נתמך בחלקו על ידי R01NS064593 וR21ES016636 (KV). מיקרוסקופי בוצע בVCU - מחלקה לנוירוביולוגיה מתקן מיקרוסקופי ואנטומיה, נתמך, בין השאר, במימון ה-NIH NINDS מרכז ליבת מענק 5P30NS047463. Confocal מיקרוסקופ הדיסק מסתובב נקנה בפרס ה-NIH NCRR (1S10RR027957).

הכנת תא א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts העיקרי אדם נורמלי (GM02270) התקבלו ממאגר Coriell סלולרי, קמדן, ניו ג&#39;רזי, והונצח עם 6 hTERT. תאים גדלו והתרחבו בCellStar מנות 6-סנטימטר בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של MEM בתוספת 20% בסרום עוברי שור (GIBCO), חומצות אמינו non-essential/essential, ויטמינים, פירובט נתרן, ופניצילין / סטרפטומיצין (HyClone ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליה עוברית אנושית 293 (HEK293) תאים נלקחו מאוסף תרבות סוג האמריקאי וגדלה והתרחבה בCellStar מנות 6-סנטימטר. התאים נשמרו בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של DMEM בתוספת חומצות 10% עובריים שור בסרום, שאינן חיוניות אמינו, L-גלוטמין, ופניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 53BP1-mCherry (N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; Addgene פלסמיד 19836) וH2B-GFP (pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד Addgene) גן היתוך הבונה גם לבטא את גני התנגדות G418 puromycin או, בהתאמה, transduced (fibroblaSTS) או transfected (HEK293) באמצעות SuperFect (Qiagene) לתוך תאים ונשמר תחת בחירת תרופה. תחזוקה של קרינה נבדקה מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24-48 שעות לפני רכישת תמונה, תאי trypsinized לתוך השעית תא בודד ונזרעו בצפיפות נמוכה על צלחות תחתונות 3.5 סנטימטר FluroDish זכוכית. </li></ol> התקנת מיקרוסקופ ב ויבוא תמונות פרוטוקול זה פותח באמצעות מיקרוסקופ הסלולרי Zeiss אובזרוור SD דיסק ספינינג confocal המצויד בZ1 עמדת AxioObserver, ערוץ כפול Yokagawa יחידת המז&quot;פ-X1a 5000 מסתובב דיסק, 2 מצלמות Photometrics QuantEM 512SC EMCCD, מאייר 120C HXP מבוסס סיבים, 4 לייזרים (Lasos 100mW רב קווי ארגון [458, 488, 514 ננומטר], 50 405 דיודה mW ננומטר, דיודה 40 MW 561 ננומטר, והדיודה ננומטר 30 mW 635), AOTF, מערכת Pecon XL multiS1 שלב דגירה, דגירת Zeiss מודולים (O 2 מודול S, CO 2 מודול S, S TempModule, ההסקה XL S) ומו לפנישלב torized XY עם תותב NanoScanZ piezo Z. כדי למזער את הסטיות כדוריות ואילו תאים חיים הדמיה תמכו במדיום מימי, 63x/1.20 מי C-Apochromat / קור אובייקטיבי עדשה ונוזל Zeiss Immersol W טבילה (עם מקדם שבירת n = 1.334) היו בשימוש. לערוץ 2 confocal הדמיה, RQFT מראה וBP525/50 Dichroic 405/488/568/647 (ירוק) וBP629/62 (אדום) מסנני פליטה היו בשימוש. תוכנת המערכת המשמשת הייתה Zeiss AxioVision (גרסה. 4.8.2.0) עם AV4 Multi-channel/Z/T, הדמיה מהירה, פיזיולוגיה, MosaiX, מארק ומצא, מצלמה כפולה, בתוך 4D, פוקוס אוטומטי ומודולים Deconvolution 3-D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא פועל כי 2 גז CO 2 למודול CO של מערכת הדגירה. אם מיקרוסקופ נתמך על ידי שולחן אוויר נגד רעידות, הדלק את אספקת האוויר (או 2 גז N) לשולחן האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הכח לעמדת מיקרוסקופ, יחידה מסתובבת דיסק, מצלמות, מודולים דגירה, מאייר HXP, שלב ממונע, ארגוןליזר, ומחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 דקות של זמן חימום, סובב את מפתח ההצתה לארגון הליזר ל&quot; ב &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה של ליזר Zeiss, מפעיל את המתגים לקווי הליזר לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את המתג עבור בקר Lasos ארגון הליזר מ&quot; מתנה &quot;ל&quot; טווח ליזר&quot; ולהתאים את בקר האור לרמה האופטימלית (כלומר בדיוק מתחת לנקודה שבה החיווי הירוק הופך לאדום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את AxioVision תוכנה. הערה: ממשק המשתמש עבור AxioVision יכול להיות מותאם אישית עם תפריטים וחלונות נפתחים שהם ספציפיים למיקרוסקופ במיוחד ורכיבים שהיא שולטת. ככזה, לכל מערכת יש ממשק פוטנציאל ייחודי. לכן, הנחיות כלליות למניפולצית תוכנה מסופקות בשלבים הבאים, ולא לכיווני חלונות ספציפיים תוכנה, כרטיסיות ו / או בתפריטים נפתחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 1 שעות לפני ההדמיה, בתוכנה, לאתר את הפקדים לחממה ולהפעיל את החימום לחדר העליון ואת צלחת השלב. הגדר את הטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס הפעל 2 שליטת CO ולהגדיר את הרמה של 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את העדשה האובייקטיבית להדמיה. במחקר זה, עדשת 63x/1.20 NA C-Apochromat מים / קור אובייקטיבי שמשה הערה:. לעדשה, בינוני טבילה עם מדד דומה למים (נוזל טבילת Zeiss Immersol W) שבירה הוא זקוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עמדות נפרדות מרובות הן שידגמו על פני תקופה ארוכה של זמן, כדי להיות בטוח יש למרוח כמות מספקת של מדיום טבילה כדי לוודא שהיא מתבצעת מתפקיד אחד למשנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת על הבמה ולהביא את העדשה האובייקטיבית עד במגע עם התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בפקדי מיקרוסקופ או בתוכנה, לכוון את האור הנפלט לעינית ובחר את המתאים widefield המסנן נקבע לאות הניאון של עניין (לצורך מחקר זה, &quot;אדום&quot; מסנן נקבע ל53BP1 ו&quot; GFP &quot;מסנן נקבע לH2B ). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו דרך העדשות העיניות, להתמקד בתמונה, ולאתר את השדה מתאים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או באמצעות תוכנה או פקדי מיקרוסקופ, לכוון את האור הנפלט מאת העינית ליציאה עם יחידת דיסק ספינינג confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, להפעיל את הליזר המתאים (למחקר זה, ליזר ננומטר 561 ל53BP1 וקו 488 ננומטר של ארגון הליזר לH2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל ערוץ, להתאים את עוצמת הליזר על ידי התאמת מסנן השליטה מתכוננת acousto האופטית (AOTF) לרמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המראה המתאים Dichroic (RQFT 405/488/568/647) ומסנני פליטה (BP 629/62 ל53BP1 וBP 525/50 לH2B). לפתוח את התריס ליחידת דיסק ספינינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את החלון &quot;החי&quot; כדי להציג את השדה הנוכחי של נוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה &quot;המצלמה&quot;, לבחור את המצלמה לשימוש (אם מערכת מצלמה כפולה) ולהגדיר את זמן חשיפה לכ 100 מילישניות. התאם% ו EM לקבל כמו נמ&quot;אהערת essary:. מבנה 53BP1-mCherry מופיע מעט עמום. מצאנו את זה מועיל כדי להגדיל את רווח EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנה, פתח את השליטה ליחידת דיסק ספינינג confocal ולהתאים את מהירות הדיסק מסתובב על ידי הזנת זמן חשיפת המצלמה שהוקם כדי ללכוד תמונה מתאימה (לדוגמה: ~ 100 ms). לחץ על &quot;גדר&quot; כדי לנעול בשינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח &quot;רכישה רבה ממדית&quot;. בחר בכרטיסיית הערוץ ולטעון / לבחור ערוצים מתאימים. במחקר זה, אנו משתמשים בערוצים שהוגדרו לdsRed (561 ננומטר עירור ליזר ו-BP 629/62 מסנן לפליטה) וה-GFP (488 ננומטר קו ליזר לעירור וBP525/50 מסנן לפליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח רישום תמונה, מראה Dichroic משותף (RQFT 405/488/568/647) שמש לשני הערוצים. הגדר את התוכנה ל&quot; פוקוס אוטומטי &quot;. הערה: עבור לעורך כלי → הגדרות כדי להתאים את ההגדרות של מד&quot;א. ודא שעוצמת הליזר הנאותה מוגדרת (&quot;כוח הליזר הולם&quot; מתייחס להגדרה המאפשרת לךכדי להלהיב fluorophore המתאים תוך מזעור תמונת הלבנה-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית Z-המחסנית. בחר &quot;Z-מחסנית במיקום המוקד הנוכחי&quot;. הגדר את הטווח ל~ 10 מיקרומטר Z-עורם ולבחור &quot;אופטימלי&quot; למספר צעדים על מנת להבטיח דגימת נייקוויסט דרך הערת ז&#39;: הגודל המדויק של Z-המחסנית יהיה תלוי בגובה של התאים שלך. בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 23. לחץ על &quot;התחל&quot; ולנתח את תמונת Z-מחסנית כתוצאה כדי להבטיח את ההגדרות מתאימות למה שאתה חוקר (למשל במחקר זה, היה חשוב לכל תמונה לגרעין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;T&quot; (זמן). לניסוי שלנו עם camptothecin, אנו קובעים את המרווח בין נקודתי זמן הדמיה עד 5 דקות והמשך הכולל של הישיבה לשעה 1 עבור וידאו שליטה (תאים שאינם מטופלים). הערה: כדי למזער את תמונת הלבנה-של התאים, הניסוי צריך להיות מוגדר כך שAOTF חסר הליזר בין נקודתי זמן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fאו הדמיה מרובה נקודות של מספר תאים במנה, בחלון מד&quot;א, בחר בכרטיסיית המיקום. ודא &quot;החל&quot; הגדרה לפני / אחרי נקודת זמן העמדה ל&quot; מסומנת. בחר &quot;Mark_Find&quot;. שימוש בתצוגה &quot;החייה&quot;, להזיז את קערת האוכל ובחר בשדות מתאימים של תצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot; בתפריט רב ממדי הרכישה כדי להתחיל את הניסוי ולהקליט וידאו שליטה (של תאים שלא טופלו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר וידאו השליטה, להוסיף את הטיפול המתאים (במקרה זה, camptothecin מיקרומטר 10). הקלטנו וידאו הניסיוני (תאים שטופלו בתרופה) במרווחי דקות 5-10 ל2-4 שעות. הערה: נושא חשוב שיש לשקול הוא המהירות שבה השפעת נתונה מתרחשת לאחר טיפול. כפי שניתן לראות בוידאו, 53BP1 המוקדים יתחילו מ~ 5 דקות אחרי תוספת של CPT. למרות תהליך קל יחסית, והוסיף תרופה למנה ידנית וכיול מחדש-מיקרוסקופ עושה ייקח זמן. שיקול שצריך לתת לזה בעת תכנון ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניטור מ &#39;itosis, אנו קובעים את המרווח ל -7.5 דקות ורשמנו ל4-5 שעות (ההגדרות הספציפיות תלויות בקו הסלולרי בשימוש, ואורכו של מחזור התא שלו). התאמות ייתכן שיהיה הצורך נעשתה כדי למנוע הלבנה-תמונה במהלך הקלטה ארוכה יותר. </li></ol> עיבוד וניתוח תמונת ג פרוטוקול זה פותח באמצעות תוכנת Volocity (PerkinElmer). תוכנה המשמשת לאיסוף נתונים זה (AxioVision) יש גם את היכולת לעבד ולנתח תמונות. משתמשים מוזמן לנצל את התוכנה הזמינה להם, ולהתייעץ ספרות מתאימה לגבי היישום שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת Volocity. צור ושם ספרייה חדשה, ולייבא את קבצי הווידאו שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בקבצים, אנחנו בדרך כלל למצוא את זה מועיל ביותר לשימוש בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot;. זה כופה את פרוסות Z-מחסנית ו, עבור פרוטוקול זה, מאפשר לנו לדמיין מוקדי 53BP1 באזורים שונים של הגרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם קטעי וידאו על פי צורך. ווlocity מצויד במגוון רחב של כלים כדי לשפר את איכות תמונות שנרכשו. על ידי הקפדה על ההגדרות במיקרוסקופ היו מתאימות, הרבה זמן ניתן לשמור בעריכה מאוחר יותר. לעתים קרובות, כדאי deconvolve התמונות שלך, ולהתאים את הבהירות / ניגודיות. צרכי העריכה הספציפיים שלך ישתנו בהתאם לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חותמת זמן יחסית וסרגל קנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפייה בתאים ב3-D, מעבר להגדרת &quot;3-D האטימות&quot;. זה מאפשר סיבוב של התאים שניתנו 3-D בחלל, ובכך לספק פרספקטיוות שונות על מבנים של עניין בתוך התאים. הערה: זה מועיל לחזות תאים במישורים שונים כדי לקבוע היכן מבנים של נסיעות ריבית. לדוגמה, בהגדרה &quot;המורחבת הפוקוס&quot; קשה להבחין ש53BP1 אין, למעשה, לנתק מהדנ&quot;א במהלך מיטוזה. עם זאת, זה ברור מב 3-D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטים ותמונות סטילס יכולים להיות מיוצאים למגוון סוגי קבצים המבוססים על העדפת משתמש. </l<html> i&gt; </ol> תוצאות מייצגות ד דוגמה להיווצרות 53BP1 מוקדים בתגובה לCPT מוצגת באיור 1. תאים נחשפים לצורת CPT מוקדים בתוך דקות 5-10, ולשמור על המוקדים האלה לכל אורך הקלטה. כפי שמוצג באיור 2, 53BP1 מנתק מהכרומטין בתחילתם של מיטוזה, יוצר אובך דק סביב הכרומוזומים העיבוי. כtelophase מתרחש מיטוזה ומגיעה לסיומו, שוב אגרגטים 53BP1 למוקדים נפרדים. בעוד HEK293 התאים לא היו חשופים לCPT, הם בכל זאת נוצרו מוקדים בשפע, ספונטניים 53BP1 תיקון שנוצרו על ידי ניזק לדנ&quot;א אנדוגני. התבוננות זו אפשרה לנו להגיע למסקנה ש53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה מוקדם, בקנה אחד עם דו&quot;ח קודם שהראה השפעה דומה לאחר חשיפת תאים לקרינה מייננת ותרופות radiomimetic 5. יור 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; האיור 1. Camptothecin (10 מיקרומטר) גורם DSBs והיווצרות המוקדים 53BP1 ברכיבה על אופני fibroblasts בתוך 30 דקות של הוספת התרופה לבינונית. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> איור 2. 53BP1 אינו מהווה מוקדים במהלך מיטוזה עד telophase/G1 בHEK293 תאים.

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שמירה על שלמות גנטית היא חיונית להישרדות תא. כישלון כדי לשמר את התוצאות הגנום במוקדם, היווצרות הסרטן, הזדקנות או מות 8. יש עניין רב בהבחנה כמה פונקציות DDR, נובעות מחשיבותו למחקר בסיסי וקליני. טכניקות רבות פותחו במשך השנים כדי לסייע במחקר של כמה תאים לזהות ולתקן ניזק לדנ&quot;א. שיטות מסורתיות כגון immunocytochemistry ומערבי מוחות היו מעמודי תווך של התחום, למרות התקדמות בטכנולוגיה אפשרה לשיטות מתוחכמות יותר ויותר כדי להתפתח. חי הדמית תא, כמפורט בפרוטוקול זה, מאפשר לנו ללמוד מאפיינים של DDR פסחו על ידי טכניקות מסורתיות יותר. מרכזי לשימוש בהדמית תא החייה הוא היצירה של חלבונים שכותרתו fluorescently. כאן אנו מתארים את השימוש בחלבון mCherry מתויג-המעורבים בDDR, 53BP1, כמו גם H2B היסטון-GFP מוצר היתוך. חלבונים שכותרתו fluorescently נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה מולקולרית ותאית, אולם הם אינם ללא המגבלות שלהם. חיבור מבנה רומן לחלבון אנדוגני יוצר סיכון הברור של שינוי תפקידו טבעי. בנוסף, יכולים ויבואו לידי ביטוי מבנים מסוימים ברמות שונות בשורות תאים שונות, בתנאים שונים. אנו צפינו ברמות חריגות של עוצמת ניאון בכל התאים המהונדסים גנטי המשמשים במחקר זה. 53BP1 לבנות בשימוש בפרוטוקול זה חסר תחומים פונקציונליים ביותר, עם זאת, הוא שומר על היכולת לקשור לאתרים של ניזק לדנ&quot;א שאינו נראה להשפיע לרעה על התא 2. בנוסף, חשוב לשקול את השיטה של ​​מסירת גן. בפרוטוקול זה, השתמש בשתי שיטות: transduction lentiviral וtransfection היציב. תאי lentivirus הנגוע יציבותם transduced עם מבנה הניאון;לכן, הם ימשיכו להביע את החלבונים אלה ללא הגבלה זמן. עם זאת, שיטה זו היא קצת יותר עבודה אינטנסיבית בהשוואה לtransfection ומוכתבת על ידי איזה סוג של תאים להיות ממוקדים; כמה תאים הם לא מקובל transfection היעיל. מצד השני, lentiviruses מסוגלת להיכנס רוב התאים, כולל אדם. חוקרים מוזמנים לשקול את היתרונות וחסרונות לכל שיטה כאשר מדובר בניסויים שלהם. כאמצעי אפשרי לעקיפת הבעיות הטמונות בחלבונים שכותרתו fluorescently, השימוש בבדיקות חדירות תאים שכותרתו fluorescently דווח לאחרונה לניסויי תא חיים 10. עם זאת, טכניקה זו עדיין לא מפותחת. יתרון עיקרי של הדמית תא חייה הוא היכולת ללמוד את יחסי החלל ובזמן של DDR ותיקון DSB. אכן, דימיטרובה et al. (2008) היו מסוגל להתבונן תאי חיים שכותרתו fluorescently ולחשוף רומן בלגבי היווצרות 53BP1 מחייב לטלומרים ואיך זה משפיע על דינמיקת הכרומטין. ניתוח זה יהיה באופן משמעותי יותר מאתגר, אם כי לא בלתי אפשרי, עם שיטות אחרות. לאחר היכולת לפקח DDR בזמן והמרחב מאפשר לנו להבחין בפונקציות ומערכות יחסים שאנו עשויים אחרת נתעלם מהם. לסיכום, שימוש בהדמית תא חייה מאפשר לחוקרים לעקוב קינטיקה של היווצרות ופתרון DSB בזמן אמת, ומאפשר ניתוח כמוני ברמת תא בודדה. בנוסף לטכניקה ששמשה במחקר זה, יישומים אחרים של הדמית תא חייה יכולים לשמש, כגון סריג וFRAP 3. הטכנולוגיה של תאי התבוננות בזמן האמת תמשיך להשתפר ונהג ללמוד מגוון רחב של תהליכים תאיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td></tr><tr><td> מנות תרבות CellStar </td><td> גריינר ביו אחד </td></tr><tr><td> מנות תחתית זכוכית FluroDish </td><td> עולם מכשירי דיוק, Inc </td></tr><tr><td> MEM תקשורת </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> ויטמינים </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; 19836 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss סלולרי אובזרוור SD הדמית המערכת </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (מהדורה 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W שמן </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> תוכנת Volocity (גרסה 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

הפסקות כפולות גדיל (DSBs) הן DNA המזיק ביותר נגעי תא יכול להיתקל. אם יצא שלא תוקן, פוטנציאל גדול DSBs נמל לייצר מוטציות וליקויים כרומוזומליים 1. כדי למנוע הטראומה הזאת מcatalyzing חוסר יציבות גנומית, זה קריטי לתאים כדי לזהות DSBs, להפעיל את תגובת הניזק לדנ&quot;א (DDR), ולתקן את ה-DNA. כאשר מגורה, DDR עובד כדי לשמור על שלמות גנטית על ידי מפעילת עצירת מחזור תא כדי לאפשר תיקון להתקיים או לאלץ את התא כדי לעבור אפופטוזיס. המנגנונים הבולטים של תיקון DSB מתרחשים דרך nonhomologous הסוף מצטרף-(NHEJ) וההומולוגי רקומבינציה תיקון (הרר) (שנסקר ב2). יש חלבונים רבים שפעילות חייבת להיות דווקא מתוזמרת לDDR כדי לתפקד כראוי. בזאת, אנו מתארים שיטה ל2 - ויזואליזציה 3-ממדית (ד &#39;) של אחד מהחלבונים האלה, 53BP1. חלבון p53 מחייב 1 (53BP1) localizes לתחומיםDSBs על ידי הקשירה לההיסטונים שונים 3,4, ויצר מוקדים בתוך 5-15 דקות 5. השינויים והגיוס של חלבוני היסטון 53BP1 ואחרים DDR לאתרי DSB הם האמינו כדי להקל על ההתארגנות המבנית של הכרומטין סביב אזורים של ניזק ולתרום לתיקון דנ&quot;א 6. מעבר להשתתפות ישירה בתיקון, תפקידים נוספים כבר תאר ל53BP1 בDDR, כגון הסדרת מחסום S תוך, מחסום G2 / M, והפעלת DDR חלבונים במורד זרם 7-9. לאחרונה, התגלה כי 53BP1 אינו מהווה מוקדים בתגובה לניזקי DNA הנגרמים במהלך מיטוזה, במקום לחכות לתאים להיכנס G1 לפני localizing לסביבה של 6 DSBs. חלבוני DDR כגון 53BP1 נמצאו לקשר עם מבני mitotic (כגון kinetochores) במהלך ההתקדמות במיטוזה 10. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של 2 ו - 3-D הדמיה חייה תא לדמייןהיווצרות 53BP1 המוקדים בתגובה לדנ&quot;א סוכן camptothecin המזיק (CPT), כמו גם התנהגותו של 53BP1 במהלך מיטוזה. Camptothecin הוא topoisomerase אני מעכב שבעיקר גורם DSBs במהלך שכפול הדנ&quot;א. כדי להשיג זאת, השתמש חלבון היתוך ניאון תואר קודם 53BP1-mCherry לבנות מורכב מחלבון תחום 53BP1 מסוגלת להיקשר 11 DSBs. בנוסף, השתמש חלבון היתוך ניאון היסטון H2B-GFP לבנות מסוגל לפקח דינמיקת הכרומטין לאורך מחזור התא אך בפרט במהלך 12 מיטוזה. הדמית תא חייה בממדים רבים היא כלי מצוין להבנה מעמיקה יותר של התפקוד של חלבונים בתאי DDR האיקריוטים.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ&quot;א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  Virginia Commonwealth University. פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

Video: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...