We gratefully acknowledge Dr. Deborah L. Gumucio as our advisor and for her invaluable support in defining the culture and imaging methods. We also thank Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dr. Charlotte Mistretta, and Dr. Ann Grosse for their contributions to the development of the whole intestine organ culture system. Helpful discussions on imaging provided excellent advice from Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski and Sasha Meshinchi. All imaging was performed in the Microscopy and Image Analysis Laboratory at the University of Michigan. Funding support was provided by NIH R01 DK065850.

הערה: כל העכברים טופלו באנושיות תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואת היחידה לבעלי חיים במעבדה לרפואה ובהתאם להנחיות ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים. מערכת האיברים תרבות .1 שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תקשורת ותרבות צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונת תרביות רקמה, להסיר 5 מ&quot;ל של תקשורת BGJb ממניות הבקבוק ולהוסיף 5 מ&quot;ל של העט / סטרפטוקוקוס. הכן מלאי עבודה של תקשורת בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל, על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חומצה אסקורבית ל49 מ&quot;ל של תקשורת BGJb (עם פן / סטרפטוקוקוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת תרבות 6 היטב על ידי הוספת 1 מ&quot;ל מתחת לכל של transwells. הערה: אם לא השתמש בכל 6 transwells, להעביר transwells נוסף לצלחת 6 היטב סטרילי טרי לשימוש מאוחר יותר. הוסף 3 מ&quot;ל של עבודה תקשורת BGJb לכל אחת משלוש צלחות פטרי 10 סנטימטר סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים כלים לנתח בetha 70%נול ולהיות בטוחים כדי לשמור על הכלים נקיים תוך כדי העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזור לנתח עם דלי קרח גדול ולמקם את צלחת תרבות 6 היטב ו10 פטרי מנות סנטימטר עם תקשורת BGJb על קרח. לעבוד על קרח ככל האפשר, תוך ביתור והכנת המעיים לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי נקבת עכברים בוגרים בתא עם isofluorane (100 μl) לפני euthanization נקע בצוואר הרחם לאסיף מעיים של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת העוברים מאמם, לביים כל עובר על פי זהירות לTheiler בימוי תרשים 13. אין לסמוך על ימים שלאחר משגל-כדי לקבוע את הגיל של כל עובר כוריאציות של עד 24 שעות בשלב התפתחותי הם נצפו באופן שיגרתי בהמלטה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection של מעיים של העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עוברים על ידי עריפת ראש לפני הסרת מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל מעי בשל 1x Dulbecco פוספט שנאגר מלוח (DPBS) ולאחר מכן PLACe אותו לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר עם העבודה תקשורת BGJb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הטחול מהבטן והלבלב מהבטן והעליון תריסריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את omentum דואג להשאיר את omentum המצורף ככל האפשר ומפריד את הקשרים רק מספיק כדי לאפשר למעי להיות יישר. הערה: למעיים מבוגרים מן E14.5 או אלה שתרבית יותר מ24 שעות, בעדינות להפריד את המעי ל3 חלקים שווים, כדי לאפשר לתוכן luminal לזרום דרך המעי ולהיות מגורש מקצות החתך. עם זאת, לתרבויות התחילו לפני E13.5, לחכות עד אחרי 24 שעות של culturing לפני פרידת 3 המגזרים של המעי כדי לאפשר serosa לגדול כראוי על פני האורך של המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet פה כדי להעביר את חתיכות מעיים על transwells של צלחת התרבות (1.1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למקם מחדש את המעיים לפי צורך, כך שהם ישר transwell. הערה: ברגע שהמעיים מתחילים לנוע תוכן luminal דרך הצינור, סטיות כל במעי יגרמו גיבוי ונזק למעי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מתחת transwell, להוסיף 700 μl של תקשורת טיפול (עבודה תקשורת עם חלבונים הוסיפו רקומביננטי או מעכבים תרופתיים) תחת transwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של תקשורת טיפול ירידה מבחינת על גבי המעיים ולאפשר לו לספוג דרך transwell. למקם מחדש את המעיים על פי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת טיפול לפחות פעם ביום או לעתים קרובות יותר בהתאם לזמן מחצית החיים של מגיב הטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חרוזים agarose חלבון ספוגה למקור מקומי של מגיב טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים agarose במכל האחסון שלהם ולהעביר את חרוזים agarose 100 μl לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הנפח הנותר של הצינור עם סטרילי 1x Phosphate שנאגר מלוח (PBS) ומערבבים את החרוזים כדי לשטוף אותם. מניחים את צינור microfuge במעמד לכמה דקות כדי לאפשר חרוזים להתיישב לתחתית ואז pipet את PBS מעל גבי חרוזים. למלא את צינור microfuge עם סטרילי 1x PBS ולחזור על תהליך השטיפה פעמיים נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החלבון של עניין בשתי פעמים הריכוז רצוי לטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5 μl של חרוזים agarose נשטפו עם 5 μl של מניית חלבון 2x ועדינות להתסיס את חרוזים בחלבון. מניחים את הצינור על קרח במשך שעה 1, ערבוב בעדינות כל דקות 10-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את חרוזים קצר בסטרילי 1x PBS לפני הצבת חרוזים במעיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום של חרוזים agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את חרוזים agarose על גבי המעיים באמצעות pipet פה עם מחטי נימים משכו. מניחים את חרוזים בזהירות רבה כטיפול אגרסיבי יפגע המעי ולמנוע התפתחות סיסי באזור הפגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חרוזי פעמיים רבים ככל נדרשים לניתוח מאז המעיים יעברו תנועות peristaltic וכמחצית מהחרוזים להציב יגלגל את המעיים על פני זמן culturing. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע של מעיים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את תקשורת הטיפול מלמטה transwell ולאפשר את המעיים לייבוש באוויר במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מקבע תחת transwell למשך 2 דקות, לאחר מכן לכסות את החלק העליון של המעי עם 2 מ&quot;ל של מקבע למשך שארית זמן הקיבעון. לתקן עם 4% O paraformaldehyde / N ב 4 מעלות צלזיוס או לשעה 2 ב RT. </li></ol></li></ol> .2 הדמיה של מעיים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה Wholemount <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעיים שלמים (עם הקרינה אנדוגני) בשקופית עם של 1x DPBS 100 μl. שימוש במלקחיים כדי לסדר בעדינות את המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטלית מעבדה כדי להסיר בזהירות את DPBS ומייד להוסיף של גליצרול 70% 100 μl כדי להפוך את מו הרקמהמחדש שקוף ולהגדיל את העומק האפשרי של הדמיה. הערה: אם חדירה נוספת של המעי היא רצויה, במקום הרכבה המעי ב70 גליצרול%, להשרות את המעי בכמה טיפות של תמיסת המוקד ברורה ל10-30 דקות. Pipet את פתרון המוקד ברור והר המעי עם הר ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים כל אחת מארבע הפינות של coverslip לפלסטלינה ולהרים כמות קטנה של חומר שישמש כמפרידים בין השקופיות וcoverslip כדי לשמור על coverslip ממשטח את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את coverslip לשקופית עם VALAP מומס מיושם עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת המעיים משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך Vibratome של מעיים קבועים (עבור תצוגת חתך רוחב של מבני מעיים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיים להטביע בagarose 7% בתבניות פלסטיק קטנים (10 x 10 x 15 מ&quot;מ) ולאפשר ללוקי agarose ללצנן ולחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בלוקים agarose מתבניות הפלסטיק ואובניים agarose הדבק לשלב איסוף vibratome עם דבק מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את שלב האיסוף עם קרח הקר 1x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקים בעובי בין 100-150 מיקרומטר. עבור חלקים עבים יותר להשתמש בפתרוני סליקה (שתוארו בסעיף 2.1.2) כדי לחזות עמוק יותר לתוך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים vibratome חלקים מהשלב האיסוף לתוך באר של צלחת 6 היטב לאחסון ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence של רקמות קבועות, מחולק vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 5-12 חלקים vibratome לכל גם לתוך צלחת 24 גם עם 1x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1x DPBS ולהוסיף 500 μl של פתרון permeabilization בכל טוב. נער בעדינות את הדגימות ל25 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר permeabilization, לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הדגימות לפחות 30 דקות ב500 μl של חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימה, דוארXchange פתרון החסימה עם 500 μl של הנוגדנים עיקריים בדילול מלא בחסימת פתרון ולשמור את הדגימות על 4 מעלות CO / N. הערה: דילולים הנוגדן הראשוניים שפועלים היטב על חלקים קפואים ופרפין בדרך כלל עובדים גם על vibratome סעיפים מדי, לעומת זאת נוגדנים הדורשים אחזור אנטיגן גרעיני בדרך כלל לא עובד טוב עם פרוטוקול זה (למשל, BrdU). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, להחיל 500 μl של הנוגדנים משני בדילול מלא בחסימת פתרון. לעטוף את צלחת 24 גם בנייר אלומיניום כדי להגן fluorophores מן האור ולטלטל את הדגימות ל45 דקות לשעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS ל15 דקות כל אחד והר חלקי vibratome בשקופיות כפי שתואר בסעיף 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה חלקי vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות עבור vibratome הרכבה על ידי חיתוך פרוסות דקות של כפול STIקלטת ck ומציב אותם בצדי המגלשות הארוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להניח 5-10 חלקי vibratome בין הקלטת דו המקל בשקופיות בירידה של של 1x PBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את כל החלקים ולהפיץ אותם לשכבה אחת על פני השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל agarose עודף או חתיכות לא אחידות שימנע coverslip מיושב שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בזהירות רקמת מעבדה כדי לספוג את עודף 1x PBS מכל רחבי חלקי vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של מדיום גובר מימיים על גבי חלקי vibratome ולאחר מכן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את coverslips על השקופיות עם נמס VALAP מיושם עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת חלקי vibratome משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים על בחירה של מערכת הדמיה. </li></ol></li></ol> .3 הדמיה חיה של מעיים שלמים מעיים שנקטפו מן fetuseים לאחר E12.5, עם omentum המחובר נותר בשלמותו, לפתח בהצלחה villi בתרבות שימוש במערכת לעיל. לכן, מערכת זו vivo לשעבר מאפשרת הלכידה של תמונות z-סעיף חיים של המעיים פיתוח שניתן לשחזר לתצוגה תלת ממדית של המורפוגנזה לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק מיידי לדבוק קרום פוליקרבונט פרט למסך רשת בסדר. זה מספק פיגום תמיכה כדי להחזיק את המעי במקום מתחת לעדשת הטבילה של המיקרוסקופ confocal הזקוף. נא עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים על בחירה של מיקרוסקופי הדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסך הרשת במרכז גם צלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי גזור על הממברנה פוליקרבונט ולהוסיף טיפה של דבק מיידי בכל צד. השתמש אך ורק מספיק דבק להדביק המעי, אבל זה לא מעיל! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חופשי תקשורת ותרבות של פנול אדום מתחת לפוליקרבונטקרום במרכז גם מצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים עד לשפה החיצונית של צלחת התרבות כדי לספק לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז המעי העוברי עובר גלים כמו נפיחה של התכווצות בתרבות, להוסיף של 1 100 μl: פתרון 5 של xylazine ב1x PBS עד 3 מ&quot;ל של תקשורת כדי לשלוט בתנועה של המעי תוך הדמיה. מינון זה לשלוט בתנועות מעיים במשך כ8-10 שעה מבלי להתפשר על פיתוח סיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתצוגה רוחבית של המעי, להטביע את המעיים חיים בפתרון agarose 3-4% ולחתוך חלקים עבים (150-500 מיקרומטר) על vibratome. התאם את הנוקשות של agarose עם הקשיחות של המעי נחתך ואמפיריים נקבע השלב ההתפתחותי. באופן כללי, פתרון agarose 3% עובד היטב עבור מעיים צעירים מן E14.5 ופתרון 4% עובד היטב עבור המעיים E15-E16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את חלקי vibratome לקרום פוליקרבונט מודבקים מסך רשת (כמו בסעיף 3.1.1) והתרבות כפי שתוארה בסעיף 3.1.2-3.1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את ההדמיה בשידור החי באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים confocal הקרינה (לייזר עירור בין 690-1,040 ננומטר) על עמדה זקופה עם שולחן מתכונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר שני פוטונים מכוון ל900 ננומטר מספק חדירה עמוקה עם הרזולוציה הטובה ביותר עבור אותות GFP. זה מפחית את נזק לרקמות בזמן ההדמיה. בנוסף, הגדרת כוחו של הלייזר לפליטה הנמוכה ביותר האפשרית מפחיתה נזק לרקמות. בדרך כלל כדי להשיג עירור טוב של GFP, להשתמש 12% כוח בליזר שני פוטונים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Grosse, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dynamics+in+fetal+intestinal+epithelium:+implications+for+intestinal+growth+and+morphogenesis.">Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis.</a> Development. 138, 4423-4432 (2011).</li><li>Walton, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog-responsive+mesenchymal+clusters+direct+patterning+and+emergence+of+intestinal+villi.">Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).</li><li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+endoderm+development.">Vertebrate endoderm development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).</li><li>Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vascular+networks+during+the+morphogenesis+of+intestinal+villi+in+the+fetal+mouse.">Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse.</a> Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).</li><li>Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+fetal+rat+duodenal+villi.">Morphogenesis of fetal rat duodenal villi.</a> Am J Anat. 146, 73-92 (1976).</li><li>Burns, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+fibroblast+growth+factor+10+or+fibroblast+growth+factor+receptor+2-IIIb+signaling+for+cecal+development+in+mouse.">Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse.</a> Dev Biol. 265, 61-74 (2004).</li><li>Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+Nkx2-3+homeodomain+gene+is+expressed+in+gut+mesenchyme+during+pre-+and+postnatal+mouse+development.">The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development.</a> Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).</li><li>Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+homeobox+transcription+factor+Nkx2-3+in+mice+results+in+postnatal+lethality+and+abnormal+development+of+small+intestine.">Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine.</a> Development. 126, 2215-2225 (1999).</li><li>Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Sch&#252;tz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mesenchymal+winged+helix+transcription+factor+Fkh6+is+required+for+the+control+of+gastrointestinal+proliferation+and+differentiation.">The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation.</a> Genes &amp; Development. 11, 1583-1595 (1997).</li><li>Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxF1+and+FoxL1+link+hedgehog+signaling+and+the+control+of+epithelial+proliferation+in+the+developing+stomach+and+intestine.">FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine.</a> J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).</li><li>Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+gastrointestinal+development+in+PDGF-A+and+PDGFR-(alpha)+deficient+mice+implicates+a+novel+mesenchymal+structure+with+putative+instructive+properties+in+villus+morphogenesis.">Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis.</a> Development. 127, 3457-3466 (2000).</li><li>Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+controls+mesenchymal+growth+in+the+developing+mammalian+digestive+tract.">Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract.</a> Development. 137, 1721-1729 (2010).</li><li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , (1989).</li><li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms.">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants.">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li><li>Fu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtome-free+3-dimensional+confocal+imaging+method+for+visualization+of+mouse+intestine+with+subcellular-level+resolution.">Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution.</a> Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).</li></ol>

The authors have no financial conflicts to disclose.

האופי הדינמי ואינטראקציות רקמה מורכבות של המעי המתפתח דורשים 3D להדמיה יש הערכה מלאה של אירועי המוךפו&quot;גנטי אלה. עם התפתחות טכנולוגיית הדמיה, היכולת לבחון המורפוגנזה סיסי בפירוט מפתחת / שיפור ועם זה, ההבנה של התקשורת ואינטראקציה מרחבית במהלך organogenesis היא מאוד משופרת. שיטות אלטרנטיביות לculturing כל מעיים גם נבדקו, אך מערכת transwell נשארה אמינה ביותר לזמנים ארוכים יותר ותרבות לשמירה על דפוסים אשכול וסיסיים נורמלים. מערכות תרבות תלת ממדים (matrigel או קולגן) לעבוד גם לתקופות קצרות תרבות (פחות מ 24hr) של מעיים צעירים (E12.5-E15.5), אבל ברגע שהמעיים מתחילים עוברים תנועות דמויות peristaltic ומפריש אנזימים ופסולת ללום, מצעים תלת ממדים לא מחזיקים מעמד היטב. קרבים בתרבות נוזליתים יהיה גם לפתח, עם זאת, חוסר תמיכה או התייחסות להתמצאות בתרבות חופשית צף מופיע לשנות דפוס נורמלי של האשכולות וvilli. לכן, מערכת transwell הוא העדיף לבחון דפוסים אשכול והופעה סיסי ותולדה. שיטה נוספת להדמיה לחיות wholemount עם סט פחות קפדני היא להשתמש סיכות minutien לצרף את המעי העוברי לשכבה דקה של agarose 7% על החלק התחתון של צלחת 35 x 10 מ&quot;מ. בעוד ששיטה זו היא קלה יותר להגדיר, לציין כי השימוש בו מוגבל לשלבים צעירים (E12.5-E15.5) או לזמנים קצרים יותר culturing מאז matrigel לא יחזיק עד הפרשות מעיים. , כדי להכין את צלחות התרבות לשפוך מספיק agarose 7% נמס רק כדי לכסות את תחתית צלחת 35 x 10 מ&quot;מ. הנח צינור נימי זכוכית במרכז agarose זמן שהוא עדיין נזיל. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את נימי הזכוכית ולמקם את tהוא עוברי מעי לאורך נוצר גם על ידי הנימים. מלא את הנימים גם עם matrigel להקיף את המעי ולמקם את צלחת התרבות ב37 מעלות צלזיוס עד סטי matrigel. הוסף מדיה תרבות DMEM פנול אדום ללא זהירות. מניחים את צלחת מ&quot;מ 35 x 10 בתוך צלחת מ&quot;מ 60 x 15 ולמלא את צלחת 60 מ&quot;מ עם מים כדי ליצור תא לח. בחירה של שיטת ההרכבה (wholemount או vibratome) להדמית חיה מבוססת על הכיוון הרצוי של האזור להיות דמיין. לדוגמא, כדי להציג את השינויים בצורת תא אפיתל, z-ערימות דרך מעי wholemounted יספק נוף של משטחי הפסגה ובסיסיים. כדי להציג interkinetic הגירה גרעינית של תאי האפיתל בגיליון אפיתל, חלקי vibratome לאפשר סוף על תצוגה (רוחבית) כדי לבחון את משטחי הפסגה ובסיסיים. הכנת הדגימות היא קריטית למניב תוצאות ההדמיה הטובות ביותר. בעת השימוש בvibratome סעיפיםnd מיקרוסקופיה confocal הסטנדרטי, רזולוציה טובה ניתן להשיג עד לעומקים של 75 מיקרומטר ללא מגיב סליקה. נכון לעכשיו, מגיב סליקה עבור דגימות חיות לא זוהה כל כך העומק של הדמיה הוא מוגבל. לקבלת דוגמיות קבועה, השימוש במגיב סליקה יכול לשפר באופן משמעותי את העומק של הדמיה. מגיב הסליקה נמצא לספק המורפולוגיה הטובה ביותר והחלטה היה להתמקד ברור 17. לאחר 30 דקות של סליקה בפוקוס ברור והרכבה בהר ברור, כל העומק של כל השלבים של מעיים עובריים ניתן הדמיה עם רזולוציה מצוינת. חלופת סליקה פחות יקרה היא 70 גליצרול%, עם זאת העומק המקסימאלי של חדירה ברקמות עוברית היא 150 m, לאחר מכן את הרזולוציה ועוצמת האות הולכת לאיבוד. הערה חשובה אחת היא שאותות מוגדרים ביותר בדגימות שהם רכובים וצלמו באותו היום הצביעה הושלמה. הרכבה עם מדיום מימית שימור אות הרכבה (כגון פתרון אנטי לדעוך זהב להאריך (Life Technologies P36930) עוזר עם שמירה על האות, אבל רק לזמן קצר; את התמונות הברורות תמיד מתקבלות מייד לאחר הצביעה והרכבת הדגימות.

Each intestinal villus is composed of two main tissue compartments: an epithelial surface layer and a mesenchymal core. The mouse small intestine is formed at embryonic day 10 when a sheet of endoderm closes and seals to form a tube of epithelium surrounded by mesenchymal cells3. This flat tube of epithelium undergoes rapid proliferation, growing both in length and girth and undergoes dramatic rearrangements involving dynamic cell shape changes1. At the same time, the surrounding mesenchyme also undergoes many developmental processes including the formation of the vascular plexus, differentiation of smooth muscle and recruitment of enteric neurons4. In the proximal small intestine at embryonic day 14.5, condensations (clusters) of Hedgehog- and PDGF-responsive cells begin to form adjacent to the epithelium2,5. Formation of mesenchymal clusters continues to spread along the length of the intestine so that they cover the entirety of the small intestine by embryonic day 16.52. As mesenchymal clusters form, the epithelial cells closest to the clusters begin to withdraw from the cell cycle, while the other epithelial cells continue to proliferate. Those cells directly above the mesenchymal cluster that have withdrawn from the cell cycle begin to change shape as the emerging villus buckles into the lumen. Further growth of the villus is driven in part by the continued proliferation of the epithelium between the emerging villi. The mesenchymal clusters remain tightly adhered to the epithelium of the growing villus and continue to express a variety of signaling molecules. The wave of villus emergence propagates along the length of the small intestine following the formation of mesenchymal clusters. As the intestine continues to grow and the intervillus region extends between emerging villi, new mesenchymal clusters form adjacent to the intervillus epithelium and further rounds of villus emergence and growth ensue6.
Synchronized development of the epithelium and mesenchyme is essential for villus morphogenesis. Signaling molecules are secreted from one layer to the other where receptors receive and transduce the signal message in order to coordinate development between the epithelium and mesenchyme. Mesenchymal clusters act as signaling centers and express a variety of developmental morphogens7-10. Disruption of cluster formation or pattern results in loss of villus emergence and pattern. Inhibition of PDGF signaling results in fewer clusters and fewer villi and those villi that do form are misshapen following the abnormal clusters11. Loss of Hedgehog signaling results in complete loss of cluster formation and failure of villus emergence2,12. Together, these data demonstrate that clusters coordinate development of the villus epithelium with its mesenchymal core.
Using this whole organ culture system, we are able to alter signaling involved in epithelial-mesenchymal cluster cross-talk to determine the role of those signals in villus morphogenesis. Two-photon confocal optical sectioning and reconstruction afford the ability to visualize cluster formation and villus emergence in three-dimensions and better understand the spatial relationships between the mesenchymal clusters and their overlying epithelium. Extending the culture system to four dimensions, we can capture z-stacks of developing clusters and villi over time and observe these interactions. Ultimately, the ability to follow villus development in this manner and observe changes that occur with altered signaling will revolutionize the understanding of epithelial mesenchymal interactions in villus morphogenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1308">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:508px;">Fine dissecting forceps&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:133px;">&#160;11254-20</td>
			<td style="width:444px;">2 pairs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x sterile Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>14040-133</td>
			<td style="width:444px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plates</td>
			<td>Costar&#160;</td>
			<td>3524</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 x 15 mm petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>&#160;451007</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes</td>
			<td>Corning Costar&#160;</td>
			<td>3428</td>
			<td style="width:444px;">6 inserts per plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BGJb media</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>12591-038</td>
			<td style="width:444px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;15140</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A0278</td>
			<td style="width:444px;">make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td style="width:133px;">&#160;21-180-10</td>
			<td style="width:444px;">remove the aspirator assembly and replace it with a 1000 &#181;l pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 inch glass pasteur pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose beads</td>
			<td>BioRad&#160;</td>
			<td>153-7301</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary Tubes</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td style="width:444px;">pull to needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;">made in 1 x PBS, pH to 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live Imaging Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td style="width:444px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture plates</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>353037</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine mesh stainless steel screen</td>
			<td>purchase at hardware store</td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas scientific&#160;</td>
			<td>4663H25</td>
			<td style="width:444px;">alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Instant glue</td>
			<td>purchase at hardware store</td>
			<td style="width:133px;">gel based preferrably</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 x 10 mm plates</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td style="width:133px;">351008</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7% agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;A9414</td>
			<td style="width:444px;">prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:133px;">26002-20</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol red free media (DMEM)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td style="width:133px;">21063-029</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td>AnaSed&#160;</td>
			<td style="width:133px;">139-236</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Matrigel</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:133px;">356231</td>
			<td style="width:444px;">basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3-4% agarose</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>A9414</td>
			<td style="width:444px;">prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaging of fixed intestines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td style="width:444px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vaseline</td>
			<td style="width:223px;">purchase at pharmacy</td>
			<td></td>
			<td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lanolin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma&#160;</td>
			<td>L7387</td>
			<td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paraffin</td>
			<td style="width:223px;">Surgipath</td>
			<td>39601006</td>
			<td>used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% glycerol in 1 x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Focus clear and Mount Clear</td>
			<td>CelExplorer Labs Co.</td>
			<td>&#160;F101-KIT</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling clay</td>
			<td>purchase at art supply store</td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double stick tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cotton applicator swabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm)</td>
			<td>Tissue Tek&#160;</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lab wipe</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:444px;">lint free delicate task wipe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Theiler staging chart&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica SP5X confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;">Used to conduct the live imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica DMI 6000 stand&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;">Used to conduct the live imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aqueous mounting medium (Prolong Gold)</td>
			<td>Molecular Probes&#160;</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials for Immunofluorescence staining of fixed, vibratome sectioned intestines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td style="width:444px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>&#160;3524</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td style="width:444px;">used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Goat serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:444px;">used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tween20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;P9416</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development

רוב התהליכים המוךפו&quot;גנטי במעי של העובר כבר משתמעים מסעיפים דקים של רקמות קבועות, מתן תמונות של שינויים לאורך שלבי התפתחות. מידע תלת ממדים מסעיפים סידוריים דקים יכול להיות מאתגר לפרש בגלל הקושי של שחזור קטעי סדרתי בצורה מושלמת ושמירה על הכיוון נכון של הרקמות על סעיפי סדרתי. הממצאים אחרונים על ידי Grosse et al., 2011 מדגישים את החשיבות של שלושה מידע ממדי בהבנת המורפוגנזה של villi הפיתוח של המעי 1. שחזור תלת ממדי של תאים במעי שכותרתו בנפרד, הוכיח כי רוב תאי אפיתל במעי פנו שני משטחי הפסגה ובסיסיים. יתר על כן, השחזור תלת ממדי של שלד התא אקטין במשטח הפסגה של האפיתל הראה שחלל המעי הוא רציף ושלומן המשני הוא חפץ של יםectioning. אלה שתי נקודות, יחד עם ההפגנה של הגירה גרעינית interkinetic באפיתל במעי, שהוגדרו אפיתל במעי מתפתח כהאפיתל pseudostratified ולא רובדו כפי שחשבו בעבר 1. היכולת להתבונן האפיתל בתלת הממד הייתה זרע להוכחת נקודה זו ומגדירה מחדש המורפוגנזה אפיתל במעי של העובר. עם התפתחות טכנולוגית הדמיה רב פוטון ותוכנת שחזור תלת ממדים, היכולת לדמיין ללא פגע, פיתוח איברים משתפר במהירות. שני פוטונים עירור מאפשר חדיר פחות מזיק עמוק יותר לתוך רקמות עם רזולוציה גבוהה. שני פוטונים הדמיה ושחזור 3D של המעיים עכבר העובריים השלם בולטון et al., 2012 עזרו להגדיר את הדפוס של סיסי תולדה 2. כאן אנו מתארים מערכת תרבות איבר שלמה המאפשרת פיתוח vivo לשעבר של villi והרחבות של מערכת שהתרבות כדי לאפשרהמעיים להיות בתלת ממד הדמיה במהלך הפיתוח שלהם.

תרבות של explants של מעיים של העובר כולו מאפשרת לניתוחים של המיקום, הפצה, ומשך הזמן של מולקולות האיתות שלתאם פיתוח מעיים, כמערכת זו מאפשרת המניפולציה של האיתות עם ריאגנטים תרופתיים או חלבונים רקומביננטי. מערכת תרבות transwell (איור 1 א, לשכפל ומולטון et al., 2012) 2 מספקת ממשק אוויר נוזלי, המאפשר למקום סמים או חרוזים agarose חלבון ספוג על הרקמות ובכך לבסס את מקורות איתות מקומיים (איור 1 ב ). מעיים שנקטפו מן העוברים בE10 לE18.5 לשרוד בתרבות בtranswells ולעבור גלים כמו נפיחה של תנועה. קרבים החלו בתרבות מE13.5 לשרוד כ 10 ימים או בערך לP3, השלב של פיתוח עכבר כאשר היווצרות קריפטה הוא ציין ראשון. למרות קרבים שלב מוקדם לשרוד בתרבות, מעיים שנקטפו לפניE12.5 לא לצאת villi באופן מהימן, ככל הנראה משום שserosa לא גדל כדי לכסות את המעי באותו זמן לחלוטין. אשכולות mesenchymal ליצור וvilli מתחיל לצוץ ולהאריך במעיים החלו בתרבות בE12.5, E13.5 או E14.5, אם כי התפתחות היא מעט התעכב בהשוואה לקבוצת ביקורת חסרת תרבות, בהתאמה במה (איור 1, לשכפל מet ולטון אל., 2012) 2. ללא קשר לשלב של המעי בתחילתה של התרבות (E12.5-E14.5), המעיים מופיעים תמיד יש עיכוב משוער של 24 שעות. מעיים E14 גדלו בתרבות במשך יומיים להציג צמיחה של villi שהם יותר דומים לאלה של מעיים E15 מאשר villi של מעי E16 גדל ברחם (תרשים 1C-F) 2. הדפוס הקבוע של אשכולות mesenchymal מתגלה על ידי שחזור תלת ממדי של חלקים אופטיים של PDGFRα GFP / + מעי שלם בE15.5 (איור 2 &lt;/ Strong&gt;, לשכפל ומולטון et al., 2012) 2. תמונה זו מורכבת מz-ערימות של 54 שדות מבט שתפורים יחד על ידי התוכנה לייקה LAS-AF. כל נקודה בתוך המעי היא מקבץ mesenchymal דמיין ידי GFP הגרעיני מתויג הביע ממוקד PDGFRα 14. הרזולוציה הגבוהה של התמונה מאפשרת לצופה להתמקד-באזורים מסוימים כדי לבחון את הפרטים, אך מספקת ביחסים במרחב עומק שלא ניתן ללמוד מן השדות אחת של מבט או הגדלת הספק נמוכה יותר. 1 סרט היא סדרת דריכה דרך z התפור תמונות -stack כי הם 3D משוחזר באיור 2. הסעיפים האופטיים הבודדים לאפשר להדמיה נוספת של פרטים כגון תאים בודדים בתוך האשכולות. סעיפים אופטיים של immunofluorescence wholemount של כלי דם במעיים עם נוגדני PECAM (BD Pharmingen 557,355; מדולל 1: 1,000) נתפסו באמצעות שני פוטונים עירור וreconstructed עם תוכנת Imaris (איור 3). תצוגה תלת ממדית של כלי דם במעי חושפת רשת סבוכה של כלי דם שלא ניתן להערכה באופן מלא על ידי הכנות סעיף דקות. סרט 2, הקרנה תלת ממדית תורנית של התמונה המשוחזרת באיור 3, מאפשרת להתחזקות נוספת של איך מידע עלה בשיעור של שחזור תלת ממדים הניתן יכול לשפר את ההבנה של דפוסים מבניים. חתך vibratome מאפשר צפייה תלת ממדית של המעי מתצפית רוחבית. באיור 4, מערכת היחסים של אשכולות פיתוח (מסומנים בPDGFRα GFP / +) 14 עם mesenchyme האפיתל והסביבה (מסומן בקרום עגבניות (Rosa26 MT / מ&quot;ג) 15 הוא ציין. לחלופין, מערכת יחסים זו יכולה להיות שנצפו על ידי immunofluore נוגדןצביעת scence (איור 5) של אשכולות mesenchymal (ירוק, שכותרתו עם אנטי PDGFRα (Santacruz C-20; מדולל 1: 200)) עם אפיתל (אדום, שכותרתו עם אנטי Ecadherin (Labs התמרה BD 610,181; 1: 1,000 דילול). מערכת תרבות איבר שלמה זה גם יכול להתארך כדי לאפשר לשני פוטונים הדמיה של פיתוח מעיים של העובר. בהגדרה זו, המעי העוברי מודבק קרום פוליקרבונט נתמך על ידי מסך רשת בצלחת תרבות גדולה יותר (איור 6). הגודל כן גדול יותר של צלחת התרבות מאפשר לעדשות מיקרוסקופ confocal ליצור קשר עם המעי בתוך היטב. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51817/51817fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. פיתוח של מעיים של העובר כולו במערכת תרבות transwell. () מעיים העובריים שהונחו על mem transwellbrane בצלחת תרבות 6 היטב עם תקשורת BGJb. שני קרבים העליונים הם E12.5, שני מעיים תחתון הם E13.0. חרוזים (ב &#39;) בסרום שור אלבומין הספוג agarose (כחול בהיר יותר) מונחים על תריסריון במערכת תרבות transwell. הכתם הכחול הכהה יותר הוא צביעת X-gal לPtc LacZ / + באשכולות mesenchymal קו עכבר כתב קיפוד סימון 16. (CF) צלב סעיפים של E14.0 הטרי שנקטפו (C), E15.0 (D) וE16. 0 (E) הרקמה, התריסריון המוכתם בE-cadherin (ירוקה) וDAPI (כחול). בE14.0, אפיתל לא עוצב מחדש, עדיין pseudostratified, ואילו בE15.0 וE16.0, villi המתהווה גלוי. קטע מעי זהה לזו שנצפתה ב( C), אבל בתרבית למשך יומיים (E14 (F) + 2days) מוכיח כי villi לפתח בתרבות, אם כי התעכב מעט. פנלים (CF) הם נדפסו מאל וולטון et., 2012 2 </<html> sup&gt;. Scalebars 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51817/51817fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51817/51817fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 שחזור תלת ממדי של שדות תפורים של z-ערימות מwholemount E15.5 PDGFRα EGFP / + מעי. התמונה היא שחזור חלקי (חמש 1 מיקרומטר חלקים ממרכז 65 z סעיפים) מ54 שדות תפורים מבט שנתפס באמצעות הבמה הממונעת של מיקרוסקופ confocal LeicaSP5X על עמדה הפוכה DMI 6000 עם עירור לייזר שני פוטונים ב900 ננומטר. תוכנה לייקה LAS-AF תפרה את Z-הערימות יחד כדי ליצור את התמונה כולה. Scalebar הוא 1 מ&quot;מ. n &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 51817 / &quot;width =&quot; 51817fig3highres.jpg 500 &quot;/&gt; שחזור איור 3 תלת ממדי של חלקים אופטיים מראים immunofluorescence אנטי PECAM wholemount של כלי דם במעי בתריסריון E14. סעיפים אופטיים נתפסו על מיקרוסקופ confocal LeicaSP5X על DMI זקוף 6000 לעמוד עם שני פוטונים עירור ב900 ננומטר ושלוש ממדי משוחזר באמצעות תוכנת Imaris 7.6.1. Scalebar הוא 200 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51817/51817fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4 תמונות Confocal של vibratome E15.5 PDGFRα EGFP מחולק / +; Rosa26 mTmG מעי ריק מראה את הקשר ההדוק של PDGFRα EGFP / + התאים של אשכולות mesenchymal (ירוק) עם האפיתל שמעליה ומקיף את mesenchyme (אדום; קרום עגבניות מRosa26 mTmG). &lt;<html> / Strong&gt; Scalebars 50 מיקרומטר בפנלים העליונים ו25 מיקרומטר בלוחות הנמוכים. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51817/51817fig5highres.jpg" width="500" /> .5 שחזורים תלת ממדיים איור של תמונות confocal ממעי vibratome מחולק E15.5 שהיו immunofluorescence נוגדן מוכתם. Scalebar הוא 50 מיקרומטר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51817/51817fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 הסתגלות של מערכת תרבות transwell הדמיה חיה 2 פוטונים. (א) רשת המסך ממוקם בצלחת תרבות. הקרום (B) פוליקרבונט הוא מודבק על גבי מסך הרשת. מעיים (C) דבוקים לממברנה פוליקרבונט ותרבותי עם תקשורת ללא DMEM פנול. &quot;&lt;סרט 1. סרט דריכה דרך כל Z-ערימת PDGFRα EGFP / + מעי wholemount באיור 1. סרט 2 סרט מסתובב המראה את השחזור תלת ממדי של החלקים האופטיים של כלי דם מוכתמים PECAM בתריסריון E14 באיור 2.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development at JoVE.com

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

mouse-fetal-whole-intestine-culture-system-for-ex-vivo-manipulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

14.8K Views.  University of Michigan. Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine. 

Video: Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...