This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בחלק ממיני צמחים, כגון פשתן (usitatissimum Linum), שינוי מפעל מוצלח היה מוגבל. בעבר, שינוי בפשתן דרש זיהום Agrobacterium ידי פצע ושיתוף טיפוח, יישום חלקיקי biolistic או באמצעות sonication אולטרסאונד, ואחריו התחדשות; תהליך שהוא גם ארוך ונוטה להיות מלווה באירועי מוטאציות רבים. יתר על כן, תהליך הבחירה של טכניקות אלה מחייב השימוש בסמנים לבחירת אנטיביוטיקה כגון kanamycin. עם זאת, זה כבר ציין בספרות כי שיטה זו של בחירה מייצרת הרבה תוצאות חיוביות שגויות, כפשתן נוטה לברוח ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה 6,9,14. חסרון נוסף של הטכניקות הקודמות בשינוי פשתן היה שיעורי שינוי הנמוכים 2,6. בפרוטוקול המתואר כאן, שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחונית-טבילה הוצגלהביא לשיעור שינוי גבוה לפשתן (50 - 60%). Transformants התקבל מפרחים טבלו ונאספו מענפים ראשיים וצד. בחירה של transformants החיובי פשוט על ידי גידול צמחי T1 על אדמה והקרנת העלים שלהם זמן קצר לאחר שהם נבטו, השימוש באנטיביוטיקת הבחירה עובר-ידי, צעד ששמש בעבר כנורמה בפרחוני לטבול למיני צמחים אחרים. על ידי ביצוע בדיקות PCR ישירות של עלים, ותוך שימוש בפריימרים T-DNA המתאימים, transformants החיובי ניתן לבחור במהירות. טכניקה זו היא פשוטה, זולה וקלה לביצוע, אך תוצאות בשיעור שינוי גבוה בהרבה מאלה שדווחו בעבר לארבידופסיס ומיני צמחים אחרים בשיטה זו 1,10,12. כמו כן, שיעור השינוי המדווח הגבוה ביותר לפשתן. עם זאת, ישנם צעדים קריטיים בהליכים, לרבות הבחירה של שלב הפרח הטוב ביותר ואת ריכוז החומרים פעילי השטח הטוב ביותר, כך שAgrobacterium יכולה לחדור לתוך תאי הצמח בלי להרוג את איברי הפרח. אם שלב מוקדם ניצן משמש (איור 2 א) עם Silwet-77 ריכוז גבוה של יותר מ 0.05%, הפרח לא יתפתח ולא להגדיר זרעים. אם שלב מאוחר ניצן משמש (איור 2 ג), אם כי ייתכן שהשינוי יעבוד, זה יתרחש בקצב נמוך בהרבה. תוצאות דומות התקבלו עם שינוי לטבול פרחוני ארבידופסיס 1,4. לפרוטוקול זה, את כל השלבים פרחוניים נבדקו עם Silwet-77 ריכוזים שונים והבמה הטובה ביותר הייתה נחושה להיות שלב ניצן האמצע (איור 2 ג) עם Silwet-77 על 0.05% לטבילה הראשונה, ואחריו טבילה שנייה ב שלב הניצן המאוחר (איור 2 ג) עם ריכוז Silwet-77 מעט מופחת של 0.03%. השינוי גם עבד היטב באמצעות שלב הניצן המוקדם (איור 2 א) עם silwet-77 ריכוז נמוך של 0.003%, ואחריוטבילה שנייה עם שלב ניצן אמצע (איור 2) בSilwet-77 ריכוז גבוה יותר של 0.05%. בפרוטוקול זה, כמה פרמטרים אחרים ניסו לייעל את שיעור השינוי, אבל מצאו שאין לו השפעה על התוצאה הסופית. דוגמאות כוללות הארכת הזמן לאחר הטבילה שהצמחים שכבו על הצד שלהם ומכוסים בפלסטיק מיום אחד ליומיים; באמצעות OD של יותר מ 1 לתרבות Agrobacterium, במקום 0.5-1; להגדיל את זמן טבילה - 5, 15 דקות במקום 1-2 דקות. שוב אנחנו לא שמתנו לב כל השפעה על שיעור השינוי באמצעות אסטרטגיות אלה. הגורמים היעילים ביותר, עם זאת, נמצאו כי שימוש בצמחים בריאים בשלבי הפרח הנכונים, ובאמצעות ריכוז Silwet-77 הטוב ביותר. שם לב ששני מרווחי טבילה, עובד איכשהו זמן טוב יותר מאשר אחד, אף על פי שטבילת פעם אחת גם עובדת. שינוי לפרוטוקול זה יכול להיות מושגת על ידי reducin<html> g ריכוז Silwet-77 לקטנים כמו 0.003% בטבילה השנייה או שלישית. מאז Silwet-77 הוא רעילים, תוצאות ריכוז גבוהות מדי בפרחים מתפתחות בצורה גרועה, וכתוצאה מכך אין תשואת זרע. תדירות הטבילה יכולה להיות מופחתת לאחד, עם האירועים שני או שלישיים בוטלו אם הצמחים לא מחפשים בריאים והניצנים אינם מתפתחים היטב. מגבלה העיקרית של שיטה זו היא המספר הנמוך של פרחים המיוצרים על ידי הפשתן, המספר המצומצם של זרעים המתקבלים מכל פרח, ומחזור החיים הארוך של פשתן. זה לוקח 6-8 שבועות מזריעת זרע יש ניצנים הראשוניים מוכנים לטבילה הראשונה ו8 נוספים - לאחר טבילה-10 שבועות כדי להגיע לדור T1. בסך הכל, טווח של 5 - יש צורך 6 חודשים כדי לקבל את דור T1. שלא כמו מיני צמחים אחרים, שפרח בכל עת של השנה, איזה פרח זני פשתן טוב יותר בזמנים מסוימים בשנה. תכנון כל כך מתחשב לטכניקה זו הוא חשוב. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; לסיכום, התוצאות שלנו לטבול פרחוני עם שני סוגי פשתן שונים: פשתן הסיבים, סטורמונט Cirrus (פלסטיק מגיב ו), ופשתן השמן, בתון (היציב ושאינו מגיב), מראים כי Agrobacterium - שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול הוא שיטה ישימה ויעילה לשינוי פשתן והוא יכול לשמש כדי להחליף את הטכניקות ששמשו בעבר לשינוי פשתן. השינויים בשיטה הפרחוני לטבול בפרוטוקול זה יהיו ישימים לשימוש עם כל מיני צמחים אחרים ואינו מוגבל לפשתן.

פשתן (usitatissimum Linum) הוא יבול חשוב גדל באופן נרחב לסיבים ושמניה. הפיכתו של הגנום הפשתן אפשרית עם טכניקות כגון פציעה, זיהום Agrobacterium, ושיתוף טיפוח בתרבית רקמה, יישום חלקיקי biolistic או sonication אולטרסאונד ואחריו התחדשות. עם זאת, יש טכניקות אלה חסרונות רבים, כולל נטייה לאירועי מוטאציות רבות וזמן ממושך כדי להשיג את הקווים מהונדסים. חלק משיטות אלה יכולים להיות גם יקר ודורש מניפולציה מיומנת ויעילה של המכשירים, וכתוצאה מכך שתילי התאוששות נמוכים. והכי חשוב, טכניקה אלה לעתים קרובות מובילה לשיעורי שינוי נמוכים 2,6. שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחוני לטבול הוא גישה פשוטה ויעילה ליצירת צמחים מהונדסים. כבר זה באופן שיגרתי ומשמש בהצלחה למיני צמחים רבים כגון ארבידופסיס thalian1,4, truncatula Medicago 11, עגבניות 12, חיטה ותירס 13 10. עם זאת, זה לא היה נחשב כטכניקה מעשית עבור שינוי פשתן בשל מספר גורמים, כגון מספרים הנמוכים של פרחים המיוצרים על ידי פשתן, מספר מצומצם של זרעים המתקבלים מכל פרח, גודל הזרע הגדול, והמעייל העבה, אשר יכול גם להיות בעייתי עבור תהליך שינוי גנטי כזה. בנוסף, מגזר הבחירה של הטכניקה הפרחונית לטבול דורש נובט זרעים הפכו בתקשורת צמח המכילה אנטיביוטיקה, עם progenies הפך מכובד המבוסס על היכולת שלהם לנבוט ולהישאר ירוקים, בעוד שאינו הופך progenies גם לא לנבוט או לנבוט אבל אקונומיקה במהירות ולמות. בספרות הנוכחית, זה כבר ציין כי פשתן wild-type נוטה לברוח ריכוז גבוה של בחירות אנטיביוטיקה, לייצר תוצאות חיוביות שגויות, ומה שהופך את הבחירה של progenies T1 מבוססעל עמידות לאנטיביוטיקה קשה 6,14 יותר. כמו כן, כאשר ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה נוסף לבחירה בינונית, שיעור השינוי שנצפה ירידה דרמטית 9. בפרוטוקול זה, השתמשנו Agrobacterium והשיטה הפרחונית לטבול להפוך קו של פשתן סיבים, נוצה סטורמונט (תגובה ופלסטיק), אשר הוכח להגיב ללחצים בסביבה על ידי שינוי הגנום שלו 3.5. כדי להתגבר על הבעיה בריחת האנטיביוטיקה, בחרנו לעשות בדיקות PCR ישירות של DNA מעלי T1, במקום בחירה על ידי הוספת האנטיביוטיקה לתקשורת הצמח. אנחנו ניצלנו את האנטומיה הפשוטה של ​​פשתן כדי לעקוב אחר פרחים ספציפיים בעת הטיפול. מערכת מעקב זה אפשרה בחירה של זרעים מפרחים מסוימים ונביטה על אדמה מבלי להוסיף אנטיביוטיקה. transformants החיובי פשוט זוהו על ידי בדיקות DNA המתקבל מעלים באמצעות o השיטה מהירה והיעילהPCR הישיר f. התוצאות שלנו מראות כי השיטה הפרחונית לטבול עבדה טוב מאוד בקו הזה של פשתן והביאה באופן מפתיע בשיעור גבוה מאוד שינוי (50 - 60%), גבוה מאלו שנצפו בעבר עבור thaliana ארבידופסיס, אשר דווח להיות 0.1-1 1%, וגבוהים גם ממיני צמחים אחרים 10,12. גם בדקנו מגוון נוסף של פשתה (פשתן שמן), בתון (יציב ושאינם מגיב), ונתונים הראשוניים שלנו מצביעים על כך שפרחים לטבול פועל גם עבור מגוון זה של פשתן. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות שAgrobacterium ופרחונית לטבול יכולים לשמש כדי ליצור פשתן מהונדס. אנו מראים כי טכניקה זו היא פשוטה, זולה, ומהירה יותר מאשר שיטות אחרות של שינוי פשתן. יותר חשוב זה תוצאות בשיעור שינוי גבוה בהרבה מהשיטות האחרות של שינוי פשתן 2,6. האנטומיה של thaliana ארבידופסיס, שיש לו סניפים ופרחים רבים, maKES זה קשה להבחין טבל ולא טבל פרחים על אותו הצמח. לכן, מספר גדול של זרעים, כ -20,000 זרעים לכל צמח, צריכים להיות מוקרנים לזהות transformants החיובי 8. פשתן, לעומת זאת, יש פחות סניפים (סניף אחד עיקרי ומעט תופעות סניפים) ופחות פרחים, הפקה כ -100 זרעים לצמחים, המאפשרים לעקוב אחר פרחים בודדים וכדי לבחור זרעים מסוימים במהלך הקרנת תהליך. אנו מציעים כי פרחוניים לטבול הוא שיטה ישימה כדי להפוך כל מינים קרובים של פשתן, סוג של כ -200 מינים. שיטה זו נותנת שיעור שינוי גבוה בהרבה מאשר שיטות אחרות של שינוי פשתן. כמו כן, אנו מציעים שהקרנת PCR הישירה של T1 עלה DNA היא דרך יעילה כדי להתגבר על הבעיה של בריחת עמידות לאנטיביוטיקה, כי לעתים קרובות מייצרת הרבה תוצאות חיוביות שגויות. הקרנת PCR ישירה יכולה להיות מיושמת על כל מיני צמחים אחרים ואינה מוגבלת to פשתן. טכניקת מעקב זרע הפשוטה המועסקות בפרוטוקול זה יכול להיות מיושמת על כל מיני צמחים אחרים עם הסתעפות האנטומיה דומה לפשתן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחוני לטבול הוא טכניקה המשמשת באופן נרחב בתחום של שינוי צמח וכבר דווח כמוצלח עבור מיני צמחים רבים. עם זאת, פשתן שינוי (Linum usitatissimum) על ידי פרחוני לטבול כבר דווח. לא המטרה של פרוטוקול זה היא להקים Agrobacterium ושהשיטה הפרחונית לטבול יכולה לשמש כדי ליצור פשתן מהונדס. אנו מראים כי טכניקה זו היא פשוטה, זולה, יעילה, ויותר מכך, נותנת שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות של שינוי פשתן. לסיכום, תפרחות של פשתן היו טבולות בתמיסה של Agrobacterium ביצוע פלסמיד ינארי וקטור (בר T-DNA בתוספת רצף הכנסת Linum, LIS-1) 1 - 2 דקות. הצמחים הונחו שטוחים בצד שלהם למשך 24 שעות. לאחר מכן, צמחים נשמרו בתנאי גידול נורמלים עד הטיפול הבא. לעיבודים של טבילה חזר על עצמו 2-3 פעמים, עם כ 10 - מרווחי יום 14 בין הטבילה. זרעי T1 נאספו ומונבטים על אדמה. לאחר כשבועיים, progenies טופל נבדקו על ידי PCR הישיר; 2-3 עלים שמשו לכל צמח בתוספת פריימרים T-DNA המתאימים. transformants החיובי נבחרו וגדל לפדיון. שיעור השינוי היה באופן בלתי צפוי גבוה, עם 50 - 60% מהזרעים מצמחים שטופלו להיות transformants החיובי. זהו שיעור שינוי גבוה יותר מאלו שדווחו לthaliana ארבידופסיס ומיני צמחים אחרים, באמצעות שינוי פרחוני לטבול. זה גם הגבוה ביותר, אשר כבר דיווח עד כה, לשינוי פשתן בשיטות אחרות לשינוי.

איור 1 - 4 להמחיש כמה הצעדים בתוך הפרוטוקול. באיורים 1 ו -2, העלים סביב ניצני התפרחת נחתכים לחשוף אותם לתאי Agrobacterium והשלבים השונים הניצן ששמשו לפיתוח הפרוטוקול. איור 3 מציג את התהליך של פרחים לטבול פשתן. איור 4, תערוכות דוגמא לאופן שיכול להיות מתויגים הענפים העיקריים ולוואי וכיצד פרט פרחים יכול להיות במעקב ומזוהה. איור 5 מראה כיצד ניתן מונבטים progenies T1 בתקשורת צמח MS ולאחר מכן הושתל בקרקע לבגרות. איור 6 מדגים כיצד רושף פשתן סוג יכול לברוח ריכוזים גבוהים של kanamycin, המאשר ממצאים קודמים בספרות 6,9,14. איור 7 מראה דוגמא של ההגברה PCR ישירה מtransformants T1 החיובי. פרחי T1 נאספו ממ &#39;<html> יורה עין והצד השני של מפעל T0 יחיד. כפי שניתן לראות מPCR הישיר, 8/12 צמחי T1 נבדקו חיוביים על ידי PCR והעצימו אזורים השונים ברחבי T-DNA. פריימרים שלנו גם נועדו בין LIS-1 הכנס ומספר אתרי שיבוט (איור 7 ו- C). אנחנו השתמשנו פריימרים נוספים מהווקטור בינארי הצמח כדי להגביר מגזרים שונים של T-DNA, כגון הגבול השמאלי ושליחות קטלנית NOS (מידע לא מוצג) או גבול הימני ואתר מרובה שיבוט (איור 7D). פריימרים ספציפיים להוספת LIS-1 גם בשימוש בפרוטוקול זה (מידע לא מוצג). רשימה של פריימרים מסופקת בטבלה 1. עם זאת, הרצפים של פריימרים אלה תלויים ברצף של הווקטור בינארי צמח T-DNA ולהוסיף המשמש את הפרחים לטבול. אנחנו גם ציינו כי לא היה הבדל משמעותי בשיעור השינוי בין הפרחים שנאספו מהענפים הראשיים וצד. p-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" /> איור 1. חיתוך העלים סביב ניצני התפרחת העיקריים לחשוף אותם לתאי Agrobacterim. () הניצנים מכוסים על ידי עלים. עלים (ב) קוצצו סביב הניצנים לחשוף אותם. (ג) מוגדל תמונה ממפעל ב (א) לאחר החיתוך לחשוף ניצנים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> איור 2. שלבי הניצן השונים ששמשו בפרוטוקול זה כדי לקבוע את השלב הטוב ביותר לשימוש עבור לטבול הפרחוני. () ניצן השלב מוקדם הוא approxima<html> tely 2 מ&quot;מ. ניצן שלב ביניים (B) הוא כ 5 מ&quot;מ. (C) ניצן השלב המאוחר הוא כ כ 1 סנטימטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> איור 3. התהליך של פרחים-טבילת פשתן. () התפרחות העיקריות הם טבלו בתקשורת החדירה המכילה את תאי Agrobacterium. (B) מוגדל מ(). (ג) הצמחים טבולים מונחים שטוחים עד ליום המחרת, והסניפים טבלו מכוסים בפלסטיק כדי לשמור על לחות גבוהה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> jove_content &quot;fo: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> סניפי איור 4. התהליך של אוספי מעקב פרחים וזרעים, מצמחי T0 טופל () דוגמא של הצמח כולו עם הסניף הראשי (הסניף הגבוה ביותר במרכז) והן בצד (B - D).. . דוגמא של פרחים מהענפים השונים (E) דוגמא של הזרעים שנאספו מפרחים בודדים (שכותרתו - k). מהסניף הראשי <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> איור 5. שתילי T1 גדלים ללא בחירת אנטיביוטיקה. (א) זרעי T1 הםמונבטים על תקשורת צמח MS. (B) transformants חיובי, כפי שנקבע על ידי PCR הישיר, מושתלים לאדמה וגדל לפדיון. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> איור 6. בריחה אנטיביוטיות, בעיה לבחירת T1, הוא להתגבר על ידי הקרנת PCR ישירה. זרעי פשתן () Wild הסוג מונבטים בתקשורת צמח MS ללא אנטיביוטיקה. זרעי פשתן (B) Wild הסוג מונבטים בתקשורת צמח MS + ריכוזי הגדלת של kanamycin (200 מיקרוגרם / מיליליטר, 600 מיליליטר / ק&quot;ג, 1 מ&quot;ג / מיליליטר). הזרעים (C) Wild סוג פשתן מונבטים בתקשורת צמח MS עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר kanamycin. (ד) PCR מפשתן wild-type וT1 שתיל באמצעות פריימרים kanamycin, כל amplified גן kanamycin (אגדות: EZ1: סמן DNA, FlaxS, flaxS wild-type, C: לשלוט שאינו טבול סניף, מא: צאצאי T1 מפרח &quot;&quot; שנאסף מהסניף הראשי, Sc, SD, Se, מדע בדיוני: progenies T1 של פרחים שונים &quot;ג, ד, ה, ו&quot; שנאספו מהענף הצדדי, W:. לא-DNA) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> איור 7. דוגמא של amplifications PCR המוצלח של progenies T1 בשיטת PCR הישירה. (א) תרשים של הווקטור בינארי הצמח + להוסיף LIS-1 המשובט. חיצים כחולים מציינים את המיקום של פריימרים PCR משמשים בהקרנה הישירה PCR (שונה מTakara). (ב) PCR עם פריימרים M13F + 3 &#39;(C) PCR עם פריימרים M13R + 18a <strong&gt; (D) PCR עם פריימרים גבול תקין (RB) ואתר שיבוט מרובה (MCS) ** כל נתיב מייצג T1 מפרחים בודדים שנאספו מC: סניף שליטה (לא טבל), M: ag פרח הסניף הראשי, S: bc פרח ענף הצדדי &#39;. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מקור רצף פריימר קדימה </td><td> רצף 5&#39;-3 &quot; </td><td> מקור רצף פריימר הפוך </td><td> רצף 5&#39;-3 &quot; </td><td> טמפ חישול (° C) </td><td> הארכת זמן (שניות) </td><td> גודל צפוי (נ&quot;ב) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 להוסיף) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18 א (LIS-1 להוסיף) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. חלק מפריימרים המשמשים לבדיקת PCR הישירה.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.0K Views.  Case Western Reserve University.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

אגרובקטריום -תווךטרנספורמציה גנטית, ייצור טרנסגנית, ויישום שלה לחקר התפתחות הרבייה הגברית באורז

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

יישום של תנועת ראש פסיבית ליצירת תאוצות מוגדרות בראשי מכרסמים

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...