Name: a functional assay for gap junctional examination; electroporation of adherent cells on indium-tin oxide
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide at JoVE.com

We thank Lowell Cochran for expert videography assistance. The financial assistance of the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), the Canadian Breast Cancer Research Alliance, the Ontario Centers of Excellence, the Breast Cancer Action Kingston and the Clare Nelson bequest fund through grants to LR is gratefully acknowledged. SG was the recipient of an NSERC studentship. MG was supported by a postdoctoral fellowship from the US Army Breast Cancer Program, the Ministry of Research and Innovation of the Province of Ontario and the Advisory Research Committee of Queen&#8217;s University.

1 ציפוי התאים בלשכות Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במינרית זרימת מכסה המנוע, trypsinize התאים באמצעות טכניקה סטרילית כרגיל. הערה: חשוב מאוד לחסל על ידי צנטריפוגה כל העקבות של טריפסין, משום שהם עלולים לעכב התפשטות התאים על הזכוכית, ומכאן ההיווצרות של adherens וצמתים פער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 פיפטה מ&quot;ל של ההשעיה התא בתאי electroporation סטרילי מסופקים עם בelectroporator אתרו (איור 1), ומקום בC 37 o, CO 2 באינקובטור. הערה: הידבקות תא ניתן לשפר על ידי ציפוי על פיברונקטין, קולגן, פולי ליזין או דבק תאים ורקמות (ראה לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים יצרו שכבה ומחוברות הם מוכנים לבחינת GJIC. </li></ol> .2 Electroporation נוהל Electroporation לבדיקת GJIC יכולה להתנהל מחוץ למינרית זרימת מכסה המנוע,מאז זה לוקח רק כמה דקות. אם פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות לניסוי ספציפי, אז זה יכול להיות שנערך כולו בעלעלי זרימת מכסה המנוע. בכל המקרים, התאים שבו התאים גדלים חייבים להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן / פתרון צהוב לוציפר 5 מ&quot;ג מ&quot;ל: ממיסים אבקת 10 מ&quot;ג LY (מסופקת עם electroporator) ב2 מ&quot;ל מדיום גידול ללא סידן. בניסויים שדורש פעמים דגירה ארוכות יותר, מסנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום הגידול ולשטוף את התאים עם מדיום ללא סידן, נזהר שלא לשרוט את monolayer או לייבש את התאים. אם התאים מיובשים יש להם בדרך כלל גרעינים כהים יותר ולהרים LY ללא electroporation. ההשפעה בולטת יותר באמצע השקופית שיותר חשופה לטיוטות אוויר (איור 4F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipettor אפנדורף, פיפטה פתרון הצבע לתאים (400 μl לכל התא), בקצה של החדר, being נזהר שלא לגעת בשכבת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר בבעל שסופק עם electroporator ולהחיל דופק של הכוח המתאים (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לשאוב חלק מפתרון LY. זה ניתן לעשות שימוש חוזר בפעם שנייה לניסויים פחות חשובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ללא DMEM סידן המכיל סרום 10% dialysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 3-5 דק &#39;בחממה על מנת לאפשר העברת צבע דרך צמתים פער. הערה: ההכללה של סרום dialysed בשלב זה מסייעת סגירה נקבובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצבע מאוגדים עם ללא DMEM סידן להתבוננות תא חי. לחלופין, ניתן לתקן תאים בשלב זה, באמצעות התוספת של פורמלין 4% לטובים, ואז שטף עם PBS (פוספט שנאגרו מלוח). בכל המקרים הכביסה חייבת להסיר את כל הרקע. הערה: בניסויים ראשוניים כדי לקבוע את התנאים אופטימליים, אם המתח נמוך מדי, אז זה אפשרי לתת לתאים להתאושש בincubator לכמה דקות וelectroporate אותה השקופית פעם שנייה, כדי להציל את בעלות של שקופיות. </li></ol> .3 מיקרוסקופי בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת תאורת הקרינה, שימוש במיקרוסקופ הפוך מצויד במסנן המתאים לצבע בשימוש. לוציפר הצהוב, עירור הוא 423nm, 555nm פליטה, מסנן WBV למיקרוסקופ Nikon IX70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את השפעות המניסקוס על ידי הצבת כיסוי להחליק זכוכית על גבי הפלסטיק היטב, לאחר המילוי אותו לחלק העליון עם נוזל, לבחון מורפולוגיה של תאים תחת ניגוד שלב. לתמונות טובות יותר, גם יכול להיות מנותק מהשקופית, וcoverslip מונח על המסגרת. לתאים קבועים, גם יכול להיות מלא עם גליצרול להסתכלות מיקרוסקופית, ואילו לתאים חיים הוא חייב להיות מלא במדיום גידול. הערה: כביסה וצילום הוא קלה יותר אם התאים קבועים עם פורמלדהיד בעקבות ההעברה של הצבע (שלב 2.7 לעיל). אם התאים לאt קבוע, הקרינה מסולקת מהתאים בתוך כ 60 דקות בהתאם לסוג התא, המתח וכמות LY הציג ואילו בתאים קבועים הקרינה נשמרת למשך מספר שעות. עם זאת, הקרינה דועכת או מתפוגגת לאחר הדגירה O / N, אפילו בתאים קבועים. מסיבה זו, צילומים חייבים להיות מצולמים בקרוב לאחר electroporation (איור 2). </li></ol> .4 Quantitation של תקשורת בין תאית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את התאים עם מטרת 20x תחת הקרינה וניגוד שלב (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולסמן בכוכב את תאי electroporated בגבול עם האזור-electroporated שאינו (איור 2, חץ, קצה electroporation). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איורים 3 א ו 3 ב) לזהות ולסמן עם נקודת תאי fluorescing בצד הלא electroporated, שבו הצבע העביר דרך צמתים פער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את המספר הכולל שלfluorescing תאים באזור-electroporated שאינו במספר תאי electroporated לאורך הקצה (איורים 3 א ו 3 ב). הערה: ההעברה מלפחות 200 תאי גבול electroporated רציפים מחושבת עבור כל ניסוי. המספר שהתקבל הוא ערך GJIC. </li></ol>

<ol>
	<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Adherent+Cells+in+Situ+for+the+Study+of+Signal+Transduction+and+Gap+Junctional+Communication.">Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication.</a> Electroporation protocols. , 167-183 (2008).</li><li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking.">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li><li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway.">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li><li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth.">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li><li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ets+up-regulates+met+transcription.">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li><li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels.">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li><li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+human+T+cell+anergy:+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1.">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li><li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation;+electroporation+of+[alpha-32]GTP.">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li><li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells.">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li><li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides:+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins.">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li><li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis.">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li><li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+adherent+cells+in+situ.">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li><li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy.">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li><li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions.">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li><li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap;+regulation+of+gap+junctional,+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors.">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li><li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death.">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li><li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrape-loading+and+dye+transfer:+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication.">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li><li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular,+junctional+communication;+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide.">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA &amp; Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li><li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+gap+junctional,+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes.">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li><li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+assay+for+intercellular,+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells.">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li><li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells.">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li><li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts.">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li><li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured,+human+lung+carcinoma+cells.">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605 (2012).</li><li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes.">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA &amp; Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li><li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities.">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li><li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA.">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li><li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac/Cdc42+and+Stat3.">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li><li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide.">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li><li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1/2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide.">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li><li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels.">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li><li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis.">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li><li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts.">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li><li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells.">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li><li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells.">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li><li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen.">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li></ol>

The corresponding author is the inventor in a patent held by Queen&#8217;s University, which has been licensed to Cell Projects Inc. The company or the University had no influence upon the contents of the paper.

שלבים קריטיים בפרוטוקול חומר Electroporated טוהר של החומר המיועד לelectroporated הוא מאוד חשוב. אם התאים מאוד שטוחים, ריכוזים אז גבוהים יותר של צבע המעקב חייבים להיות בשימוש (עד 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל לLY) ובמקרים כאלה, טוהר חשוב עוד יותר מאשר בתאים עם צורה כדורית יותר 1. חוץ LY מגוון גדול של צבעים אחרים או מולקולות nonpermeant להיות מועסק, כגון סדרה של צבעי Alexa להשתמש כמו בדיקות לערוצים בהיקף של connexins שונה 25. עם זאת, צבעים כגון Ethidium ברומיד או יודיד Propidium הם intercalated בDNA כדי שהגרעינים לזרוח בצורה חזקה מאוד, מה שהופך את לכמת את העברת צבע קשה יותר (איור 4D). צבעי המעקב חייבים להיות מוכנים ושוטפים שנערכו במדיום גידול ללא סידן, משום שזרם סידן עלול להפריע לתקשורת junctional, כמו גם להפחית celכדאיות l. כל הפתרונות חייבים להישמר על 37 o C לפני electroporation, המאפשר סגירה נקבובית ו1 כדאיות. קביעת המתח והקיבול האופטימלי עוצמת שדה חשמלית היא פרמטר קריטי לחלחול תא, כמו גם יכולת קיום. היישום של פולסים מרובים הוכח להציע תוצאות טובות יותר במונחים של חלחול וכדאיויות תא מאשר דופק יחיד. מנגנון Insitu Porator של פרויקטים תא יש שלוש הגדרות לקיבול ומספר דופק: קל (10 פעימות, 10 מלבד מייקרו-שניים, 0.1 שניות בין פולסים), בינוני (20 קטניות, 80 מלבד מייקרו-שניים, 0.2 שניות בין פולסים) וחזקות (50 פולסים , 120 מייקרו-שניות בנפרד, 0.5 שניות בין פולסים), בזמן שהמתח יכול להיות נשלט היטב באופן עצמאי (2-45V). למעשה, תאים שטוחים דורשים מתח נמוך יותר מאלה ששינו, תאים בגוש או תאים עם שטח הדבקה קטן לתשתית (למשל, תאי החרקים SF9), ככל הנראה בשל סכומים החולפים הנוכחיים הגדולים יותר דרך תא מורחב שנמצא במגע עם אזור מוליך גדול יותר. לפרטים נוספים בנושא זה, ראה 1. בעיות ופתרון בעיות פוטנציאליות אם התאים כבר גירדו במהלך המניפולציות, הם עשויים להרים את הצבע ולזרוח ללא electroporation (איור 4 א). כמות האנרגיה מועברת לתאים משפיעה על היעילות של electroporation. אם הדופק חלש מדי (כלומר, מתח נמוך מדי והגדרות דופק), אז התאים נראים תקינים תחת ניגוד שלב, אבל הם לא לזרוח, מלבד אולי לתאים מסוימים שעשויה להיות מתים או שגרדו במהלך המניפולציה (איור 4 א) . תופיע אם הדופק חזק מדי, תחת תאי ניגוד שלב יש גרעינים כהים מאוד (איור 4), אך היא עשויה לשמור כמה LY, ואף לאפשר לחלק מהעברת צבע לתאים שכנים. בערבn פולסים גבוהים יותר התאים נהרסים (איור 4C). תאים אלה הם lysed, ולכן הם אינם שומרים LY ולזרוח מאוד חלש, אם בכלל. קווים מסוימים אפיתל תאים כגון מבני כיפת טופס T51B אשר עשוי לרדת בזמן שינויים בינוניים. תאים המקיפים את יכולים אז לזרוח כצבע ניתן להעביר דרך צמתים פער (איור 4E). דוגמאות לתנאי electroporation אופטימליים לקווי נציג מוצגות בטבלה 1. יתרונות על פני שיטות ומשמעות אחרות מבוא DNA יש מספר גדול של פרוטוקולי transfection, כגון שיתוף משקעים סידן פוספט 26 או מיני יפוזומים שונים. עם זאת, הם עשויים להשפיע על התאים בדרכים עדינות שעשויות להיות חשובים מאוד, במיוחד ללימודים הולכים אותות. לדוגמא, זירחון Tyr-705 של מתמר האות וactivator של תמליליון-3 (STAT3) אשר בקורלציה עם פעילות תעתיק שלה גדלו באופן דרמטי על ידי ההליך של transfection סידן פוספט גם בהיעדרו של DNA. זה יכול להיות בגלל העובדה שהמשקע משנה תא להידבקות תא ואירוסי cadherin, activator STAT3 ידוע 27. היו לי יפוזומים מסוימים אפקט דומה אך פחות בולט, בעוד electroporation או זיהום retroviral לא השפיע על רמות STAT3 6. כניסתה של פפטידים שיטה נפוצה היא הבנייה של פפטיד התמזגות עם רצפים החוצים את קרום התא, כגון נגזר מגן HIV-מידה. עם זאת, ההעברה דרך הקרום היא תהליך איטי יחסית ועיכוב אות אינו יעיל כ. לצורך המחקר של הרצף של אירועים המתרחשים הפעלת קולט הבאה על ידי ליגנד, היכולת להקדמה מיידית של פפטיד, peptidomimetic או אחר מתחם מציעה advantag חשובדואר. Electroporation של פפטיד תא חדיר כדי להאיץ את ספיגת שלו היא לא אפשרית, סביר להניח כי פפטיד lipophilic מוטבע לתוך קרום התא, כפי שנחשף בפפטידים מצמידים FITC (Raptis, לא פורסם). זה מעניין לציין כי העיכוב של הפעלת Erk ידי EGF באמצעות פפטיד החדיר תא חוסם תחום Grb2-SH2 למשל, היה חלקי בלבד 28, בעוד electroporation של אותו פפטיד השיג עיכוב של האות 29 מלא ( איור 5). טכניקות אחרות, המבוססות על יפוזומים גם הן בקיום. עם זאת, הם אינם מאפשרים הבחינה של צד תאים שלא טופל על ידי צד עם אלה שטופלו, בשיתוף עם מחקרי צומת פער, אשר יכולה להציע ההפגנה האפשרית החזקה ביותר שעיכוב האות חייב להיות בגלל שהוצגו החומר (איור 5, משורבט סוגר , ג). מחקרי צומת גאפ Microinjectionשל צבעים או לגרד טעינה בדרך מועסקים, אבל הם תמיד להציג את הנזק לתאים. טכניקה נוספת, התאוששות הקרינה לאחר photobleaching לא פולשנית אבל זה דורש ציוד יקר, וניתן לבחון כמה תאים בכל פעם, בעת היווצרותם של חומרי phototoxic עשויה להיות בעיה. Assay המצנח מורכב של תאים טרום טעינה עם AM calcein הצבע (הירוק), ואז לתת לתאים לדבוק על שכבת תאים, כצומת פער יוצרים בתוך 15 דקות-3 שעות. מספר גדול של תאים יכול להיות מטופלים בדרך זו, אבל היכולת של התאים ליצירת צמתים פער בassay זה משתנה מאוד בהתאם לסוג התא 30. מגבלות המתח הנדרש הוא גבוה יותר עבור כניסתה של מולקולות בגודל גדול יותר ומטענים חשמליים. במתחים גבוהים הנדרשים לכניסתה של פלסמידים גדולים, ייתכן שיש כמה מוות של תאים. המתח היחסי הנדרש למולקולות שונותתוארו בעבר 9,12. למרות שאנו מתארים את electroporation באמצעות מנגנון electroporation ספציפי, זה אפשרי עבור מישהו מנוסה עם מכשירי חשמל כדי לעשות את זה באמצעות התיאור מפורט ב19, או להפוך את התקנה פשוטה עם אלקטרודה עליונה מעל התאים, ולחרוט עם חומצות 1. כיוונים עתידיים תוכנה פותחו על מנת לכמת באופן מדויק ביום 31 בGJIC. שיפור נוסף הוא הפיתוח של נקודות קוונטיות שלזרוח רק ברגע שהם נמצאים בתא, כך שאין צורך לשטוף את הצבע שאינו מאוגד. זה ימנע את הלחץ של כביסה, ואילו ניתן לצפות בתהליך בתאים חיים, אינו קבועים בזמן אמת. כניסתה של פפטידים להפריע מסלולי איתות היא גישה רבת עוצמה להערכת vivo של הרלוונטיות של אינטראקציות שזוהו תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. הבדיקה של הסירential של פפטידים שונים כדי לעכב מסלול ספציפי הוא הצעד הראשון חשוב בפיתוח תרופות peptidomimetic, לטיפול הרציונאלי של גידולים. תגובות אחרות ניתן לכבס את השקופיות עם Extran-1000 פתרון באמצעות מכחול קטן להגיע אל פני השטח איטו בבאר, ושטפה במים. אם התאים תוקנו בשקופית, זה עשוי להיות נחוץ כדי להסיר עקבות של חלבון עם טריפסין או באנזימי מפרקי חלבונים אחרים ראשונה. יש להימנע מחומרי ניקוי המכילים נתרן Dodecyl סולפט. ניתן לעקר שקופיות נשטפות עם גז חמצן. עם זאת, זה מאוד חשוב כדי למנוע שבירת החותם של היטב לשקופית, כי אם כל הדלפות פתרון LY בבעל שהוא עשויה לגרום לקצר.

היישום של זרם חשמלי לתא גורם להיווצרות של נקבוביות על קרום התא, על ידי electroporation תהליך המכונה. הנקבוביות לאפשר המעבר של מגוון רחב של מולקולות nonpermeant דרך הממברנה. השדה החשמלי ניתן לשלוט במדויק, כך שנקבובי שנוצרו הם קטנים מאוד וreclose במהירות, עם הפרעה מינימאלית לפיסיולוגיה התאית. מעניין, ניתן לגדל תאים חסיד בשקופית זכוכית מצופה בתחמוצת מוליך ושקופה אינדיום פח (איטו) וelectroporated באתר, שעל פני השטח שבו הם גדלים, ללא ניתוק להיות electroporated בהשעיה. תאים יכולים לגדול היטב על פני השטח זה, וכפי שהם מחוברים והאריכו, התצפית מיקרוסקופית מפורטת אפשרית. שימוש בטכניקה זו, יכולה להיות הציגו מולקולות nonpermeant קטנות באופן מיידי ולמהות 100% מהתאים, מה שהופך את הטכניקה זו מתאימה במיוחד למחקרים על ההפעלה של components של מסלול בעקבות הגירוי ליגנד של קולט (שנסקר ב1). Electroporation כבר בשימוש בעיקר עבור כניסתה של DNA (electrotransfection המכונה גם). עם זאת, electroporation באתר יכול להיות בעל ערך עבור כניסתה של מגוון רחב של מולקולות, כגון פפטידים 2-4, oligonucleotides, כגון RNA antisense, oligonucleotides פעמיים תקועים דמה DNA לעכב גורם שעתוק מחייב, או siRNA 3,5, 6 נוקלאוטידים, רדיואקטיבי 7-10, חלבוני 11 12 או בעד סמים 13. בעקבות electroporation, ניתן lysed תאים עבור ניתוחים ביוכימיים או קבוע ומוכתם עם נוגדנים. ציפוי איטו המוליך הוא דק מאוד, 800-1,000Å, כך שצמיחת תאים אינה מופרעת על ידי ההבדל בגובה של שני משטחים, כתאים לגדול מעבר לקצה של ציפוי המוליך. זו מציעה את היתרון שאינו electropניתן לגדל תאים נאמו לצד אלה electroporated, שישמשו כבקרה. אותה הגישה יכולה לשמש לבחינת הפער junctional, תקשורת בין תאית (GJIC), כפי שמתוארת בווידאו. צמתים פער הם ערוצים המחברים את הפנים של תאים סמוכים 14. פער junctional, תקשורת בין תאית משחקת תפקיד חשוב בהיווצרות גידולים וגרור, ואילו אונקוגנים כגון Src לדכא GJIC 15,16. כדי לבחון GJIC צבע ניאון כגון צהוב לוציפר (LY) הוא הציג לעתים קרובות לתוך תאים בתרבית באמצעות microinjection או לגרד טעינה 17 ודיפוזיה של הצבע לתוך תאים שכנים הוא ציינה מיקרוסקופי תחת תאורת פלואורסצנטי. טכניקות אלו אולם תמיד לגרום נזק לתאים. עכשיו אנו מתארים טכניקה שבה תאים גדלים בשקופית זכוכית שמצופית בחלקו עם איטו 18. דופק חשמלי היה מוחל בנוכחות LY (או צבעים אחרים) caבאמצעות החדירה שלה לתאי גידול בחלק המוליך של השקופית, ואילו הגירת צבע לתאים הסמוכים, שאינו electroporated נצפתה מיקרוסקופית באמצעות תאורת פלואורסצנטי. כדי להימנע מתאים רגישים מטרידים שעשויות נוטים להתנתק מmonolayer, הרכבה תוכננה שלא דורשת אלקטרודה שממוקמת על גבי התאים ליישם את 19 הזרם החשמלי. גישה זו מציעה את היכולת לכמת GJIC במספר גדול של תאים, ללא כל הפרעה לגילוי לחילוף חומרים תאיים, כפי שצוינה על ידי בהעדר השפעה על אורכו של שלב G1 בעקבות גירוי סרום 12, להגדיל ברמות של FOS חלבון protooncogene (Raptis, לא פורסם) או שני קינאז הקשורים ללחץ סלולארי, חזיר p38 או JNK / SAPK קינאז 1. גישה זו התאפשרה הבדיקה של הקשר בין רמות ביטוי אונקוגן, השינוי וGJ18 IC, כמו גם את ההשפעה של Src וSTAT3 על GJIC במגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאים טריים תרבותיים מדגימות גידול ריאות 20-23. בנוסף, באתרו electroporation עם ההתקנה תוארה שאין בו אלקטרודה עליונה כבר מועסק בהצלחה להפגנה של סגירת צומת פער על בידול adipocytic, למרות שקובץ מצורף סלולארי למצע מצטמצם בשלב ש19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM without Calcium</td><td>Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Donor Calf Serum&amp;nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td><td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation apparatus</td><td>Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/</td><td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-wells</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-wells</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Cell Projects Ltd UK</td><td>ACE-25-LY</td><td>High purity</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Cell and tissue adhesive</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

a functional assay for gap junctional examination; electroporation of adherent cells on indium-tin oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

איור 2 מראה תאי כבד החולדה T51B אפיתל 22, electroporated עם LY וצילמו מתחת לקרינה (פנל וארוחת בוקר), או שלב בניגוד תאורה (C), הבאים קיבעון וכביסה. בפנל, בקצה אזור electroporated מסומן באדום. השיפוע של הקרינה בצד הימין של הקו האדום מציין העברה דרך צמתים פער. באיור 3 א ו 3 ב, לכמת את תקשורת junctional הפער מוצג: התאים בקצה אזור electroporated זוהו וסומנו בכוכב, ואילו תאים שבהם הצבע העביר היו מסומנים בנקודה. היחס מציג את המספר הממוצע של תאים שהצבע הועבר ל, לכל תא גבול electroporated. בדוגמא זו יש 57 נקודות ו10 כוכבים, כלומר, GJIC = 5.7. ב C ו D, מתמר האותות וActivator של תמלול-3 (STAT3) כבר downregulated בt תאי T51Bביטוי hrough יציב siRNA עם וקטור lentiviral, וזה גורם לירידה בGJIC, כפי שמוצג על ידי absense של העברה 22. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig1highres.jpg" /> איור 1 אלקטרודה Electroporation והרכבת שקופיות. () יכול לצפות בלמעלה: תאים גדלים בשקופית זכוכית, מצופים בתחמוצת מוליך ושקופה אינדיום פח (איטו). תא פלסטיק הוא ערובה לשקופית, כדי ליצור מיכל לתאים וLY. הציפוי הוא בקו ישר באמצע, בעצם יוצרים שתי אלקטרודות לייזר חרוט. סכר משמש להסיט כלפי מעלה הנוכחיים, ובכך ליצור מעבר חד בעוצמת שדה חשמלית. על מנת לספק שטחים שאינם מוליכים, איטו גם חרוט בשני מלבנים. (חצים אדומים) זרם מגנרטור הדופק זורמים מכל נקודת מגע לאחר, באמצעות כביש מוליך בין המלבנים, מתפשטים בישיריון במקביל למחסום האמצעי, אז על הסכר דרך המדיום לצד השני, electroporating התאים באזורים במקביל לסכר. לשם בהירות, החלק הקדמי של התא מוסר מבט צד (B).: השקופית עם התאים גדלו על איטו (אור הירוק) מצופה ואזורי זכוכית חרוטים, חשופים מוצגת. כאשר מדיום electroporation מכיל LY מתווסף לחדר לרמה מעל הגובה של הסכר אז נתיב חשמלי בין האלקטרודות (+) ו( -), ותאי גידול באזור זה, נוצר. שים לב ששכבת איטו מוצגת עם עובי מוגזם לבהירות למרות שהעובי שלה בפועל (800) הוא הרבה פחות מהעובי של התאים. (C) השטח של תאי electroporated electroporated ולא מוצג מוגדל. הצבע הוא צפוף ליד הסכר שבו כל תאי electroporated ונמוג על פני קצה electroporated כריכוז מחליש דרך transf צומת פער מרובהERS. חצים גדולים להראות את הכיוון של העברת צבע דרך צמתים פער. שים לב שהגודל והעובי של התאים מוגזמים לבהירות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig2highres.jpg" /> איור 2 Electroporation של T51B, תאי האפיתל כבד חולדה. LY היה electroporated לתוך תאי T51B כבד החולדה אפיתל (קל, 12 וולט). בעקבות 5 דקות. דגירה, תאים צולמו תחת הקרינה תאורה (A, B) או בניגוד שלב (C). שים לב להעברה הנרחבת דרך צמתים פער, שמוצגת על ידי השיפוע של הקרינה, המשתרעת מקצה שטח electroporated (החיצים, קו אדום ב). בה בעת, אין נזק נראה לעין לתאים,<html> s ראה תחת שלב בניגוד (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig3highres.jpg" /> Quantitation .3 איור של העברת צומת פער. התאים בקצה אזור electroporated שהרים LY ידי electroporation (תורמים של LY לתאי electroporated לא) סומנו בכוכב. תאים שבי LY מועבר לתוך צמתים פער באמצעות סומנו בנקודה. ב (א) ו (ב), יש 57 נקודות ו10 כוכבים, כלומר, GJIC = 5.7. תאים ב( C) ו( ד) אין לי צמתים פער, כפי שמוצגים על ידי העדר שיפוע של הקרינה. חיצים מצביעים על קצה שטח electroporated. בר = 100 מיקרומטר.es / ftp_upload / 51,710 51710fig3highres.jpg &quot;target =&quot; / _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig4highres.jpg" /> תאי .4 T51B () איור שניזוקו על ידי גירוד במניפולציה. תאים אלה יכולים להרים LY גם ללא electroporation ועלולים להעביר אותו לשכנים שלהם דרך צמתים פער. (B) ותאים (C) שנפגעו בדופק כי הוא חזק מדי. תאי האפיתל כבד החולדה T51B (ב) היו electroporated בהגדרה קלה , 20 וולט. התאים בצד השמאל של הקו חרוט (חץ) ניזוקו על ידי electroporation. במקרה זה התאים לא לנתק, אך מבט מקרוב על תצלום ניגוד השלב (פנל באמצע, חץ לבן) מציג את התאים שיש גרעינים כהים, תוך שהם לזרוח מאוד חלשים, אם בכלל (הפנל העליון). עם זאת, להעביר הצמתים פער גסים ניכר, לתאים בצד ימין שאינם electroporated. התצלום התחתון נעשה על ידי שילוב של UV ותאורה בניגוד שלב, כדי להקל על צפייה של הקצה של electroporation. תאי האפיתל של כבד (C) T51B עכברוש electroporated בהגדרה בינונית, 30 וולט. התאים בצד השמאל של הקו חרוט ניזוקו קשות על ידי הדופק. שים לב איך שהתאים יורדים ולא לזרוח. חלק מהניצולים מסביב לקצה שהרימו LY ואשר נראו כי העברתו לשכניהם מימין דרך צמתים פער. תאי T51B (D) electroporated עם 10μg / מ&quot;ל יודיד Propidium. שים לב לצביעה האינטנסיבית של הגרעינים. (E) כיפות של תאי האפיתל. תאי T51B electroporated בהגדרה עדינה, 15 וולט. שים לב גם electroporation של תאים בצד השמאל. עם זאת, כאשר מחוברות, תאי T51B ליצור כיפות שעשויות לרדת בזמן מניפולציה ושטיפה, והתאים המקיפים רשאי ת&quot;אKe עד LY. שים לב להעברת הצבע הנרחב. תאים (F) שהתייבשו יכול להרים LY ללא electroporation.The מדיום גידול הוסר מתאי T51B ותאים נשארו במינרית זרימת מכסה המנוע ל30 דקות. LY היה שיצטרף בעתיד לתאי דקות 1 ותאים היו קבועים לאחר מכן, שטפו וצילמו מתחת לקרינה (פנל עליון) או שלב בניגוד (פנל תחתון) תאורה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/51710/51710fig5highres.jpg" /> איור 5 פפטיד חסימת Grb2-SH2 מעכב הפעלת Erk תיווך EGF בתאים שלמים, חיים. שילוב של לימודי GJIC והעברת אותות. בעקבות יגנד המחייב, מספר הקולטנים גורם גדילה כגון עוריות Growth Factor Receptor (EGFR) הוא טרנס פוספורילציה על שאריות טירוזין ספציפיות. אלה מהווים אתרי עגינה עבור SRC-הומולוגיה-2 תחומים של מתמרים אות כגון Grb2, שהוא חייב sos הגורם חילופי GTP / התמ&quot;ג, אשר ובכך הוא הביא לי הקרום ומפעיל ראס. התוצאה היא ההפעלה של מפל Raf / Mek / Erk וזירחון של Erk ברצף P TE P Y. לכן, חיטוט עם נוגדני phospho-Erk ספציפיים יכול להיות מדד להפעלה של הקולטן EGF. בעקבות קיבעון, תאים מששו עם נוגדן אנטי הטבה (איתות תא), ואחריו נוגדן בשילוב ביוטין המשני, לסוסים-הצנון streptavidin peroxidase ומצע diaminobenzidine, אשר נותן צבע 29 חום. בניסוי זה, phosphopeptide חסימת תחום Grb2-SH2 (PVPE p Y INQS) הוצג על ידי בelectroporation האתר iתאי n כדי NIH 3T3 גדלו בתאי electroporation וצמיחה נעצרו במדיום בילה. 5 דקות לאחר יישום דופק, תאים היו מגורה עם EGF למשך 5 דקות, קבוע, חקרו למופעל phospho-Erk1 / 2 על ידי תאי stainingand אימונו-פרוקסידאז מאותו השדה שצולם תחת brightfield (למעלה) או בניגוד שלב תאורה (בחלק תחתון). שים לב שפפטיד חסימת Grb2-SH2 דרמטי הפחית את אות EGF, כלומר, זירחון Erk (אזור). העיכוב של האות משתרע לתוך ~ 3-4 שורות של תאים סמוכים באזור שאינו electroporated (משורבט סוגר), כנראה עקב תנועה של פפטיד דה 1,123 דרך צמתים פער. ממצא זה מהווה ראיה חותכת לכך שהעיכוב שנצפה חייב להיות בגלל פפטיד, ולא תוצר של electroporation, שכן תאים באזור זה לא קיבלו שום נוכחי, אבל רכשו את הפפטיד משכניהם. בה בעת, אין כל השפעה לגילוי על מורפולוגיה של תאים כמוצג על ידי ניגוד שלב. חץ מצביע על קצה שטח electroporated. הגדלה: 240x. לפרטים ובקרות נוספים, ראו התייחסות 29. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51710/51710fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide at JoVE.com

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Views.  Queen's University. This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

Video: A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bioengineering

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Developmental Biology

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Neuroscience

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

<meta charset="utf8"></head><body>שיטת TEEI לניתוח אלקטרופורציה וחיזוי מסירה בתאי A431

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other types of intracellular delivery, PSEP relies heavily on fluorescent markers and fluorescent microscopy to determine successful delivery. To gain insight into the intermediate steps of the electroporation process, a PSEP platform with integrated transepithelial electrical impedance (TEEI) monitoring was developed. Cells are cultured in commercially available inserts with porous membranes. After a 12 h incubation period to allow for the formation of a fully confluent cell monolayer, the inserts are placed in transfection media located in the wells of the PSEP device. The cell monolayers are then subjected to a user-defined waveform, and delivery efficiency is confirmed through fluorescent microscopy. This workflow can be significantly enhanced with TEEI measurements between pulsing and fluorescent microscopy to collect additional data on the PSEP process, and this additional TEEI data is correlated with delivery metrics such as delivery efficiency and viability. This article describes a protocol for performing PSEP with TEEI measurements.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אופטימיזציה של אלקטרופורציה של מצע נקבובי באמצעות מיקרו וננו-ערוצים לניטור משופר ואפיון שלב ביניים

Porous substrate electroporation (PSEP) pairs consistent, high throughput delivery with high cell viability. Introduction of transepithelial electrical impedance (TEEI) measurements provides insight into the intermediate processes of PSEP and allows for label-free delivery. This article discusses a method for performing PSEP delivery experiments and TEEI measurement analysis simultaneously.

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

פיתוח של

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

פיתוח של

Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים