This work was supported by the Ogelbay fund.

<ol>
	<li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li><li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+(Linum+usitatissimum+L.).">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax.">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li><li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens.">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li><li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol.">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li><li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2::&#946;-glucuronidase+reporter+gene+expression.">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::&#946;-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -. P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax.">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li><li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium.">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li><li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium.">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li><li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Planta+transformation+of+tomato.">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li><li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li><li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes.">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في بعض الأنواع النباتية، مثل الكتان (LINUM usitatissimum)، كان ناجحا تحول النبات محدود. سابقا، والتحول في الكتان ويتطلب وجود عدوى الأجرعية التي كتبها جرح وزراعة المشترك، تطبيق الجسيمات biolistic أو باستخدام الموجات فوق الصوتية صوتنة، تليها تجديد. عملية في آن معا منذ فترة طويلة وعرضة للأن يرافقه العديد من الأحداث طفرية. وعلاوة على ذلك، فإن عملية اختيار هذه التقنيات تتطلب استخدام علامات اختيار المضادات الحيوية مثل الكانامايسين. ومع ذلك، فقد لوحظ في الأدب أن هذا الأسلوب في اختيار تنتج العديد من ايجابيات كاذبة، كما يميل الكتان للهروب تركيزات عالية من المضادات الحيوية 6،9،14. وكان ثمة عيب آخر من التقنيات السابقة في التحول الكتان انخفاض معدلات التحول 2،6. في بروتوكول الموصوفة هنا، وقد تبين الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار غمسأن يؤدي إلى معدل التحول عالية لالكتان (50 - 60٪). وقد تم الحصول على Transformants من الزهور انخفض والتي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. وقد تم اختيار transformants إيجابية ببساطة عن طريق زراعة النباتات T1 على التربة وفحص أوراقها قريبا بعد أن نبتت، واستخدام المضادات الحيوية-اختيار المارة، وهي خطوة المستخدمة سابقا كقاعدة في الأزهار وتراجع للأنواع النباتية الأخرى. عن طريق إجراء اختبار PCR المباشر من الأوراق، وباستخدام بادئات T-DNA المناسبة، transformants إيجابية يمكن اختيار بسرعة. هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وسهلة لأداء، ولكن النتائج في معدل التحول أعلى بكثير من تلك التي ذكرت سابقا لنبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى باستخدام هذه الطريقة 1،10،12. بل هو أيضا أعلى معدل التحول الإبلاغ عنها من الكتان. ومع ذلك، هناك خطوات حاسمة في الإجراءات بما في ذلك اختيار أفضل مرحلة زهرة وأفضل تركيز بالسطح، بحيثوالأجرعية يمكن أن تخترق الخلايا النباتية دون قتل أجهزة زهرة. إذا تم استخدام مرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع ارتفاع تركيز Silwet-77 أكثر من 0.05٪، وزهرة لم تتطور ولا تعيين البذور. إذا تم استخدام مرحلة أواخر برعم (الشكل 2C)، على الرغم من أن التحول قد عمل، وسوف تحدث بمعدل أقل من ذلك بكثير. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع نبات الأرابيدوبسيس تراجع الأزهار التحول 1،4. لهذا البروتوكول، تم اختبار جميع المراحل الأزهار مع مختلف Silwet-77 تركيزات وتم تحديد أفضل مرحلة لتكون المرحلة برعم المتوسط ​​(الشكل 2C) مع Silwet-77 في 0.05٪ لغمس الأول، تليها غمس الثاني في المرحلة الراحل برعم (الشكل 2C) مع انخفاض طفيف تركيز Silwet-77 من 0.03٪. كما عملت التحول جيدا باستخدام المرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع تركيز منخفض silwet-77 من 0.003٪ تلاهغمس الثاني مع مرحلة برعم المتوسط ​​(الشكل 2B) في أعلى Silwet-77 تركيز 0.05٪. في هذا البروتوكول، وقد حاول بعض المعالم الأخرى لتحسين معدل التحول، ولكن وجد أن له أي آثار على النتيجة النهائية. وتشمل الأمثلة يمتد الوقت بعد غمس أن النباتات تكمن في جانبهم وغطت في البلاستيك من يوم واحد إلى يومين. باستخدام OD أكثر من 1 للثقافة الأجرعية، بدلا من 0،5-1. زيادة الوقت غمس 5 - 15 دقيقة بدلا من 1 - 2 دقيقة. مرة أخرى نحن لم نلحظ أي تأثير على معدل التحول باستخدام هذه الاستراتيجيات. العوامل الأكثر فعالية، ومع ذلك، وجدت أن استخدام النباتات الصحية في المراحل زهرة الصحيحة، واستخدام أفضل تركيز Silwet-77. لاحظنا أن اثنين من فترات غمس، ويعمل بطريقة أو بأخرى الوقت أفضل من واحد، على الرغم من واحد غمس الوقت يعمل أيضا. لا يمكن أن يتحقق تعديل على هذا البروتوكول من قبل reducin<html> ز تركيز Silwet-77 إلى أقل من 0.003٪ في غمس الثاني أو الثالث. منذ Silwet-77 غير سامة، وارتفاع جدا نتائج تركيز في الزهور النامية على نحو رديء، مما يؤدي إلى أي محصول البذور. يمكن الحد من وتيرة غمس إلى واحد، مع الأحداث الثانية أو الثالثة القضاء إذا النباتات لا يبحثون صحي والبراعم لا تتطور بصورة جيدة. وهناك أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية هو انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، وعدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، ودورة حياة طويلة من الكتان. يستغرق 6-8 أسابيع من بذر البذور لديها براعم الأولية جاهزة لغمس أول وإضافية 8-10 أسابيع بعد غمس-للوصول الى جيل T1. في المجموع، ومجموعة من 5 - هناك حاجة إلى 6 أشهر للحصول على الجيل T1. على عكس الأنواع النباتية الأخرى، والتي زهرة في أي وقت من السنة، وبعض أصناف الكتان زهرة أفضل في أوقات محددة من السنة. تخطيط مدروس جدا لهذا الأسلوب هو المهم. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; وباختصار، نتائجنا من تراجع الأزهار مع اثنين من أصناف الكتان مختلفة: الكتان من الألياف، ستورمونت سيروس (البلاستيك استجابة و)، وزيت الكتان، بيتون (مستقر وغير المراعية)، تبين أن الأجرعية - بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق وفعالة للتحول الكتان، ويمكن استخدامها لتحل محل التقنيات المستخدمة سابقا للتحول الكتان. فإن إدخال تعديلات على طريقة الأزهار وتراجع في هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق للاستخدام مع أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس على سبيل الحصر الكتان.

الكتان (LINUM usitatissimum) هو المحصول المهم نمت على نطاق واسع للألياف والزيوت. التحول من الجينوم الكتان هو ممكن مع تقنيات مثل إصابة أو عدوى الأجرعية، وشارك في زراعة في زراعة الأنسجة، وتطبيق الجسيمات biolistic أو صوتنة الموجات فوق الصوتية تليها التجدد. ومع ذلك، هذه التقنيات لها عيوب كثيرة، بما في ذلك الميل إلى العديد من الأحداث طفرية وتمديد الوقت للحصول على خطوط المعدلة وراثيا. يمكن أيضا أن تكون بعض من هذه الطرق مكلفة وتتطلب معالجة المهرة وكفاءة الصكوك، مما أدى إلى انتعاش الشتلات منخفضة. الأهم من ذلك، هذه التقنية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات التحول 2،6. الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو نهج بسيطة وفعالة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. تم بشكل روتيني وبنجاح استخدامه للعديد من الأنواع النباتية مثل نبات الأرابيدوبسيس thalianعلى 1،4، فصة برميلية 11، الطماطم 12، 13 القمح والذرة 10. ومع ذلك، لم يعتقد أنه من كتقنية قابلة للتحول الكتان بسبب عدة عوامل، مثل انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، عدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، وحجم البذور واسع، ومعطف سميك، والتي يمكن أيضا أن يكون مشكلة لمثل هذه عملية التحول الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، والجزء اختيار تقنية الأزهار وتراجع يتطلب الإنبات بذور حولت على وسائل الاعلام النباتات التي تحتوي على مضاد حيوي، مع السلالات تحولت حاليا على أساس قدرتها على الإنبات والبقاء الأخضر، في حين أن السلالات غير حولت إما لا تنبت أو تنبت ولكن التبييض بسرعة ويموت. في الأدب الحالي، وقد لوحظ أن من النوع البري الكتان يميل إلى الهروب تركيز عال من الاختيارات للمضادات الحيوية، وإنتاج نتائج إيجابية كاذبة، وجعل اختيار السلالات T1 مقرهاعلى مقاومة المضادات الحيوية أكثر صعوبة 6،14. أيضا، عندما أضيف على نسبة عالية من المضادات الحيوية إلى وسيلة الاختيار، ومعدل التحول الملحوظ انخفض بشكل كبير 9. في هذا البروتوكول، استخدمنا الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع لتحويل خط من ألياف الكتان، ستورمونت المعلاق (استجابة والبلاستيك)، وهو ما ثبت للرد على الضغوط في البيئة عن طريق تغيير الجينوم 3،5. للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية، اخترنا أن تفعل اختبار PCR المباشر من الحمض النووي من أوراق T1، بدلا من اختيار طريق إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام النبات. ونحن قد استفادت من تشريح بسيط من الكتان لتتبع الزهور محددة في وقت العلاج. يسمح هذا النظام تتبع اختيار البذور من الزهور محددة والإنبات في التربة دون إضافة المضادات الحيوية. وقد تم تحديد transformants إيجابية ببساطة عن طريق اختبار DNA الحصول عليها من الأوراق باستخدام طريقة سريعة وفعالة سو PCR المباشر. وتظهر نتائجنا أن طريقة الأزهار وتراجع عملت بشكل جيد جدا في هذا الخط من الكتان ونتج من المستغرب في معدل التحول عالية جدا (50 - 60٪)، وهي نسبة أعلى من تلك التي لوحظت من قبل لthaliana نبات الأرابيدوبسيس، الذي تشير التقارير إلى أن 0،1-1 ٪ 1، وأعلى أيضا من الأنواع النباتية الأخرى 10،12. نحن أيضا اختبار صنف آخر من بذر الكتان (الكتان النفط)، بيتون (مستقر وغير مستجيبة)، وتشير البيانات الأولية لدينا أن الأزهار وتراجع يعمل أيضا لهذا التنوع من الكتان. والهدف من هذا البروتوكول هو إظهار أن الأجرعية والأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة، وأسرع من غيرها من أساليب التحول الكتان. والأهم من ذلك أنه يؤدي إلى معدل التحول أعلى بكثير من غيرها من أساليب التحول الكتان 2،6. تشريح نبات الأرابيدوبسيس thaliana، التي لديها العديد من الفروع والزهور، يا أماهKES من الصعب التمييز تراجع والزهور غير مغموسة على نفس النبات. لذلك، فإن أعدادا كبيرة من البذور، وحوالي 20،000 البذور للنبات، تحتاج إلى فحص لتحديد transformants إيجابية 8. الكتان، من ناحية أخرى، لديها عدد أقل من الفروع (فرع رئيسي واحد وعدد قليل من فروع جانبية) وعدد أقل من الزهور، وتنتج ما يقرب من 100 البذور في النباتات، مما يجعل من الممكن لتتبع الزهور الفردية واختيار البذور محددة خلال عملية الفرز. ونقترح أن الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق لتحويل أي نوع من الأنواع ذات الصلة من الكتان، وهو جنس من حوالي 200 نوع. هذه الطريقة يعطي أعلى بكثير معدل التحول من الأساليب الأخرى للتحول الكتان. نحن نقترح أيضا أن فحص PCR المباشر من T1 ورقة DNA هو وسيلة فعالة للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية المقاومة التي غالبا ما تنتج العديد من ايجابيات كاذبة. فحص PCR المباشر يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس ر يقتصرس الكتان. تقنية تتبع البذور بسيطة العاملين في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى مع المتفرعة التشريح مماثلة لالكتان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع في مجال تحول النبات وتم الإبلاغ عن أن تكون ناجحة للعديد من الأنواع النباتية. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ الكتان (LINUM usitatissimum) التحول من الأزهار وتراجع. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات أن الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وفعالة، والأهم من ذلك، يعطي معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان. وباختصار، فقد انخفض النورات من الكتان في حل من الأجرعية تحمل البلازميد ثنائي الموجه (جزء T-DNA بالإضافة إلى إدراج تسلسل LINUM، LIS-1) ل1 - 2 دقيقة. كانت قد وضعت النباتات شقة على جانبهم لمدة 24 ساعة. ثم، تم الحفاظ على النباتات في ظل ظروف النمو الطبيعي حتى علاج المقبلة. بروسسوتكررت الصورة من غمس 2-3 مرات، مع ما يقرب من 10-14 فترات اليوم بين غمس. تم جمع بذور T1 ونبتت على تربة. بعد ما يقرب من أسبوعين، تم اختبار السلالات تعامل من قبل PCR المباشر؛ واستخدمت 3 الأوراق للنبات بالإضافة إلى الاشعال T-DNA المناسبة - 2. تم اختيار transformants إيجابية ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. وكان معدل التحول عالية بشكل غير متوقع، مع 50 - 60٪ من البذور من النباتات المعاملة يجري transformants إيجابية. هذا هو معدل التحول أعلى من تلك التي ذكرت لthaliana نبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى، وذلك باستخدام التحول الأزهار وتراجع. بل هو أيضا أعلى، والتي تم الإبلاغ حتى الآن، للتحول الكتان باستخدام طرق أخرى للتحول.

الشكل 1-4 توضيح بعض الخطوات ضمن البروتوكول. في أرقام 1 و 2، ويترك في جميع أنحاء براعم الإزهار يتم قطع لفضح لهم الخلايا الأجرعية والمراحل برعم المختلفة التي استخدمت لتطوير بروتوكول الشكل يظهر 3 عملية الكتان الأزهار وتراجع الشكل 4، يظهر مثال عن كيفية الفروع الرئيسية والجانبية يمكن أن يكون المسمى وكيف الزهور فرد يمكن تتبع وتحديد الشكل 5 يبين كيف يمكن نبتت على السلالات T1 على وسائل الإعلام مصنع MS ومن ثم زرعها في التربة لنضج الشكل يوضح كيف 6 wild- نوع الكتان يمكن الهروب تركيزات عالية من الكانامايسين، مؤكدا النتائج السابقة في الأدب 6،9،14. ويبين الشكل 7 مثال PCR التضخيم مباشرة من transformants T1 إيجابية. تم جمع الزهور T1 من م<html> عين والجانب يطلق النار على محطة T0 واحد. كما يمكن أن يرى من PCR المباشر، واختبارها 8/12 النباتات T1 الإيجابية التي PCR ولقد ضخمت في مناطق مختلفة في جميع أنحاء T-DNA. تم تصميم الاشعال لدينا أيضا بين LIS-1 إدراج والمواقع استنساخ متعددة (الشكل 7B وC). كنا الاشعال إضافية من متجه ثنائي مصنع لتضخيم شرائح مختلفة من الحمض النووي T، مثل الحدود الأيسر وفاصل NOS (لا تظهر البيانات) أو الحد الأيمن وموقع استنساخ متعددة (الشكل 7D). واستخدمت بادئات محددة لإدراج LIS-1 أيضا في هذا البروتوكول (لا تظهر البيانات). وهناك قائمة من الاشعال في الجدول 1. ومع ذلك، فإن تسلسل هذه الاشعال تعتمد على سلسلة من متجه ثنائي محطة T-DNA وإدراج المستخدمة لوتراجع الأزهار. لاحظنا أيضا أنه لم يكن هناك اختلاف كبير في معدل التحول بين الزهور التي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. ف together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" /> الشكل 1. قص الأوراق حول براعم الإزهار الأولية ليعرضهم للخلايا Agrobacterim. (A) وتغطي براعم بواسطة إجازات. وقطعت (B) أوراق حول البراعم لفضح لهم. (C) تضخيم صورة من المصنع في (A) بعد قطع لفضح البراعم. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> الشكل 2. مراحل برعم المختلفة التي استخدمت في هذا البروتوكول لتحديد أفضل مرحلة لاستخدامه في تراجع الأزهار. (A) المرحلة برعم المبكر هو approxima<html> tely 2 مم. (B) المرحلة برعم المتوسط ​​حوالي 5 ملم. (C) المرحلة برعم المتأخر هو ما يقرب من حوالي 1 سم. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> الشكل 3. عملية الكتان الأزهار غمس. وانخفض (A) والنورات الأولية في وسائل الإعلام تسلل تحتوي على خلايا الأجرعية. (B) مكبر من (A). (C) وضعت النباتات انخفض شقة حتى اليوم التالي، ويتم تغطية فروع انخفض مع البلاستيك للحفاظ على الرطوبة العالية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> jove_content &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . الشكل 4. إن عملية تتبع الزهور والبذور مجموعات من النباتات T0 تعامل (A) مثال على مصنع كامل مع الفرع الرئيسي (أطول فرع في الوسط) والجانب فروع (B - D). إن . مثال الزهور من مختلف فروع (E) مثال من البذور التي تم جمعها من الزهور الفردية (المسمى ل- ك). من الفرع الرئيسي <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> تزرع الشتلات الشكل 5. T1 دون اختيار المضادات الحيوية. (A) البذور T1 هينبتت على وسائل الإعلام مصنع MS. (B) transformants إيجابية، على النحو الذي يحدده PCR المباشر، يتم زرعها في التربة ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> والتغلب على الشكل 6. الهروب المضادات الحيوية، وهي مشكلة لT1 اختيار، من خلال فحص PCR المباشر. (A) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS دون المضادات الحيوية. (B) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS + زيادة تركيزات من الكانامايسين (200 ميكروغرام / مل، 600 ميكروغرام / مل، 1 ملغ / مل). (C) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على MS سائل الإعلام المصنع مع 2 ملغ / مل الكانامايسين. (D) PCR من النوع البري الكتان وT1 الشتلات باستخدام بادئات كانامايسين، كل AMPLified والكانامايسين الجين (الأساطير: EZ1: علامة DNA، FlaxS، من النوع البري flaxS، C: السيطرة غير مغموسة فرع، ما: T1 ذرية من زهرة &quot;أ&quot; التي تم جمعها من الفرع الرئيسي، SC، SD، سي، SF: السلالات T1 من الزهور المختلفة &quot;ج، د، ه، و&quot; التي تم جمعها من فرع الجانب، W: لا DNA) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> الرقم 7. مثال على التكبير PCR ناجحة من السلالات T1 باستخدام طريقة PCR المباشر. (A) رسم تخطيطي لناقلات ثنائي مصنع + والمستنسخة LIS-1 إدراج. الأسهم الزرقاء تدل على موقف الاشعال PCR تستخدم في فحص PCR المباشر (معدلة من تاكارا). (ب) PCR مع الاشعال M13F + 3 &quot;(C) PCR مع الاشعال M13R + 18A <stroنانوغرام&gt; (D) PCR مع الاشعال الحدود الأيمن (RB) ومتعددة الموقع الاستنساخ (MCS) ** كل حارة يمثل T1 من الزهور الفردية التي تم جمعها من C: فرع التحكم (غير مغموسة)، M: الرئيسي AG فرع الزهور، S: الجانب على فرع زهرة قبل الميلاد. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مصدر تسلسل التمهيدي إلى الأمام </td><td> تسلسل 5&#39;-3 &quot; </td><td> العكسي مصدر تسلسل التمهيدي </td><td> تسلسل 5&#39;-3 &quot; </td><td> الصلب تيمبراتوري (° C) </td><td> الوقت تمديد (ثانية) </td><td> حجم المتوقعة (بي بي) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &quot;(LIS-1 إدراج) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18A (LIS-1 إدراج) </td><td> TATTTTAACCC <bص /&gt; TATCTCCCAACAC </td><td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. بعض من الاشعال المستخدمة لاختبار PCR المباشر.

Watch this Scientific Journal Video about Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate at JoVE.com

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

29.0K Views.  Case Western Reserve University.  هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

البولي ايثيلين جلايكول كفاءة تحويل ساطة (PEG) من موس Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic pest management strategies. The most used transposable element in insect transformation is piggyBac, and piggyBac-based germline transformation has been successfully conducted in model insects. However, it is still challenging to employ this technology in non-model insects that include agricultural pests. This paper reports on germline transformation of a global agricultural pest, the fall armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, using the hyperactive piggyBac transposase (hyPBase).
In this work, the hyPBase mRNA was produced and used in place of helper plasmid in embryo microinjections. This change led to the successful generation of transgenic FAW. Furthermore, the methods of screening transgenic animals, PCR-based rapid detection of transgene insertion, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR)-based determination of the integration site, are also described. Thus, this paper presents a protocol to produce transgenic FAW, which will facilitate piggyBac-based transgenesis in FAW and other lepidopteran insects.

Hyperactive piggyBac Transposase-mediated Germline Transformation in the Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda

Successful germline transformation in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, was achieved using mRNA of hyperactive piggyBac transposase.

مفرط piggyBac Transposase بوساطة التحول Germline في دودة الجيش الخريف، Spodoptera frugiperda

Stable insertion of genetic cargo into insect genomes using transposable elements is a powerful tool for functional genomic studies and developing genetic ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

تطبيق حركة الرأس السلبية لتوليد تسارع محدد عند رؤوس القوارض

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

التحول الطبيعي، والتعبير عن البروتين، والحفظ بالتبريد لثغرة البكتيريا الزرقاء الخيطية الفيرميديوم

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...