אנו מכירים את איימי Thomasson על סיועה בהכנת כתב היד הזה, ופרדריק Skarstedt וריאן כריסטי על מאמציהם בהכנה של דמויות.

עם אישורו של דירקטוריון סקירה המוסדי, חיפוש של מסד הנתונים מעבדה האלקטרוני בוצע לזהות קבוע פורמלין, פרפין המוטבע בלוקים (FFPE) המייצגים מקרים של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת עיכול ביופסיות (GI) שאובחנו על ידי histopathology (hematoxylin ו eosin (H &amp; E) ו / או אימונוהיסטוכימיה (IHC)). 1. עיבוד רקמות מרקמות FFPE GI ביופסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף בלוקים רקמת הביופסיה FFPE GI לציטומגלווירוס (CMV) תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). בלוקים אלה מאוחסנים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות microfuge 1.7 מיליליטר מראש תווית עם מספר זיהוי הייחודי של הבלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את Handwheel microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיאט גוש הרקמה לתוך מהדק הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין טרי, שאינו בשימוש, ויישר את הבלוק לזווית הסכין על microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את microtome לחתוך 10 מיקרומטר חלקים עבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעילת הHandwheel דואר ומראש לחסום כיוון הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 5 סעיפים של הבלוק ב10 מיקרומטר מרווחים עבים, המאפשר לכל חתך לגלגל לגלילה של רקמה. ודא כי כל מגילה מכילה ייצוג נאות של רקמות ביופסיה הרצויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את Handwheel microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, למקם את כל 5 המגילות של רקמה לתוך צינור צנטריפוגות מראש שכותרתו, נזהר רק לתפעל את המגילה על ידי פרפין על מנת להפחית את הפוטנציאל לזיהום לחצות. הצמד את הכובע על הצינור ומניח אותו בחזרה על המדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את חסימת הרקמה מmicrotome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק את הלהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר כל משטחים או מכשירים שייתכן שבאים במגע עם הרקמה הקודמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח להב טרי, שאינו בשימוש לתוך מחזיק הסכין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4-1.14 עבור כל בלוק נוסף לעיבוד. צינורות microfuge המכילים את מגילות הרקמה עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד timדואר של מיצוי DNA. </li></ol> 2. מיצוי DNA ממגילות של רקמות FFPE GI ביופסיה הערה: פרוטוקול זה מותאם מהעלון של ערכת FFPE רקמת DNA חילוץ (זהירות: מתייחס לגיליון בטיחות חומרים (MSDS)). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת קסילן 1 מיליליטר (זהירות: עיין MSDS) לכל דגימת צינור microfuge. סגור את המכסה והמערבולת במרץ ל10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך במיצוי DNA באופן ספציפי שתואר בעלון המוצר של היצרן בשינויים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ראשון 6 μl של הבקרה הפנימית (IC) על צינור אחד microfuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה ATL / proteinase K תמוגה ב56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, לדגור על 99 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולא 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב elution DNA הסופי, לפתוח בזהירות את המכסה של עמודת טיהור DNA ולהחיל 50 μl DNAse / מים RNase ללא מזוקקים במרכזו של הקרום, ולא buffer-ATE. הערה: עיין בעלון לאחסון וההכנה של חומרים כימיים המתאימים. ה-DNA צריכה להיות מופק מכל 5 מגילות FFPE. לבצע את כל שלבי צנטריפוגה בטמפרטורת חדר (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR לCMV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת שרשרת פולימרז נוהל (PCR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור גיליון עבודה של Excel PCR לטווח assay CMV. גיליון עבודה של Excel זו מחשבת את הסכום הכולל של כל אחד מגיב הדרוש כדי להפוך את תערובת ההורים עם Mg. זה מכפיל את הכמות של כל אחד מגיב זקוקה לדגימה (מפורט בהמשך) פעמים מספר הדגימות והבקרה ועוד אחד (כדי לפצות על אובדן בשל pipetting). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוללים את ריאגנטים הבאים בכל תגובת PCR בסכום שצוינו: מגיב0; הסכום לדוגמה 12.5 μl בקבוקון תערובת ההורים LC-CMV 2.5 μl בקבוקון הצהוב פתרון מ&quot;ג נפח כולל 15.0 μl </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלול בכל assay, המנוהל על מים או אין שליטת יעד (NTC), ביקורת שלילית, ביקורת חיובית נמוכה, בקרה חיובית גבוהה, וגם QS3 או QS4, וכל דגימות המטופל. יש להגדיר את נימי הדם בצו זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ספציפי בלוק הקירור למכשיר ה-PCR בזמן אמת שמאוחסן ב 4 ° C. מניחים את צינורות נימים המתאימים בבלוק הקירור. אל תיגע במשטח של צינורות נימים. תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בנימי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כל תגובות שרשרת פולימראז במכסת מנוע נקייה אינו מזוהם בproduc ההגברהts. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המספר הנכון של בקבוקוני הורים מערכת PCR כדי לבדוק את כל הדגימות החולים, בתוספת 5 פקדים. בואו בקבוקוני ההורים, פתרון Mg, והפשרת מים כיתה PCR בבלוק הקירור. כל בקבוקון אדון מכיל מספיק חומרים כימיים ל12 בדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת בקבוקוני האדון ומהיר לסובב אותם בצנטריפוגה במהירות המרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב את התוכן של כל בקבוקון אדון לבקבוקון אחד, ובעדינות מערבולת שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת ההורים ופתרון Mg בכמויות שצוינו בגיליון עבודת PCR לתוך צינור microfuge סטרילי אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl תמהיל הורים עם Mg לתוך כל צינור נימים, למעט הנימים בעמדה 5 שהינה על רמת quantitation (QS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את בלוק הקירור המכיל את צינורות נימים ושילוב הורים עם Mg ממכסת המנוע הנקי למכסת מנוע עיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של בקרה פנימית (IC) ל30 μl הנותר של אמןלערבב עם Mg. מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl לתוך הנימים בעמדה 5 (עמדה לQS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl מים, לשלוט DNA, או דנ&quot;א מדגם לתוך צינור הנימים המתאים. מכסה את צינורות נימים באמצעות כלי מכסת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח קירור בלוק / דגימות למכשיר ה-PCR בזמן אמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת בזמן אמת PCR המכשיר (ראה טבלה 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגברה והאיתור שבוצעו על מכשיר ה-PCR בזמן אמת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחבר למחשב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ לחיצה כפולה על סמל המכשיר ולהיכנס לתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשיר בזמן אמת PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;CMV / EBV&quot; מהמסך הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההנחיות של אשף המאקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בתיבה כדי להפעיל בדיקה עצמית כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי התוכנה. בדיקה עצמית יש לבצע פעם אחת בכל יום המכשיר נמצא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם הארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ספירת המדגם ממוקמת בLEF העליוןהפינה לא של הדף לסכום של בקרות וחולים שנכללה בריצה והזן את מספר זיהוי של כל דגימת חולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלשונית &quot;אבס קוואנט&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;סוג לדוגמא&quot;, להקצות את סוג הדגימה המתאים לסטנדרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלד בריכוזים הצפויים לסטנדרטי quantitation (QS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינורות נימים מהגוש הקריר ומניח אותם למצב המקביל בקרוסלה (קירור מדגם # 1 בלוק צריך להיות ממוקם בעמדת המס &#39;1 על הקרוסלה, וכו&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרוסלה לתחילת צנטריפוגות והעיתונות של המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח צנטריפוגות ולהסיר את הקרוסלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הקרוסלה למכשיר ה-PCR בזמן אמת. סגור את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל הפעלה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר ה-PCR בזמן אמת יבדוק כל עמדה למדגם. לא להתרחק מהמכשיר עד סימון זו הושלם, ובייחודcially אם אחד מנימי הדם לא נמצא בקרוסלה. המכשיר יהיה לציין זאת ולשאול אם הריצה היא להמשך יבוא. לענות בחיוב לפני שעזבתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריצה תושלם, סגור את הדו&quot;ח שנוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;המוחלט Quantitation&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על החץ שליד צבע פיצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;בחר צבע פיצוי&quot; מהתיבה הנפתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ פיצוי צבע העדכני ביותר לפנות לריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על אישור כאשר התיבה יצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על החץ בתקן Curve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;שימוש חיצוני&quot; מהתפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קובץ עקומת סטנדרט החיצוני העדכנית ביותר, ולאחר מכן לחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסתכל על כל עקומה תחת התפריט המוחלט כימות כדי להבטיח שעקומות נמצאות ולא קו ישר, אם ריכוז מוקצה. כימות מוחלטת ל530 705/Back הוא ניתח באופן אוטומטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quשליטת ality <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור עקומת סטנדרט חדשה בכל פעם שמספר הרבה חדש של חומרים כימיים הוא קיבל, או כל שישה חודשים, לפי תכוף יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של כל תקן לתערובת ההורים עם Mg. קחו למשל את הסטנדרטים כלולים בערכה ה-DNA שחולצה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של בקרה פנימית עבור כל תקן לתערובת ההורים עם Mg שימוש בתהליך יצירת העקומה סטנדרטית כדי להבטיח quantitation מדויק. אל תוסיף IC לתערובת ההורים עם Mg לשום תבנית הבקרה (NTC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן NTC ושלושה משכפל של Quantitation התקנים 4 QS, 3, 2, 1, ודילול של 1:10 QS4 לריצה כדי ליצור את עקומת הסטנדרט, בהיקף ב16 נקודות נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;לשכפל של&quot; בתפריט הנפתח לסטנדרטים חוזרים ונשנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אף 530/back ערוץ ולהדליק פיצוי צבע בעת ניתוח הארוך, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;Curve הרגיל (בהפעלה)&quot;, בחר &quot;שמירה בשם לשעברשלהן פנימי &quot;ושם העקום. הזן את התגובה &quot;מיושמת כעקומת סטנדרט&quot; בעת שמירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרף התוצאות. מקדם ליניאריות וכתוצאה מכך יש ≥ 0.81. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לריצות יומיות, כולל עותק אחד של QS3 או QS4 כשליטה בריצה. עקומת הסטנדרט החיצונית הנוכחית עשויה להיות מיובאת לתוך הריצה בשלב הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת פקדים: אין שליטת DNA, בקרה שלילית, נמוכה, ובקרות חיוביות גבוהות. עומס נגיפי צפוי נקבע ומותאם לכל ספק ומספר הרבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת IC לכל דגימה ולשלוט במיצוי DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל אחד מהפקדים נופל מחוץ לטווח, רשום את התוצאות בלתי מתקבלות על הדעת ולהתייחס assay לפתרון בעיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדר של בקרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלול בכל ריצה: NTC, ביקורת שלילית, נמוכה חיובית, גבוהה חיובית, וסטנדרטית. </li></ol></li></ol> הערה: גבולות מקובלים לבקרות. אין פסגות יש להתבונןד לשום תבנית (NTC) ופקדים שליליים. פסגות צריכה להיות נוכחים בערוץ 530 ועומס נגיפי צפוי נקבעים ומותאם לכל ספק ומספר הרבה לבקרות חיוביות נמוכות וגבוהות.

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטות מעבדה רבות זמינות עבור האבחנה של זיהום ציטומגלווירוס (CMV), כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, מבחני ירמיה מולקולריים, היסטולוגיה של חומר ביופסיה, וכפי שהוכיח לאחרונה מבחני, מולקולריים של, ביופסיה קבועה פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE) 5,6 רקמות. סרולוגיה, ברגע שעמוד תווך של אבחנה, רק באופן מהימן מזהה חשיפה ואינה תואמים היטב עם זיהום CMV אקוטי 7. תרבות ויראלי, קונבנציונלית ובקבוקון פגז אנטיגן מוקדם, הקשו על ידי פעמים assay ממושכות, במקרה טוב 2-3 ימים במקרה של 8 האחרונים. מבחני ירמיה מולקולריים פותחו, ביותר שיש את היתרון של להיות כמוני עם הפוטנציאל ליעילות טיפול ניטור 9-11. למרבה הצער, כאשר יש חשש קליני למעורבות מקומית של מערכת העיכול (GI) בדרכי, מבחני ירמיה משקפים מעורבות מערכתית ולא באופן ספציפי לזהות זיהום מקומי. לכן, histology כבר את תקן הזהב לזיהוי זיהום CMV של מערכת העיכול. זה חיוני כדי לזהות זיהומים פעילים CMV מערכת העיכול בחולי immunosuppressed, כגון אלה עם HIV / איידס, בכימותרפיה, או איבר / השתלות מוח עצם, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. עוד נמסר תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) היא שיטה רגישה והספציפית ביותר לגילוי CMV בביופסיות במערכת העיכול 5. תוצאות דומות נתמכות על ידי מחקרים אחרים 6. למרות שכל השלבים לאורך כל ההליך הם חשובים, יש כמה שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. במהלך עיבוד רקמות על microtome, קיים הכרח הלהב לפעול בין כל דגימה כדי לצמצם את האפשרות של זיהום צולב בין דגימות. באופן דומה, טיהור של אזורים על microtome הרקמות עשויות לבוא במגע עם שימוש rec שואב מתאיםommended ידי יצרן microtome יהיה גם להפחית את הסיכון הזה. צעד מרכזי נוסף במהלך הפרוטוקול הוא התוספת של הבקרה הפנימית IC (שלב 2.3) למדגם במהלך מיצוי DNA, אשר משמש כשליטה לשני את תהליך החילוץ והגברה. ההגברה זיהוי של IC אינה מפריעות להגברה של CMV, כי גילוי של נגיף CMV מתרחש בערוץ 530, בעוד שזיהוי של IC מתרחש בערוץ 705. כל מעבדה לקבוע טווח מקובל לIC. לאחר חילוץ, באיכות ה-DNA לא צריך להיות מוערכת. במילים אחרות, קביעת spectrophotometric של ריכוז ה-DNA היא לא מבוצעת באופן שיגרתי לאחר בידוד ה-DNA. אם הוסיף קודם למיצוי DNA, IC פועל כבקרה לתהליך החילוץ. לחלופין, 1 μl של IC ניתן להוסיף לכל תערובת הורים עם בקבוקון Mg. אם הוסיף לתערובת ההורים עם Mg, IC פועל רק כג הגברהontrol. זה גם הכרחי כי במהלך ההקמה של כל תגובות qPCR שמכסה מנוע נקי (כולל טפטפות וטיפים) לשמש להקים מגיב. מכסה המנוע הזה לא צריך שום מוצרי הגברה, כלומר הודעה בזמן אמת או PCR הקונבנציונלי, מניפולציות בתוכו. מוצרי הגברה אלה יכולים להפוך לתרסיס ולזהם תגובות מוכנות לאחר מכן qPCR מובילות לתוצאות חיוביות כוזבות. מעבדות רבות אפילו ללכת רחוק ככל ברדסים וציוד מייעדים לpipetting ריאגנטים חומצה ללא גרעין ומכסה מנוע שני וציוד להוספת מדגם ולשלוט בחומצות גרעין. מעבדות אדם חייבים להחליט מה עובד הכי טוב שניתנו אילוצי המקום האישיים שלהם. פתרון בעיות תוצאות בלתי צפויות ייתכן שתהיה צורך במהלך ההליך. אם אין עדויות להגברה של IC (קו כלומר שטוח) של מדגם, מומלץ קודם כל לחזור על תגובת qPCR מextracti-DNA המקוריעל מנת להבטיח שגיאת pipetting לא להתרחש במהלך מדגם הכנת תגובה. אם IC נשאר בקו ישר על התגובה החוזרת ויש רקמת ביופסיה מספיק הנותרת, מיצוי DNA שני עשוי שבוצע, להיות מודע כדי להוסיף IC במהלך תהליך החילוץ. אם דגימה-מופק מחדש זה גם מדגימה קו שטוח IC, סביר להניח שיש מעכב תגובה נוכחי בתוך הדגימה המקורית. במקרה זה, תוצאת הבדיקה תהיה בלתי מוגדרת לצורך זיהוי של CMV מאז שליטת תגובת qPCR לא בצעה כראוי. אם המים, אין שליטת יעד (NTC) מדגים הגברה של היעד, מומלץ תחילה לנתח את השיעור החיובי של הריצה. אם יש הריצה גבוהה יותר מאשר שיעור חיובי נורמלי, זה יהיה מומלץ לבצע בדיקות לסחוב של אזורים שבם כל מניפולציה מגיב מבוצעת כדי לזהות כל זיהום סביבתי פוטנציאלי. אם הזיהום סביבתי הוא לשלול, השתמשבקרת מים חדש שנפתחה יחד עם הבקרות חיוביות הרגילות. אם בקרת המים החדשים שנפתחה לא מוצגת מוצר הגברה, סביר להניח השליטה הקודמת המים הייתה מזוהמת ברצף היעד. עם זאת, אם בקרת מים חדשה זו היא מזוהמת שוב, זה מעלה את האפשרות של כל חומרים כימיים או ברדסים להיות מזוהמים עם רצף יעד או כל. במקרה זה, זה יהיה הכי טוב כדי לטהר את כל הברדסים המשמשים בתהליך ולאחר מכן להשתמש בכל חומרים כימיים החדשים בניהול מערך חדש של פקדים (חיובי ומים). אם הבעיה נמשכת, בחינה מחודשת של זרימת העבודה בתחומי העיבוד והברדסים, כמו גם פנייה ליצרני המוצרים צריך להיעשות. אם תקני האיכות (QS) כלולים במנוסה לא להדגים את מספר העותק המתאים במהלך הגברה, מומלץ קודם כל להפעיל את כל QS (4, 3, 2, 1, ודילול 1:10 של QS4). אם סטנדרטים אלה נופלים בתוך הטווחים המתאימים, ואז לחזורהדגימות שצוינו כבעבר עם הבקרות המתאימות. אם QS לא נופל בתוך הטווחים המתאימים, ולאחר מכן ליצור עקומת סטנדרט חדשה כמתואר בסעיף בקרת איכות של הפרוטוקול (3.4). אם הבעיה נמשכת, יצירת עקומת סטנדרט חדשה עם QS חדש שנפתח בהווה או במספר הרבה חדשים עשויים להיות ניסיון. אם צעדים אלה לא יצלחו, לפנות ליצרן יהיה מוצדק. למרות הרגישות והסגוליות של qPCR לגילוי CMV בביופסיות במערכת העיכול המבוסס על חישובים תוך שימוש בשיטות קונבנציונליות (H &amp; E וIHC) כתקן זהב לא להפגין באופן מיידי יתרון אבחון, תוך שימוש בשיטת qPCR יותר אנליטית רגישה כמו הזהב הסטנדרטי משפר באופן משמעותי אלה חישובים 5. בנוסף, 14 (78%) של 18 ביופסיות משמעיות נבדקו חיוביים עבור CMV ידי qPCR במחקר זה. הוא הרגיש שנקודות אלה תומכים ברעיון כי qPCR הוא הרבה יותר רגיש מאשר או H &amp;E לבדו, או בשילוב עם IHC גילוי CMV בחומר ביופסיה במערכת העיכול. בנוסף, במקרים עם דפוסי מכתים IHC דו משמעיים, השגת רמות נוספות לא סביר שיהיה של כל ערך מוסף בהשוואה לשיטות מקובלות כיום. יחדיו, qPCR הוא רגיש וספציפי ביותר לגילוי זיהום CMV ברקמת הביופסיה FFPE במערכת העיכול. שימושי במיוחד הוא הביצועים של qPCR בביופסיות במערכת העיכול עם דפוסים דו משמעיים CMV IHC מכתים או קליני חשודים מאוד לCMV. בהשוואה להיסטולוגיה המסורתית, בדיקות qPCR של חומר ביופסיה במערכת העיכול עשויות להקל על אבחון מדויק בפרק זמן קצר, ובכך מובילים למוקדם יותר וניהול יעיל יותר סבלני.

הפרשנות של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) בדגימות קליניות חשובה באופן קריטי. CMV הוא חבר בתת משפחת betaherpesvirinae של הרפס. דומה להרפס אחר, יש CMV היכולת להקים זיהום מתמשך או סמוי מאופיינת בחוסר השכפול נגיפי פעיל 1. הפעלה מחדש של נגיף עלולה להתרחש בזמנים של לחץ או דיכוי חיסוני אחר, מה שמוביל לשכפול נגיפי פעיל מאופיין בשחרור virion, אשר עשוי להיות מלווה בגילויי מחלה 2-4. במערכת העיכול (GI) תסמיני המחלה CMV בתדירות גבוהה כוללים כאבי בטן ו / או צואה דמה 1. האבחנה של גסטרואנטריטיס CMV ידי היסטולוגיה מנצלת hematoxylin ו eosin (H &amp; E) לזהות תכלילים נגיפיים CMV. במקרים בהם חשד קליני גבוהה עדיין אין תכלילים ברורים הם נצפו, אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לעתים קרובות כשיטת בדיקה נלווית. עם זאת, IHCיכול גם להיות הקשתה על ידי דפוסים נדירים לא קלאסיים המופיעים כתמים סלולריים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה (איור 2) 5. הוא ביקש להשתמש DNA שנלקח קבוע פורמלין, פרפין, מוטבע (FFPE) רקמת ביופסיה במערכת העיכול ותגובה הכמותית פולימראז שרשרת (qPCR) כדי לזהות CMV בביופסיות במערכת העיכול. טכניקה זו הוכח להיות בעל ערך בזיהוי של CMV בביופסיות במערכת העיכול, ומועילה במיוחד במקרים מכתים IHC המשמעיים 5,6. כמו כן, qPCR גם הוכח לתאם גם עם נתוני בדיקה נוספים קליניים CMV כאשר הוא זמין 6. שימוש בqPCR באיתור CMV עלול להוביל לאבחון מוקדם וטיפול במקרים בהם חשד קליני לCMV הוא גבוה, אבל H &amp; E ו-CMV IHC הוא שליליים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

זה חיוני כדי לזהות זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת העיכול (GI) בדרכי של חולי immunosuppressed, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. שיטות מעבדה רבות לזיהוי של זיהום CMV פותחו, כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, ושיטות מולקולריות. לעתים קרובות, שיטות אלו משקפות את מעורבות מערכתית עם CMV ולא באופן ספציפי לזהות מעורבות רקמות מקומית. לכן, זיהוי של זיהום CMV במערכת העיכול הוא לעתים קרובות נעשה על ידי היסטולוגיה המסורתית של רקמת ביופסיה. מכתים Hematoxylin ו eosin (H &amp; E) בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה (IHC) נשאר מעמודי התווך של בדיקת ביופסיה אלה. H &amp; E וIHC לפעמים לגרום לדפוסי מכתים לא טיפוסיים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה. זה היה הראה כי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) לCMV יכולה להתבצע בהצלחה על, רקמת ביופסיה (FFPE) מוטבע פרפין קבוע פורמלין למאודרגישות גבוהה וספציפיות. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לבצע בדיקות qPCR לגילוי CMV ברקמת הביופסיה FFPE במעבדת הגדרה קלינית. שיטה זו עשויה להיות יתרון גדול עבור חולים במקרים של כתמים חד משמעיים לCMV בביופסיות במערכת העיכול.

כולל של 228 לוקי רקמות נבדקו על ידי תגובה כמותית פולימראז שרשרת (qPCR), שהיה מורכבת מ91 ציטומגלווירוס (CMV) מקרים חיוביים המבוססות על היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה החיובית (IHC), 18 עם דו משמעי CMV IHC, ו79 פקדים שליליים. כפי שמודגם באיור 2, במקרים חיוביים CMV היו הפגינו תכלילים טיפוסיים CMV נגיפיים (א) ו / או כתמים חיוביים IHC (ב &#39;). מקרים דו משמעיים היו הפגינו דפוסים נדירים, לא קלאסיים המופיעים כתמים (C), ואילו בקרות שליליות היינו לא הראו היסטולוגיה חשודה או צביעת IHC 5. 91 ביופסיות חיוביות עבור CMV ידי histopathology, 88 היו חיוביים על ידי qPCR (טבלה 2). עם הגדרה חיובית אמיתית המבוססת על היסטולוגיה המסורתית, כלומר תכלילים טיפוסיים CMV נגיפיים ו / או אופייני CMV IHC, נתונים אלה הביאו לרגישות של 96.7%. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; 79 ביופסיות שליליות שליטה (35 מעי גס רגיל, 25 קוליטיס, ו19 duodenitis), כלומר שליליות לתכלילים נגיפיים ושליליות על ידי CMV IHC, 78 נבדקו שליליים ו1 נבדק חיובי על ידי qPCR, וכתוצאה מהספציפיות של 98.7%. ארבעה עשר של 18 ביופסיות (78%) עם כתמי CMV IHC משמעיים נבדקו חיוביים עבור CMV ידי qPCR 5. בין 18 מקרים דו משמעיים אלה, עשר היו ביופסיות נוספות שצולמו באותו היום שהיו חיוביים ל-CMV ידי histopathology. בין 14 דגימות חיוביות אלה qPCR, 10 היו ביופסיות שנלקחו באותו היום שהיו חיוביים ל-CMV בhistopathology. של 18 הביופסיות משמעיות שנבדקו, 11 היו מידע קליני נוסף לגבי בדיקת CMV בדגימות אחרות שהוגשו בבית או בתוך 7 ימים מהזמן הביופסיה נלקחה. בין 11 מקרים אלה, 8 (73%) נמצאו חיוביים לCMV ידי qPCR. של 11 ביופסיות אלה, 5 (45%) נמצאו חיוביים על ידי qPCR עם דגימות CMV חיוביות נוספות; 3 (27%) נבדקו להניחive ידי qPCR ללא דגימות CMV חיוביות; 3 (27%) שנבדקו שליליים על ידי qPCR עם דגימות CMV שליליות נוספות. בנוסף לאלה מחקרים שהוזכרו לעיל, היה זה עניין כדי לקבוע האם רמות נוספות קבלת hematoxylin ו eosin (H &amp; E) תהיה מועילות במקרים בהם אין תכלילים נגיפיים נראים על H &amp; E בתחילה וCMV IHC הוא דו משמעי. לכן, פעמים H &amp; E רמות 5 לכל אחד מהגושים 18 עם דו משמעי CMV IHC בוצעו. שני פתולוגים לבחון בזהירות במקרים אלה ולא הצליחו לזהות תכלילים נגיפיים ניכרים על כל שקופיות נוספות (מידע לא מוצג). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="805" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="7"> פרמטרים תגובת השרשרת של פולימראז בזמן אמת הציעו </td></tr><tr><td colspan="7"> קריאת הגדרה: </td></tr><tr><td> ערוץ ברירת מחדל </td><td> חפש טמפרטורה </td><td> מקסימום חפש ממוצע </td&gt; <td> סוג המכשיר </td><td> גודל נימים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 530 </td><td> 30 מעלות צלזיוס </td><td> 12 </td><td> 6 ערוץ </td><td> 20 μl </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="7"> שם תכנית: הפעלה של אנזים </td></tr><tr><td colspan="7"> מספר המחזורים: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> מצב ניתוח: אין </td></tr><tr><td> יעד ° C </td><td> החזק hh: mm: ss </td><td> רמפת דרג </td><td> שניות יעד </td><td> שלב גודל </td><td> שלב עיכוב </td><td> מצב רכישה </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 0:10:00 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אף לא אחד </td></tr><tr><td colspan="7"> שם תכנית: לנחות צעד </td></tr><tr><td colspan="7"> מספר המחזורים: 10 </td></tr><tr><td colspan="7"> מצב ניתוח: אין </td></tr><tr><td> יעד ° C </td><td> החזק hh: mm: ss </td><td> אילדרג p </td><td> שניות יעד </td><td> שלב גודל </td><td> שלב עיכוב </td><td> מצב רכישה </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אף לא אחד </td></tr><tr><td> 65 </td><td> 00:00:20 </td><td> 20 </td><td> 55 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> אף לא אחד </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 00:00:15 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אף לא אחד </td></tr><tr><td colspan="7"> שם תכנית: הגברה של ה-DNA </td></tr><tr><td colspan="7"> מספר המחזורים: 40 </td></tr><tr><td colspan="7"> מצב ניתוח: Quantitation </td></tr><tr><td> יעד ° C </td><td> החזק hh: mm: ss </td><td> רמפת דרג </td><td> שניות יעד </td><td> שלב גודל </td><td> שלב עיכוב </td><td> מצב רכישה </td></tr><tr><td> 95 </td><td> 00:00:05 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אף לא אחד </td></tr><tr><td> 55 </td><td> 00:00:20 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אחד </td></tr><tr><td> 72 </td><td> 00:00:15 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אף לא אחד </td></tr><tr><td colspan="7"> שם תכנית: קירור </td></tr><tr><td colspan="7"> מספר המחזורים: 1 </td></tr><tr><td colspan="7"> מצב ניתוח: אין </td></tr><tr><td> יעד ° C </td><td> החזק hh: mm: ss </td><td> רמפת דרג </td><td> שניות יעד </td><td> שלב גודל </td><td> שלב עיכוב </td><td> מצב רכישה </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 00:00:30 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> אף לא אחד </td></tr></tbody></table> טבלת 1. יש להשתמש בפרמטרים המופיעים כקו מנחה לטמפרטורות היעד, מספרי מחזור, ואורכי מחזור בהגדרה של תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת לאיתור cytomegalovi<html> rus ב, ביופסיות עיכול מוטבע פרפין קבוע פורמלין. עשויים פרמטרים אלה דורשים אופטימיזציה בהתאם לדגם המכשיר והיצרן. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מקרים חיוביים היסטולוגיה </td><td> מארזי ה-PCR חיובי </td><td> רגישות </td><td> מקרים שליליים היסטולוגיה </td><td> מקרים שליליים PCR </td><td> Specitivity </td></tr><tr><td> 91 </td><td> 88 </td><td> 96.7% </td><td> 79 </td><td> 78 </td><td> 98.7% </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רגישות (96.7%) וסגוליות (98.7%) של תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (qPCR) באיתור ציטומגלווירוס ב, ביופסיות עיכול מוטבע פרפין קבוע פורמלין. טבלה זו שונה ממקוי ואח&#39; 5. &quot;Width =&quot; es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg 400 &quot;/&gt; איור 1. Microtome טיפוסי עם גוש הרקמה יושב בצורה נכונה במהדק הקלטת) כסעיף עבה 10 מיקרון של רקמת הביופסיה לחתוך אותו מותר לגלגל לגלילה ב &#39;), אשר הועבר לC צינור microfuge). כל חמש המגילות של רקמת ביופסיה ממוקמות בצינור microfuge יחיד למיצוי DNA. <img alt="איור 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51570/51570fig2highres.jpg" width="400" /> Hematoxylin איור 2.) ו eosin סעיף מוכתם של ביופסיה מעי גס מראה תכלילים CMV בשפע, טיפוסיים כפי שצוין על ידי חצים (400X ההגדלה המקורי). B) ביופסיה מעי גס מוכתמת עם נוגדן חד שבטי כנגד CMV מראה את דפוס צביעת IHC הצפוי (מקורי 400X הגדלה). <strong&gt; C) ביופסיה מעי גס מראה צביעת IHC דו משמעית, עם תא בודד, קטן חלוש מוכתם מצויינים על ידי החץ (400X ההגדלה המקורי). נתון זה נמצא בהודפס מחדש באישור מאל מקוי et 5.

Watch this Scientific Journal Video about qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue at JoVE.com

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Views.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Video: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

איתור Immunofluorescent של שני אנלוגים Thymidine (CldU ו IdU) ברקמה ראשי

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

הכין ליבות רקמות פרפין מוטבע פורמלין-קבועות הוא רנ&quot;א הפקת DNA

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video