עלול לאבד את היכולת לרתק למקד epitopes לגמרי. בנוסף, הפסד במספר תאים לאחר טיפול טריפסין יכול להתרחש. עם זאת, זו אינה מופיעה כדי להשפיע על הדיוק של מדידות IgE CSR כפי שמצאנו בשיטה זו כדי להיות ברור דומה לנתונים שנאספו ממיתוג כיתת מדידת הפרשות הנוגדן של שיבוטים hybridoma פרט 11. שיטות אחרות כבר דיווחו לאתר B עכבר תאי IgE-ייצור. שיטה אחת משתמשת בהליך לשטוף את חומצה כדי להסיר IgE-מחויב קולט לפני מכתים לIgE קרום הנכנס בIgE להביע תאים 16-18. שיטה אחרת משתמשת נוגדן אנטי IgE monoclonal לחסום את כל פני השטח IgE לפני permeabiliz התאation וצביעה לIgE תאיים של התאים IgE להביע 19. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה צדודית פנל FACS שמונה צבע לזיהוי אוכלוסיות תאי B עברו-IgE בבני אדם על ידי נטרול IgM +, IGD +, IgG + ותת תא IgA + B 20. בהשוואה לשיטות אחרות אלה, השיטה המתוארת כאן תמנע את השימוש של denaturing שוטף חומצה, ונוגדנים עודפים אינם נחוצים. הטבה להליך זה היא שזה לא יקבע נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים למדידת CSR לIgE. נוגדנים חד שבטיים נגד IgE אלטרנטיביים הוכחו לזהות מולקולות IgE אנדוגני בלבד. שיבוט hybridoma R1E4 מייצר נוגדנים חד שבטי IgE-עכבר עכברוש אנטי ספציפיים רק למולקולות פני השטח אנדוגני, לא IgE cytophilic חייב CD23 21,22, אך אינו זמין באופן מסחרי. הפרוטוקול שתואר לעיל הוא נוח וחסכוני משום שהיא משתמשת ריאד מעבדה המשותףNTS. הנוגדן אנטי IgE משמש כאן סביר נקשר לIgE באתר רגיש למחשוף בתיווך טריפסין, כי אות IgE בשל IgE cytophilic מצטמצמת לאחר טיפול בכריכת קולט (איור 2). עם זאת יש לחוקרי ביצוע פרוטוקול זה חופש לבחור מתוך מגוון רחב של שיבוטים זמינים המסחרית לניסויים. יתר על כן, הרעיון של שימוש טריפסין להסיר חלבונים בתא שטח יכול להתארך עד לגילוי של סמני תא אחרים על ידי ניתוח FACS.

במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 &#39;לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine. IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE. מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:301px;">Name</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:343px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Mouse IgE FITC</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553415</td>
			<td>clone R35-72</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550083</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>Keep at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Falcon Cell Strainer 70 &#181;m Nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>45-4052-82</td>
			<td>clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">anti-Mouse/Rat CD40</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0402-85</td>
			<td>clone HM40-3</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MEM-NEAA (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Phosphate Buffered Saline (10X)</td>
			<td>Lifetechnologies (Corning)</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:67px;">MACS CD45R (B220) microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-049-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">MACS purification column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">IL-4</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>214-14</td>
			<td>Reconstitute in water or 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Trypsin-EDTA Solution (10X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4174-100mL</td>
			<td>5.0g Trypsin, 2.0g EDTA&#376;4Na per Liter of 0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100mL</td>
			<td>10,000U Penicillin; 10 mg/mL Streptomycin (100X)</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">2-mercaptoethanol (99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Red cell lysis buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Rat Anti-Mouse IgM RPE/cy7</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1140-17</td>
			<td>clone 1B4B1</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">HyClone Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;">B cell Stimulation media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:343px;">B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1X MEM-NEAA, 2.0mM L-glutamine,&#160; 1X Penicillin-Streptomycin (Penicillin:100 U/ml, Streptomycin: 100 &#181;g/ml), Beta-mercaptoethanol (7 &#181;L/L), IL-4 (20 ng/mL), and anti-CD40 (1 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of true ige-expressing mouse b lineage cells

שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.

הליך זה יושם בהצלחה ללמוד CSR לIgE בB עכבר תאים. כדי להדגים את היעילות במדידת CSR, אנחנו מגורה תאי B טחול עכבר עם אנטי CD40 וIL-4 כפי שתואר לעיל 11. לאחר חמישה ימים של גירוי, תאים נאספו ועובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל ומוכתם עם fluorescently שכותרתו IgM, IgG1, IgE, וB220 נוגדנים (CD45R). מגודר על לימפוציטים מסוג פיצוץ (איור 1), אוכלוסייה ברורה של IgE + תאים לא יכול להיות מופלה בצורה נקיה ללא טיפול טריפסין (איור 2 א). עם זאת, trypsinization של תאים לפני הקיבוע וpermeabilization מאפשר הפרדת תאי IgE-הייצור (איור 2b) עקב ההסרה של IgE-מחויב פני השטח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52264/52264fig1highres.jpg" /> איור 1: forwלימפוציטים מסוג ארד לעומת פיזור צד עלילת FACS של תאי B טחול עכבר לאחר 5 ימים של גירוי בתרבות עם IL-4 ואנטי-CD40. פיצוץ מרכיבים 63% מכלל רכש את האירועים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52264/52264fig2highres.jpg" /> איור 2:. אפקט של טריפסין על מכתים cytoplasmic של IgE וIgG1 בתאי B מופעלים (a, b) מגרשי FACS (לעיל) והיסטוגרמות (להלן) מגודרים על פיצוץ תאי B טחול מעכברי 129 רקע מעורבים / B6 לאחר הפעלה בתרבות במשך 5 ימים עם אנטי CD40 וIL-4. קיבעון וpermeabilization מתנול לבד (א) ועם תוספת של טריפסין (ב) מוצג.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells at JoVE.com

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Video: Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

ניתוח מהיר של סטיות כרומוזום בעכבר לימפוציטים מסוג B על ידי הרשות הפלסטינית-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully investigate MCPyV molecular biology and oncogenic mechanisms have been hampered by a lack of adequate cell culture models. Here, we describe a set of protocols for performing and detecting MCPyV infection of primary human skin cells. The protocols describe the isolation of human dermal fibroblasts, preparation of recombinant MCPyV virions, and detection of virus infection by both immunofluorescent (IF) staining and in situ DNA-hybridization chain reaction (HCR), which is a highly sensitive fluorescence in situ hybridization (FISH) approach. The protocols herein can be adapted by interested researchers to identify other cell types or cell lines that support MCPyV infection. The described FISH approach could also be adapted for detecting low levels of viral DNAs present in the infected human skin.

Here, we present a protocol to infect primary human dermal fibroblast with MCPyV. The protocol includes isolation of dermal fibroblasts, preparation of MCPyV virions, virus infection, immunofluorescence staining, and fluorescence in situ hybridization. This protocol can be extended for characterizing MCPyV-host interactions and discovering other cell types infectable by MCPyV.

Polyomavirus מרקל זיהום וזיהוי

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...