We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.

כל הליכי הניסוי שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה בעברית ובועדת השימוש. 1. הכנת הפתרונות וכלים לחיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של פתרון פיסיולוגי סטנדרטי (SPS) המכיל את היונים שמתוארים בטבלה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות המכיל מלחים בשעה 10 פעמים את הריכוז הסופי מראש בבקבוק זכוכית אחסון מלא 1,000 מיליליטר של מים ללא יונים (מוליכות של 0.055 מייקרו-שני / סנטימטר). להוסיף מלח (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, וMgSO 4), ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פתרון SPS הסופי ביום של הניסוי. הוספה של פתרון המניות 100 מיליליטר ל -700 מיליליטר של מים מטוהרים, לפזר את גלוקוז (3.6 גר &#39;) וNaHCO 3 (ז 2.18) באמצעות סרגל מערבבים מגנטי ולאחר מכן להוסיף מים מזוקקים עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן solutiבגז אותו עם 95% O 2/5% CO 2 ~ 20 דקות. אחרי זה, להוסיף 2 מיליליטר של M CaCl פתרון 2 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הכלים הבאים (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מספריים גדולים או כלי אחר לעריפת הראש, מספריים כירורגיות קטנים לפתיחת הגולגולת, מלקחיים טיפ נאה להרמת הגולגולת לחשוף את המוח, באזמל עם להב ללנתח את החלק הרצוי של המוח להיות פרוס ומרית קטנה לטיפול ב חלקי מוח גזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, להכין חתיכות קטנות של נייר סינון להסרת נוזלי עודפים מהמוח, שתי צלחות פטרי קטנות למוח להיות גזורים בשתי זכוכית 500 מיליליטר כוסות לחממו מים המכילים מטוהרים וSPS, ודבק cyanoacrylate הדבקת המוח שלב חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מברשת קטנה לטיפול בפרוסות במהלך החיתוך ופיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחב להעברת פרוסות מאמבטית החיתוך לצ&#39;ה ההתאוששותmber. לחטא את הכלים כדי למנוע צמיחת חיידקים באמבטיות פרוסה החמה. יתר על כן, להשתמש בכפפות מעבדה נקיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חדר התאוששות הפרוסה שקוע כזה כפי שתואר על ידי גיב ו -15 אדוארדס. ברציפות בגז SPS בו עם 95% O 2/5% CO 2 ולשמור על 36 מעלות צלזיוס. ודא כי להמתה בגז אינו מביא לבועות קטנות שנלכדו באמבטיה שיכולה לגרום נזק לפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם ~ 300 מיליליטר של SPS 36 ° C על צלחת חימום עם בוחש מגנטי או באמבט מים. אם נעשה שימוש בצלחת חימום, לטפל כדי למנוע את הפתרון מהתחממות יתר, שעלול לגרום למשקעי יון. במקרה זה קורה, SPS חם וטרי במקום הקירור הישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא ~ 500 מיליליטר של מים מטוהרים לרתיחה תוך שימוש בקומקום חשמלי ו, בכוס, לשלב 300 מיליליטר שלו במים קרירים כדי לקבל מים מעט חמים יותר מטמפרטורת החיתוך. השתמש בזה חימם מים מטוהרים בעריפת הראש ולהשתמש במאהלרנינג של המים רתוחים מאוחר יותר לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של האמבטיה החיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר על ידי הזרקת 0.1 מיליליטר של pentobarbital (60 מ&quot;ג / מיליליטר) intraperitoneally. אחרי כמה דקות לבדוק שבעלי החיים אינם מגיבים לצובט הבוהן או זנב חזק כדי לברר את חוסר התחושה. </li></ol> 2. ביתור המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכבר במהירות על ידי חיתוך הצוואר עם המספריים הגדולים ליד החלק האחורי של הגולגולת, ולתת לראש ליפול לתוך הכוס עם מים מטוהרים חיממו כדי לשטוף את הדם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את מגנום foramen בגולגולת מתחת לשרירי הצוואר והעור, אולי הסרת יותר של הצוואר עם המספריים הקטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את העור בחלק העליון של הגולגולת כדי להיות מסוגל לראות בבירור את תפרי גולגולת על מנת להנחות את הפתיחה של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגולגולת הפתוחה על ידי החדרת הקצה התחתון של המספריים הקטנים דרך מגנום foramen ומייד להפוך אותם לכיווןהצד לרוחב. לחתוך בעדינות לאורך הקצה הלטרלי של העצם הקודקודית עד מיקום מאחורי העיניים ותפר frontoparietal; אז, פונה לכיוון מרכז הגולגולת וחצתה את קו האמצע לצד השני של הגולגולת האחר (ראה קו מקווקו ירוק באיור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים טיפ נאה, להרים את הגולגולת מפינת frontoparietal ולמשוך באלכסון אותו וsidewards לחשוף את המוח (ראה חץ מקווקו צהוב באיור 2 א). ודא כי הגולגולת אינה מחוברת לשום עצם או עור של הראש, כדי שהמוח יישאר במקום שבו הגולגולת היא הרימה. במקרה שהמוח נע בגולגולת, להשתמש במספריים הקטנים כדי להסיר את כל רקמת חיבור בין הגולגולת והמוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המוח חשוף, לא מאפשר למוח להיות יבש. כך, בצע את השלבים הבאים תוך שמירה על הגולגולת והמוח בצלחת פטרי מלאה חימם, הומתו בגז SPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את חלק במוח המשמש לדוארxperiment משאר המוח באמצעות אזמל ומרית. במקרה של שימוש במוח הקטן, להתנתק מהמוח הקדמי על ידי חתך אחד דרך המוח התיכון וגשר המוח (קווים אדומים באיורים 2B-D) ולהעביר אותה לצלחת פטרי קטנה המכילה טרי, הומתו בגז SPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גזע המוח כדי ליצור בסיס ישר ורחב להדבקת המוח לחיתוך שלב שבו חותך את המוח הקטן במישור אופקי. בקצרה למקם המוח הקטן על פיסת נייר סינון רטובה כל כך שהצד שנחתך מהמוח הקדמי פונה כלפי מטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גזע המוח עם אזמל כדי ליצור את הבסיס (כפי שצוין בקו הכחול בתרשים 2B), ולהחזיר את המוח הקטן לSPS. כאשר מטוסים אחרים של חיתוך יש צורך, לקצץ את בלוק המוח הקטן בהתאם (קווים כחולים בתרשימים 2C &amp; D). </li></ol></li></ol> 3. חותך את המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שלב הגזירה על ידי בירור שהוא הייתר&quot;י, לפני יישום טיפה קטנה של דבק מגע באמצע השלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את בלוק המוח מSPS בעזרת מרית עם צד עד נכון, ולהסיר את נוזלי עודפים מהמוח באמצעות חתיכות קטנות של נייר סינון. ואז, בתנועה אחת, חלק את המוח מהמרית על טיפת הדבק על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע את המוח מייבוש והדבק בריצה בצידי הרקמות, להחיל כמה טיפות של SPS עם פיפטה פסטר והנח את שלב החיתוך בתא החיתוך. יישר את בלוק המוח כך שהאזורים של עניין (למשל, קליפת מוח) מתמודדים עם הלהב ובכך יהיה כפוף לכמות מינימאלית של לחץ מכאני לפני שנחתכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל פרוסה על פי הוראות היצרן ואילו בגז כל הזמן SPS בתא החיתוך, כמו גם שמירה על הטמפרטורה ב34-37 מעלות צלזיוס. שמור על הטמפרטורה של חדר החיתוך בטווח זה על ידי מילוי externתא אל של מבצעה עם חיממו מים מטוהרים והחלפת המים בכל פעם שהטמפרטורה יורדת נמוכה מדי. הערה: הפרמטרים החיתוך יש למצוא באופן ניסיוני עבור כל סוג של רקמה ותאי עצב שנבחנים. במקרה של מבצעה קמפדן SMZ 700 עם להבי קרמיקה ותאי Golgi המוח הקטן, להשתמש במשרעת תנודה 0.75 מ&quot;מ על 65 הרץ וקידום מהיר של 0.05 מ&quot;מ / שנייה; למשרעת נוירונים גרעיניים המוח הקטן יותר ותדירות (1 מ&quot;מ ו -90 הרץ, בהתאמה), ומהירות איטית יותר מראש (.01-0.02 מ&quot;מ / שנייה) מומלצים. עבור שני Golgi ונוירונים גרעיניים המוח הקטן, עובי פרוסה צריך להיות 300 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך החיתוך, אינו מאפשר את הפרוסות לקפל על עצמם. למנוע את זה בעדינות על ידי תמיכתם במברשת רכה, רצוי לגעת בפרוסה רק באזורים שאינם בעלי עניין לניסוי. לטפל כדי למנוע את המברשת מלגעת בלהב vibratome; במיוחד במקרה של להבי הקרמיקה אפילו מגע, אורעלול לגרום נזק ללהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל פרוסה מתא החיתוך להתאוששות / מחזיק תא באמצעות פיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחבה, אש מלוטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו פרוסות לנוח בחדר במשך שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. זה מאפשר פירוק של רקמות ותאים פגומים או למות ובכך גורם למשטח פרוסה נקי. במהלך השעה הראשונה, לשמור על הטמפרטורה של SPS בתא בטווח של 34-36 C °; להבטיח שהפרוסות אינן נוגעות בבועות אוויר שעלול לגרום נזק לפרוסות או לגרום להם לצוף. </li></ol> ניסוי 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, תן טמפרטורת חדר ההתאוששות להתקרר לRT (C ° 17-25). הערה: פעולה זו עשויה להאריך את משך הזמן שבמהלכו את הפרוסות ניתן להשתמש על ידי האטה של ​​הצמיחה של חיידקים, כמו גם חילוף חומרים בתאים. תקופה זו תלויה באזור במוח וסוג התא. לדוגמא, ניתן למצוא סוגים מסוימים של תאי Golgi להיות בריאים בפרוסות8 שעות לאחר החיתוך ואילו סוגים אחרים יימשכו רק 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 עברה מהחיתוך, להשתמש בפרוסות לניסויי אלקטרו שונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Skrede, K., Westgaard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transverse+hippocampal+slice:+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro.">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35, 589-593 (1971).</li><li>Aghajanian, G., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Gueritaud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity+of+rat+ocular+motoneurons+recorded+in+vitro.">Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro.</a> Neuroscience. 24, 837-852 (1988).</li><li>Lipton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+best+of+brain+slices:+comparing+preparative+methods.">Making the best of brain slices: comparing preparative methods.</a> Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).</li><li>Richerson, G., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing.">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).</li><li>Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbate+inhibits+edema+in+brain+slices.">Ascorbate inhibits edema in brain slices.</a> Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+techniques+applied+to+brain+slices.+In:+Patch-clamp+analysis:+advanced+techniques.">Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques.</a> Springer. , 135-193 (2002).</li><li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices:+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons.">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).</li><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type&#8211;specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type&#8211;specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Huang, S., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+temperature+during+brain+slicing+enhances+the+quality+of+acute+slice+preparations.">Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations.</a> Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).</li><li>Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).</li><li>Voets, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principle+of+temperature-dependent+gating+in+cold-+and+heat-sensitive+TRP+channels.">The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels.</a> Nature. 430, 748-754 (2004).</li><li>Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+currents+in+rat+thalamocortical+relay+neurones:+kinetic+properties+of+the+transient,+low-threshold+current.">Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current.</a> The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).</li><li>Gibb, A. J., Edward, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+cells+in+slice+tissues.">Patch clamp recording from cells in slice tissues.</a> Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).</li><li>Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Inhibitory+Input+to+the+Inferior+Olive+Decreases+Electrical+Coupling+and+Blocks+Subthreshold+Oscillations.">Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations.</a> Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).</li><li>Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Warmer+preparation+of+hippocampal+slices+prevents+synapse+proliferation+that+might+obscure+LTP-related+structural+plasticity.">Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity.</a> Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).</li><li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats.">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).</li><li>Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+disappear+with+chilling+but+proliferate+excessively+upon+rewarming+of+mature+hippocampus.">Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus.</a> Neuroscience. 127, 69-80 (2004).</li><li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice.">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

אנו מדגימים שיטה להכנת פרוסות מוח חריפות מעכברים בפיסיולוגיים במקום טמפרטורה קרה כקרח. הוכח 11 שאיכות פרוסות שהושגו בתנאים חמים היא מעולה כאשר בהשוואה לאלו שהוכנו בתנאים קרים, ובלבד שיש לו את להב מבצע רטט אנכי מינימאלי. חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית עשוי למנוע חפצים פיסיולוגיים הנגרמים על ידי הטמפרטורה הנמוכה, כגון אלה הקשורים לשינויים בתהליכי חילוף חומרים 17-19 שיכול להתבטא בסטיות של תא בודד, כמו גם התנהגות רשת. יתר על כן, למרות שהליך החיתוך צריך כמובן להיות הושלם ללא עיכובים מיותרים, אין צורך למהר עם החיתוך (כפי שהוא כשהוא חותך בתנאים קרים כקרח כדי לסיים חיתוך לפני הפתרונות הפכו חמים מדי, וכדי למנוע את נזק מהקפאה ארוכת טווח של הרקמה). כך, מהירויות חיתוך איטיות יותר יכולות להיות לנוed. זה יכול להיות מועיל במקרה של חיתוך מבנים עדינים מאוד. אחרון, תוך השמטת צעד הקירור של שני הפתרונות ושל המוח מפחיתה באופן משמעותי את המשך זמן הנדרש להליך, כמו גם מורכבותו. הקירור של הפתרון לטמפרטורה קר כקרח דורש בערך 40 דקות יותר מ התחממות הפתרון לטמפרטורה פיזיולוגית, משאיר יותר זמן לניסוי עצמו. הוכח 20 שעוצמת הקרינה בתאי עצב בקליפת המוח בעכברי GAD67-GFP היא חזקה יותר כאשר בוחנים פרוסות לחתוך ב -20 מעלות צלזיוס בהשוואה לאלו לחתוך ב 0 מעלות צלזיוס. זו תומכת עוד יותר את הרעיון שחותך בטמפרטורה קרה כקרח מפעיל מזיק בfl uence על יכולת הקיום של תאי עצב. מצד השני, באותו נייר זה היה מראה כי הצפיפות של נוירונים ניאון הופחתה בפרוס שהושג על 37 מעלות צלזיוס בהשוואה לאלו לחתוך ב 20 ° C. המחלוקת עם התוצאות עשויה אריse מהעובדה שz-הסטייה לא נלקחה תחת שיקולים. כפי שצוין לעיל, יש z-סטיית השפעה חזקה על איכות הרקמות בעת חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית, בנוסף לאיכות של הלהב ואת המהירות והגדרות אחרות של מבצעה. אחד החלקים החיוניים של ההליך כרוך כוונון עדין של להב מבצעה לפני חיתוך. שלא כמו בעת שימוש בפתרונות קר כקרח שבו החיתוך סביר כרוך בשני החיתוך אופקי כמו גם אנכי &quot;פיצוח&quot; של ממברנות שומנים בדם הנוקשה, בתנאים פיסיולוגיים כל תנועה של להב המבצע בz-הכיוון תגרום נזק ברקמה. כדי למזער את זה, הלהב צריך להיות קשה וישר ככל האפשר; בניסיון שלנו, יש לי סכיני גילוח קונבנציונליים פגמים רבים מדי כדי להיות שמיש. להבי פלדת אל-חלד באיכות גבוהה שתוכננו במיוחד עבור vibratome שימוש טובים יותר, אבל לתוצאות הטובות ביותר אנו מציעים CERAM-משופע אחתלהבי ic. יתר על כן, אנו ממליצים בחום לבלות זמן משמעותי ליישור אופקי מושלם של הלהבים כמו זה משפיע ישירות על איכות פרוסה. אנו משתמשים במבצע קמפדן 700SMZ המאפשר כוונון של יישור הלהב כך שהרטט בz-המטוס הוא פחות מ -0.5 מיקרומטר. ואכן, ההגבלה החשובה ביותר של שיטת החיתוך החמה היא התלות שלה באיכות להב מבצעה ויציבות. אם לא ניתן עמדו בדרישות אלה, מומלץ להשתמש בשיטת החיתוך קר כקרח המסורתית במקום, למרות החסרונות בחיתוך בפתרון קר כקרח כמו משתנה osmolarity מלהיות קפוא בחלקו. השיטה הוכיחה משמשת להשגת פרוסות אופקית של המוח הקטן; עם שינויים פשוטים באותה השיטה יכולה לשמש כדי לקבל פרוסות באו העטרה או מטוס sagittal, מהרבה אזורים אחרים בקדמת הבמה - או המוח התיכון, כמו גם את גזע המוח. לפרוסות של החלקים קדמי ביותר של המוח הקדמי וolfactמערכת אורי, הגולגולת יש לחתוך קדמית יותר כדי למנוע נזק לחלקים אלה. אנו בכוונה לשמור על השיטה פשוטה וקצר ככל האפשר, ולא להעסיק מראש טפטוף של בעלי החיים, ואין לנו להחליף את כל רכיבים בפתרון הפיזיולוגי לחיתוך. זה מאפשר השיטה להיות שונה בהתאם לתת סוג העצבי הספציפי של עניין. סביר להניח כי שינויים של פתרונות החיתוך (כפי שמתוארת באזכור במבוא) יכולים לשפר את הכדאיות של פרוסות וביציבות של תוצאות. באופן כללי, השיטה צריכה להיות תואמת עם רוב פתרונות פיסיולוגיים נפוצים אחרים המשמשים בדרך כלל להקלטת אלקטרו. בשיטה המוצגת כאן, פרוסות נחתכות 300 מיקרומטר עבה. העובי הפרוסה האופטימלי תלוי באזור במוח הפרוס והתאים של עניין. לשיקולי יושר רשת, פרוסות לא צריכים להיות דק יותר מ -250 מיקרומטר, ובגלל מגבלות דיפוזיה עדלמגבלה של העובי הפרוסה הוא ~ 400-450 מיקרומטר. שלב קריטי בשיטה זו רואה בהדבקת המוח לשלב הגזירה, כחוסר יציבות אפילו קטן ברקמות יכולה לגרום לפרוסות אחידות, או לא שמיש. לכן, יש לנקוט זהירות כדי לוודא כי פני השטח של המוח אין SPS עודף כשמוריד על ירידת הדבק; גם, יותר מדי דבק, יגרום למוח שוכב בצורה לא אחידה על הבמה ואולי ניתוק מהבמה במהלך חיתוך. כמו כן, דבק עודף עלול להתגנב על הצדדים רקמות ו, בנוסף להחדרת inhomogeneity לפרוסות, עלול לגרום נזק ללהב. יש כמה קשיים שעלולות לעלות בעת שינוי פרוטוקול החיתוך מהשיטה קרה כקרח לשיטה החמה הפגינה. אחד הקשיים הוא המראה של חיידקים בפרוסות. מסיבה זו חשוב לחטא את הכלים, קאמרי, ואמבטית החיתוך עם אתנול לפני ההליך. כמו כן, הפיכהאת מערכת החימום בהתאוששות האמבטיה אחרי שעה 1 מאיטה את גידול החיידקים. לבסוף, יש להדגיש כי שיפור הבריאות של תאי העצב בפרוסות לחתוך בטמפרטורה פיזיולוגית עלולה גם לגרום לשינויים במאפיינים הפנימיים שלהם. לכן, מומלץ לבצע השוואה ראשונית של התוצאות שהתקבלו מפרוסות עם שני שיטות קרות וחמות, במיוחד אם הניסויים הם חלק מפרויקט ארוך עם עבודות קודמות נעשו בשיטה הקרה.

מטרת השיטה המוצגת היא להשיג פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה עבור בניסויים במבחנה אלקטרו, במיוחד בעת שימוש במבוגרים או אפילו בעלי חיים ישנים. שיטת חיתוך המוח החריפה, כפי שתוארה על ידי Skrede ו1 Westgaard בשני משפטים אלגנטיים, הפכה לאחד מעמודי התווך של מחקר במדעי המוח מודרני ומועסקת בוריאציות אין ספור ברחבי העולם. האיכות של הפרוסות באו לידי ביטוי במספר של חיים נוירונים לכל פרוסה, פרק זמן שבמהלכו התאים ממשיך תכונות אלקטרו והצורניות שלהם, כמו גם בשלמות הרקמה. יתר על כן, משך הזמן המקסימאלי להקלטות יציבים תלוי באיכות של הפרוסות. כך, לאורך עשרות השנים, שיטת החיתוך המקורית פותחה עוד יותר על ידי קבוצות מחקר בודדות כדי לשפר את ההתאוששות פרוסה לאחר חיתוך 2-10, לעתים קרובות על ידי שינויים מורכבים של הרכב חיתוך oפתרונות התאוששות r (כגון הוספת ascorbate, thiourea או אפילו H 2 O 2), כמו גם מראש זלוף תוך לבו של בעל החיים עם פתרונות פיסיולוגיים מקוררים. כפי שהראה 11 לאחרונה, נראה טמפרטורה פיזיולוגית במהלך החיתוך להיות מועיל יותר מאשר קירור לבריאות עצבית; השיפור בולט ביותר בעבודה עם מבוגרים מכרסמים (2-8 חודש). הימנעות שינויי טמפרטורה דרמטיות מונעת חפצים בשל תהליכי טמפרטורה תלויה בתוך התאים, כגון קינטיקה פלסטיות 13 ויון-ערוצי 13,14. שינויים כאלה יכולים להשפיע על מתח קרום ואיתות סידן תוך תאי, סף ספייק, וספייק צורה. השיטה &quot;החמה&quot; פרוסה חריפה ההכנה שהוצגה כאן היא נוהל כללי לקבלת פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה מכל אזור במוח, כולל המוח הקטן, קליפת המוח וההיפוקמפוס, גזע המוח גרעיני 16 &lt;/ Sup&gt; כמו גם את הנורה חוש הריח, הן בחולדות ועכברים. יש לציין, הליך חיתוך הטמפרטורה הפיזיולוגי דורש כי להב החיתוך רוטט כמעט בצורה מושלמת בצורה אופקית, והוא ללא כל פגמים מבניים. הדיוק הזה לא יכול להיות בר-השגה עם מודלים מבצעה מבוגרים; במקרים כאלה, אנו ממליצים על ביצוע הכנת פרוסה בתנאים קר כקרח כנראית בטמפרטורה הנמוכה על מנת להפוך את הרקמה עמידה יותר בפני נזק מכאני, גם אם במחיר של סטיות מטבולים.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>CTS</td><td>170066</td><td>Concentration: 60 mg/ml in physiological saline.</td></tr><tr><td>Big scissors&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Iris scissors&amp;nbsp;</td><td>Prestige medical</td><td>48,148</td><td>Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5&amp;#8211;2 cm</td></tr><tr><td>Fine tip forceps&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>FST</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Small spatula&amp;nbsp;</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>2350</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>Any laboratory brand can be used.</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Duroplan</td><td>Z231509-1</td><td></td></tr><tr><td>Glass beakers&amp;nbsp;</td><td>SCHOT</td><td>10022846</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette&amp;nbsp;</td><td>Maple Leaf Brand</td><td>14672-029</td><td></td></tr><tr><td>Super glue&amp;nbsp;</td><td>LOCTITE</td><td>4091361/1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer</td><td>Campden</td><td>7000-smz</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic slicing blade</td><td>Campden</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic heater/stirrer</td><td></td><td></td><td>For heating up the SPS for the procedure</td></tr><tr><td>Electric kettle</td><td></td><td></td><td>For heating up water for temperature control</td></tr><tr><td>Slice recovery chamber + heating unit</td><td>Warner instruments</td><td>&amp;nbsp;BSC-HT +&amp;nbsp; BSC-BUW</td><td>Home-built models may also be used.</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>For monitoring SPS temperature during dissection and slicing</td></tr></tbody></table>

slice it hot: acute adult brain slicing in physiological temperature

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה של פרוסות מוח חריפות. הליך זה הוא אלמנט קריטי עבור ניסויי תיקון- clamp אלקטרו שקובע במידה רבה את איכות תוצאות. הוכח כי השמטת צעד הקירור במהלך חיתוך הליך היא בהשגת פרוסות ותאים בריאים, במיוחד כאשר התמודדות עם מבנים מוחיים myelinated מאוד מבעלי חיים בוגרים. למרות שהמנגנון המדויק שבו טמפרטורה גבוהה תומכת בבריאות עצבית ניתן השקיעה רק על, זה מתקבל על הדעת כי, במידת האפשר, את הטמפרטורה שבה החיתוך מבוצע צריכה להיות קרובה למצבים פיסיולוגיים כדי למנוע חפצים הקשורים בטמפרטורה. יתרון חשוב נוסף של שיטה זו הוא הפשטות של ההליך ולכן זמן הכנה הקצר. בשיטה הוכיחה עכברים בוגרים משמשים אך את אותו ההליך יכול להיות מיושם עם עכברים צעירים כמו גם חולדות. כמו כן, CL התיקון הבאניסוי המגבר מתבצע על פרוסות המוח הקטן אופקיים, אלא גם באותו ההליך ניתן להשתמש במטוסים אחרים, כמו גם אזורים האחוריים אחרים של המוח.

<html> פרוסות מוכנות באופן המתואר יכולות לשמש לניסויי אלקטרו וoptogenetic שונים. באיור 3 א ו3C, אנחנו מראים דוגמא מייצגת של חתך אופקי המוח הקטן ופרוסה בקליפת המוח מוח העטרה, בהתאמה, שנצפה תחת התערבות ההפרש (DIC) אופטיקה. בפרוסת המוח הקטן, מספר סוגים של תאי עצב של המוח קטן יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי צורת הגוף ומיקום הסלולרי שלהם, המאפשרים ממוקד קלטות אלקטרו. באיור 3 ו3D, דוגמא עקבות מהקלטות תיקון- clamp כל התא במצב מהדק נוכחי מתא פעיל באופן ספונטני המוח הקטן Golgi ותא פירמידלי בקליפת המוח מוצגות. ניתן למצוא דוגמאות נוספות לאיכות של קלטות אלקטרו וoptogenetic המתקבלות ממוח הפרוס חם בהואנג ו -11 Uusisaari וet al לפלר. 16. <table border="0" cellpadding=</html style=";text-align:right;direction:rtl">cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr height="34"><td height="34" style="height:34px;width:108px;"></td><td style="width:103px;"> ריכוז [מ&quot;מ] </td><td style="width:143px;"> משקל (גרם / ליטר) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:108px;"> NaCl </td><td style="width:103px;"> 124 </td><td style="width:143px;"> 72.5 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:108px;"> KCl </td><td style="width:103px;"> 3 </td><td style="width:143px;"> 2.23 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:103px;"> 1.2 </td><td style="width:143px;"> 1.63 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> MgSO 4 * 6 שעות 2 O </td><td style="width:103px;"> 1.9 </td><td style="width:143px;"> 4.3 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:108px;"> גלוקוז </td><td style="width:103px;"> 20 </td><td style="width:143px;"> 3.6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> NaHCO 3 </td><td style="width:103px;"> 26 </td><td style="width:143px;"> 2.18 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> CaCl 2 </td><td style="width:103px;"> 2 </td><td style="width:143px;"> 1.109 </td></tr></tbody></table> הרכב 1. טבלה של הפתרון הפיזיולוגי הסטנדרטי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52068/52068fig1highres.jpg" /> איור 1. הסדר של הכלים. 1. מספריים גדולים, 2. מספריים קטנים כירורגית, אזמל 3. עם להב # 11, 4. מלקחיים טיפ נאים, 5. מרית קטנה, 6. צלחות פטרי קטן, 7. כוס זכוכית מים ללא יונים, 8. כוס זכוכית לגאס חימםפתרון ד פיסיולוגי, 9. דבק סופר, 10. מברשת דקה, 11. פיפטה פסטר, 12. מזרק קטן, 13. Pentobarbital, 14. ניירות סינון, שלב חיתוך 15.. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52068/52068fig2highres.jpg" /> ציור איור 2. ייצוג סכמטי של נתיחת הגולגולת והמוח () המתאר את פתיחת הגולגולת כדי לחשוף את המוח (B - D).. ציורי סכמטי המתארים את המטוסים של חיתוך המוח לשלושה מטוסי חיתוך גדולים. הקו הכחול מייצג את המטוס שעליו המוח יהיה דבוק ב. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52068/52068fig3highres.jpg" /> איור o פרוסת המוח הקטן אופקית 3. תוצאות נציג של השיטה. ()btained עם השיטה הפגינה. שלוש השכבות העיקריות של קליפת המוח (שכבת גרגר תא, שכבת GC; שכבת נוירון פורקינג, שכבת PN; השכבה מולקולרית, ML), כמו גם בחומר לבן (WM) מצוינים. אלקטרודה תיקון- clamp נמשכת סכמטי על תא Golgi (סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר) (אלוף). דוגמא (ב) הקלטה מתא Golgi שמוצג א ההקלטה שהושגה עם אלקטרודה תיקון- clamp בנוכחי מהדק מצב. (בשחור: עקבות נציג מתוך שש עקבות אפורות). פרוסת קליפת המוח מוח העטרה (C) המתקבלת בשיטה הפגינה. תאים פירמידליים בקליפת המוח מוצגים יחד עם ציור סכמטי של אלקטרודה תיקון- clamp. הקלטת מהדק דוגמא תיקון (ד &#39;), במצב מהדק נוכחי, מתא פירמידלי מוצג ב( C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52068/52068fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature at JoVE.com

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

slice-it-hot-acute-adult-brain-slicing-in-physiological-temperature

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.2K Views.  Hebrew University of Jerusalem. In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Video: Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

הערכת שינויים בפלסטיות סינפטית באמצעות מודל פגיעת ראש סגורה ערה של פגיעה מוחית טראומטית קלה

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Preparation of Brain Sections Using a NMDG-Based Protective Recovery Method

Source: Ting, J. T. et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/53825">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes a protocol to obtain brain slices using an N-Methyl-D-glucamine (NMDG)-based protective recovery method. A dissected brain is incubated in an aCSF with NMDG and HEPES to minimize neuronal cell death and damage during the sectioning. The section is allowed to recover in the aCSF to restore the cellular activities

הכנת מקטעי מוח בשיטת התאוששות הגנה מבוססת NMDG

1. Brain Dissection and Slicing

	Decapitate the animal. Use a scalpel to open the skin on the head and expose the skull cap.
	Use fine super-cut scissors ...