We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.

הערה:. השלבים כרוכים בבידוד של exosomes השתן תוך שימוש בשיטת המשקעים שונה באים לידי ביטוי באיור 1 הצעדים הראשוניים כרוכים בהסרת תאים מתים גדולים ופסולת תא על ידי צנטריפוגה. גלולה הסופית המתקבלת מsupernatant שנאסף מכל שלב שלאחר מכן תואמת את exosome, אשר מומס בפתרון בידוד להפקה נוספת של החלבון, RNA, ו- DNA. 1. איסוף שתן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף שתן, להכין מעכבי פרוטאז קוקטייל על פי הוראות היצרן ולהוסיף 3.125 מיליליטר של הקוקטייל הזה לקיבול סטרילי ריק. הצינור המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל אז יכול להיות מופץ למתנדבים לאיסוף שתן. הערה: הסיבה להוספת מעכבי פרוטאז היא למזער פירוק חלבונים בדגימת השתן. למרות שאנו במיוחד משמשים מעכבי פרוטאז קוקטייל מSigma, ניתן להחליף מעכבי פרוטאז זמינים מסחרי אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כ 10 מיליליטר של השתן הראשון-חלל. לעבד את השתן מייד לאחר האיסוף ללא אחסון או קירור. לבודד את exosomes השתן בשני עותקים בשיטת המשקעים שונה; אחד מהכפילויות הוא לDNA, RNA המוחלט ומיצוי חלבון, ואילו השני הוא לכימות של חלקיקי exosome שתן. הערה: דגימת שתן 24 שעות ניתן לאסוף עבור בידוד exosome ידי אחסון ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. ההסרה של פסולת תא וחלבון התם-Horsfall (THP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את דגימות שתן של 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה 10 מיליליטר של שתן ב17,000 XG במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס לחסל תאים ופסולת תא (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להעביר את supernatant לצינור טרי לעיבוד נוסף. Resuspend גלולה ב 500 μl של פתרון בידוד (250 מ&quot;מ סוכרוז, trieth מ&quot;מ 10anolamine, pH 7.6) ואחריו דגירה 10 דקות עם DL-dithiothreitol (DTT: מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז 200 סופי) על 37 מעלות צלזיוס. הערה: DTT מתווסף לבזות THP, שלוכד את exosomes, שהוביל לירידה בתשואות. תשמור על עצמך לעזוב את הכדור ללא הפרעה במהלך העברת supernatant, ולאשר כי supernatant ברור של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות גלולה וורטקס כל 2 דקות עד גלולה הוא נמס לגמרי. ואז להוסיף 500 μl של פתרון בידוד לגלולה המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר התוספת של פתרון בידוד לגלולה, צנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. Pipet supernatant ולשלב עם supernatant שנאסף קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ב 50 μl של פתרון בידוד לניתוח SDS-PAGE. הערה: PBS או TBS יכול לשמש במקום פתרון בידוד לresuspend גלולה. </li></ol> 3. בידוד של Exosome גלולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 11 מיליליטר של supern נאסףatant, להוסיף 3.3 מיליליטר של מגיב ExoQuick-TC ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 12. הערה: היחס של נפח supernatant למגיב ExoQuick-TC יכולה להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את תשואת exosomal. הבחנו כי כרכים פחותים של מגיב הוסיף לייצר תשואות קטנות יותר של exosomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, צנטריפוגות תמהיל המדגם / ExoQuick-TC ב10,000 XG למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור טרי לניתוח SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה exosome ניתן לאחסן ב -80 ° C ל- DNA, RNA ומיצוי חלבון וכימות של חלקיקי exosome באמצעות CD9 11 ELISA. הערה: גלולה exosome ניתן לאחסן ב -80 ° C למשך שנה 1 עם הקפאה להפשרה מוגבלת. </li></ol> 4. ביומרקר באיתור ובניתוח של Exosome גלולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוחים במורד הזרם, לחלץ DNA, RNA וחלבון מגלולת exosome באמצעות DNA / RNA / ערכת בידוד החלבון וקי בידוד RNAt על פי הוראות היצרן. לקבוע ריכוזים באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop על ידי מדידת הספיגה ב 260 ו280nm עם 2 μl של מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בזמן אמת RT-PCR (qPCR) באמצעות מבחני microRNA TaqMan (במקרה שלנו, השתמש miR-192- וmiR-1207-5p ספציפי מבחני אנושיים) או פריימרים מירנה ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח SDS-PAGE, להשתמש 4-12% ג&#39;ל Bis-טריס ודגימות חלבון נפרדים על ידי אלקטרופורזה חד-ממדית. דמיין ג&#39;ל באמצעות ערכת צביעת כסף בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח כתם מערבי באמצעות ממברנות PVDF בהתאם להוראות הניתנות על ידי היצרן. השתמש נוגדן polyclonal ארנב גן-2 X צמוד אפופטוזיס אינטראקציה חלבון או אליקס ונוגדנים חד שבטי עכבר כדי גן רגישות גידול 101 חלבון או TSG101 באיתור הכתם המערבי. לכמת את הצפיפות של הלהקות על ידי גישה פתוחה תוכנת NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) אותכנית דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את מספר חלקיקי exosome שתן שהושגו באמצעות ערכת ELISA CD9 לפי הוראות יצרן. </li></ol>

<ol>
	<li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acids+within+urinary+exosomes/microvesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease.">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li><li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes.">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li><li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery:+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation.">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li><li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine.">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li><li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+storage,+preservation,+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery.">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li><li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li><li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes.">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li><li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome.">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li><li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+protein,+microRNA,+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers.">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li><li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+(AQP-2)+A/G+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea.">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו שולמו על ידי Biosciences SBI.

רוב השיטות הכרוכות במשקעים של exosomes משתן אינן מתייחסות להסרת של רשת פולימרים הוקמה על ידי חלבון התם-Horsfall (THP). חלבון זה נמצא בכמויות גדולות בשתן, שבו מלכודות putatively זה exosomes במהלך צנטריפוגה מהירות נמוכה ראשונית. בשיטה שונה שלנו אנחנו מופחתים THP באמצעות DTT לפני הממטרים exosome. כפי שניתן לראות באיור 2, סכום גבוה יותר של THP נצפה בשתן והגלול לא מעובד, ללא THP בsupernatant הסופי והגלול exosome, המצביע על הסרת החלבון. כימות של חלבון בגלולה מצויינים תשואה גבוהה פי שישה, ועל כימות CD9 ELISA של גלולה, היא נצפתה תשואה של exosome לכל מיליליטר של שתן הייתה גבוהים פי חמישה מאשר בשיטת הממטרים ללא שינוי (תוצאות לא מוצגות 11). הסמנים הביולוגיים אליקס 6 וTSG101 8 התגלו בגלולת exosome; אנחנו יכולים רק לזהות חלבונים אלה באמצעות מרוכזיםדגימות בשיטת הממטרים ללא שינוי. אנו הבחנו גם ברמות הגבוהות ביותר של מירנה (כלומר, miR-192 וmiR-1207-5p) וביטוי mRNA (כלומר, TSG101, PDCD6IP ו -12 AQP2) תוך שימוש בשיטת המשקעים שונה 11. היתרונות וחסרונות של שיטת משקעים שונה זו מוצגים בטבלה 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> יתרונות </td><td> חסרונות </td></tr><tr><td> צעדים פשוטים קלים ודורשים מומחיות קטנה ביחס לביצוע </td><td> טוהר נמוך של החלבונים המתקבל מexosomes השתן </td></tr><tr><td> אינו מחייב צעד ultracentrifugation </td><td> בשל היעדר צעדי ultracentrifugation, גלולה exosome השתן המתקבלת היא לא טהורה כמו בהשוואה לגלולת exosome התקבלה משיטות ultracentrifugation </td></tr><tr><td> משתמש נפח קטן של Urinמדגם דואר לבידודה של exosomes </td><td> כדי לקבל חלבון טהור לניתוח ספציפי, יהיו צורך בצעדי טיהור חלבון כגון זיקת כרומטוגרפיה </td></tr><tr><td> השיג כמות טובה של מירנה, mRNA וחלבונים מexosomes שתן בהשוואה ללא-שינוי שיטת ממטרים </td><td> צורך בתוספת של DTT צעדים נוספים כדי לצמצם כמה מלכוד על ידי חלבון התם-Horsfall בהשוואה למי שאינה שונה בשיטת ממטרים </td></tr><tr><td> סגוליות ורגישות של הסמנים הביולוגיים ניתחו היו דומים לזה שהתקבל ונותח באמצעות שיטת ultracentrifugation </td><td></td></tr><tr><td> יכול להיות מבודד exosomes שתן ממספר גדול של דגימות בכל פעם, מתאים לשבילים קליניים </td><td></td></tr><tr><td> ידיים על פחות זמן בהשוואה לשיטות ultracentrifugation </td><td></td></tr></tbody></table> יתרונות 1. שולחן וחסרונות של precipita שונהשיטת tion לבידוד exosome שתן. אנו מסיקים כי השינוי של שיטת המשקעים שלנו הוא דרך פשוטה, מהירה ויעילה לבודד exosomes שתן והוא חלופה ראויה לשיטת ultracentrifugation, שהוא עתיר עבודה ודורשת ציוד יקר. השיטה שלנו לא דורשת צעד ultracentrifugation, היא קל לביצוע, ודורשת פחות שלבים, תוך מתן תשואה גבוהה או exosomes הטהור לניתוחים מולקולריים שלאחר מכן. כמו כן, אנו מראים כי התשואות של מירנה וmRNA בשיטה זו הן גבוהות, ולכן ניתן להשתמש ישירות ביישומי פרופיל RNA במורד הזרם שלאחר מכן. עם זאת, נציין, כי הגבלה של שיטה זו היא באיכות של החלבון שהתקבל, שאינו טהור כמו שהושג באמצעות שיטות ultracentrifugation שיפוע סוכרוז, ודורשת צעדי טיהור נוספים לפני הניצול בניתוחי proteomic במורד הזרם. בימים אלו אנו בוחנים את התועלת של ספיד זהod באמצעות דגימות שתן שהתקבלו מחולים עם נפרופתיה סוכרתית.

exosomes שתן הוא שלפוחית ​​פנימית קטנה של גופי multivesicular (MVB) נגזרים מכל סוגי התאים בתנאים נורמלים ופתולוגיים בחלל שתן כולל podocytes גלומרולרי, תאי אבובית כליה ותאים המצפים את מערכות ניקוז שתן המופיעות להיות מועשרים לmiRNAs 1 100 ננומטר -2. חוקרים רבים זיהו חלבונים שונים בexosomes מבודד משתן של אנשים בריאים, כמו גם אלה עם כליות ו / או מחלות שיטתיות 3-5. יכול להיות מבודד Exosomes בשיטות שונות כגון ultracentrifugation ההפרש דו-שלבים עם או בלי סוכרוז 6-7, שילוב מסנן nanomembrane עם ultracentrifugation 8-9, או 10-11 ממטרים. יש לנו לאחרונה פיתחתי שיטה פשוטה, מהירה, מדרגי ויעילות לבודד exosomes שתן ולזהות מירנה וסמנים ביולוגי חלבון 11. למרות שניתן לאתרם סמנים ביולוגיים במגוון רחב של נוזלים ביולוגיים שונים, urine הוא הבחירה הנוחה ביותר עבור חולים עם מחלות הכליות ודרכי שתן, כי ניתן להשיג אותו בכמויות גדולות באופן יחסי שאינו פולשנית. למרות שיש כמה שיטות לבודד exosomes שתן 6-11, ההליך הנפוץ ביותר תלוי בultracentrifugation ההפרש עם 30% כרית סוכרוז. למרות ששיטה זו היא יעילה ואיכות exosomes וכתוצאה מכך מבודדת עם הליך זה היא גבוהה, הטכניקה עצמה דורשת כוח אדם מיומן, והוא, שדורש כמה צעדי ultracentrifugation זמן רב. שיטות אחרות, כגון סינון ומשקעים, פותחו עבור הבידוד של exosomes, כולל אחד שמשתמש מגיב ממטרים קניינית (כלומר, ExoQuick-TC: מערכת Biosciences; Mountain View, CA). למרות משקעים באמצעות מגיב זה הוא מהיר וקל יחסית, טוהר exosomes מבודד הוא נמוך בהשוואה לספיד ultracentrifugationod. לאחרונה לעומת שש שיטות לבידודה של exosomes שתן, כולל שינוי של שיטת המשקעים באמצעות ExoQuick-TC שפיתחנו במעבדה שלנו 11. מצאנו ששיטת משקעים שונה זו הניבה כמויות גבוהות יותר של חלבון, מירנה, וmRNAs וההליך עצמו היה מהיר יותר וקל יותר ליישום מאשר ultracentrifugation. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הניסוי של שיטת המשקעים שונה שלנו באופן הדרגתי, ונכלול דיון על היתרונות והחסרונות של שיטה זו בהשוואה לשיטות אחרות של בידוד exosome. שיטת המשקעים שונה כרוכה ממטרים ראשוניים של חלקיקי exosome, ואחריו הסרת חלבון התם-Horsfall, אשר מתואם עם חלבוני exosomal, וידוע כדי להפחית את תשואת exosome משתן של. מצאנו ששינויים אלה הגדילו את התשואה וטוהר של הכנת exosomal משתן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="736">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning 15ml Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:111px;">Corning (Sigma Aldrich)</td>
			<td style="width:119px;">CLS430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:111px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-dithiothreitol</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9779</td>
			<td>used at final concentration of 200 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>For SDS-PAGE analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ECL Advance Western blotting detection kit</td>
			<td style="width:111px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">RPN2135</td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Exoquick-TC Reagent</td>
			<td style="width:111px;">System Biosciences (SBI)</td>
			<td style="width:119px;">EXOTC50A-1</td>
			<td>For exosome isolation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Exosome CD9 ELISA Complete Kit</td>
			<td style="width:111px;">System Biosciences (SBI)</td>
			<td style="width:119px;">EXOEL-CD9-A-1</td>
			<td>For exosome quantification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">80004</td>
			<td>For DNA, RNA, Protein isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rneasy MinElute Cleanup kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ProteoSilver Sliver Stain Kit</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PROTSIL1-1KT</td>
			<td>For staining SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For running the SDS-PAGE gels</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TaqMan microRNA assays</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For RT-PCR assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qBasePlus v1.5 software</td>
			<td style="width:111px;">Biogazelle NV</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For analysis of RT-PCR assay data</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal antibody to ALIX</td>
			<td style="width:111px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse monoclonal antibody to TSG101</td>
			<td style="width:111px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For western blot detection of biomarkers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified precipitation method to isolate urinary exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

exosomes שתן לשאת סמנים ביולוגיים חלבון, מירנה וmRNA המופרשים מתאי האפיתל כליות. הבידוד וזיהוי של exosomes אלה עשויים לספק כלי אבחון יעילים לגילוי מוקדם של מחלות כליה, כגון נפרופתיה סוכרתית. ישנן מספר שיטות לבידודה של exosomes מדגימות שתן שנאספו מבני אדם. השווינו בעבר שש שיטות של בידוד exosome השתן וכתוצאה מכך חקרנו חלבון, רמות ה- mRNA, ומירנה 11. המטרה שלנו כאן הייתה לתאר בפירוט את שיטת המשקעים שונה שפיתחנו לבידוד יעיל של exosomes שתן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51158/51158fig1highres.jpg" /> איור 1 מתאר את תרשים זרימת הנציג סכמטי של המעורבים בבידוד של exosomes שתן צעדים שונים בשיטת המשקעים שונה. אחד exosome הכפולגלולה המתקבלת נמדדת לCD9 באמצעות ערכת ELISA CD9, אשר מספקת לנו את הכימות היחסי של חלקיקי exosome. גלולה אחרת מעובד באמצעות תשואות Qiagen DNA / RNA / חלבון מיני ערכת DNA, RNA וחלבון, שהיו לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop על ידי מדידת הספיגה ב 260 ו- 280 ננומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51158/51158fig2highres.jpg" /> איור 2 הוא הרבייה שונה של התוצאות על ניתוח SDS-PAGE וזיהוי סמנים ביולוגי באמצעות ניתוח מערבי כתם (מותאם מהתייחסות 11). בנתיבים עם שתן לא מעובד וגלול שתן ראשון, להקת חלבון המתאימה 90 עד 100 kDa נצפה המציין הנוכחות וההסרה של חלבון THP בהתאמה. בעוד שבנתיבים עם supernatant סופי וגלול exosome, להקת החלבון המתאימה לTHP לא נצפתה, המציין את הסרת THP בשלבים המוקדמים יותר, יסEby הגדלת התשואה של גלולה exosome. כדי לגשת לטוהר והרגישות של כדורי exosome, איתור כתם המערבי של סמנים ביולוגיים כגון אליקס וTSG101 הועסק. אנחנו הבחנו אליקס וTSG101 גם כאשר כמויות נמוכות של מדגם שמשו מצביעות גלולה exosome טהורה באופן משמעותי לניתוח סמן ביולוגי והעדר חלבונים המסיסים בשפע כולל THP. ניתוח densitometric של הכתמים המערביים נעשה לכמת ולמדוד את רמת זיהוי (מידע לא מוצג).

Watch this Scientific Journal Video about A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes at JoVE.com

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

a-modified-precipitation-method-to-isolate-urinary-exosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Views.  Translational Genomics Research Institute (TGen). This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Video: A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. Several cellular mechanisms, such as telomere shortening and abnormal expression of mitogenic oncogenes, have been shown to cause senescence. Senescence is not restricted to normal cells; cancer cells have also been reported to senesce.
	Chemotherapeutical drugs have been shown to induce senescence in cancer cells. However, it remains controversial whether senescence prevents or promotes tumorigenesis. As it might eventually be patient-specific, a rapid and sensitive method to assess senescence in cancer cell will soon be required.
	To this end, the standard &beta;-galactosidase assay, the currently used method, presents major drawbacks: it is time consuming and not sensitive. We propose here a flow cytometry-based assay to study senescence on live cells. This assay offers the advantage of being rapid, sensitive, and can be coupled to the immunolabeling of various cellular markers.

Whether senescence prevents or promotes tumorigenesis remains controversial. Since chemotherapeutical drugs can induce cancer cells to senesce, studying senescence is essential for proposing new therapies. However, the standard and broadly used &beta;-galactosidase assay presents major drawbacks. We propose here a rapid and sensitive flow cytometry-based assay to quantify senescence.

שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are available to perform mechanistic in vivo studies. While heart transplantation models using a suture technique were first successfully developed in rats, the translation into an equally widespread used murine equivalent was never achieved due the technical complexity of the microsurgical procedure. In contrast, non-suture cuff techniques, also developed initially in rats, were successfully adapted for use in mice1-3. This technique for revascularization involves two major steps I) everting the recipient vessel over a polyethylene cuff; II) pulling the donor vessel over the formerly everted recipient vessel and holding it in place with a circumferential tie. This ensures a continuity of the endothelial layer, short operating time and very high patency rates4.
Using this technique for vascular anastomosis we performed more than 1,000 cervical heart transplants with an overall success rate of 95%. For arterial inflow the common carotid artery and the proximal aortic arch were anastomosed resulting in a retrograde perfusion of the transplanted heart. For venous drainage the pulmonary artery of the graft was anastomosed with the external jugular vein of the recipient5.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

The murine cervical heart transplantation model is well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury studies. We modified the procedure using a non-suture cuff technique and performed more than 1,000 successful transplants with this approach.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

עכברי צוואר הרחם לב השתלת דגם שימוש בטכניקת חפתים השתנה

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents available. A difficulty is presented due to the small size of the animal and the considerable technical challenges of the microsurgery involved in heart transplantation. In particular, a high rate of technical failure early after transplantation may result from recipient death and post-operative complications such as hind limb paralysis or a non-beating heart. Here, the complete technique for heterotopic mouse heart transplantation is demonstrated, involving harvesting the donor heart and its subsequent implantation into a recipient mouse. The donor heart is harvested immediately following in situ perfusion with cold heparinized saline and transection of the ascending aorta and pulmonary artery. The recipient operation involves preparation of the abdominal aorta and inferior vena cava (IVC), followed by end-to-side anastomosis of the donor aorta with the recipient aorta using a single running 10-0 microsuture and a similar anastomosis of the donor pulmonary artery with the recipient IVC. Following the operation the animal is injected with 0.6 ml normal saline subcutaneously and allowed to recover on a 37&#160;&#176;C heating pad. The results from 227 mouse heart transplants are summarized with a success rate at 48 hr of 86.8%. Of the 13.2% failures within 48 hr, 5 (2.2%) experienced hind limb paralysis, 10 (4.4%) had a non-beating heart due to graft ischemic injury and/or thrombosis, while 15 (6.6%) died within 48 hr.

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

שיטה שונה לHeterotopic מאוס לב Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

שריר חלק בשלפוחית ​​השתן רצועת התכווצות כשיטה להערכת נמוכה יותר בדרכי שתן פרמקולוגיה

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based three-chamber bags (3CBs) and soybean-oil-based compounded bags (CoBs) in hospitalized adult patients. We designed a multicenter, randomized, prospective, open-label, noninferiority protocol to compare the efficacy, safety, and distribution of olive-oil-based 3CBs and soybean-oil-based CoB formulations in adult Chinese patients requiring PN during surgical intervention. Subjects were randomized to receive either one of the study treatments using an interactive voice or web-based recognition system in accordance with the randomization code. Randomization was further stratified based on the study site and surgical category. Both treatment groups received similar amounts of calories and protein. In addition, the two study treatments contained a similar composition of the amino-acid component. The only difference between the two PN formulations was the lipid constitution. The duration of administration of study treatments was a minimum of 5 days up to a maximum of 14 days after the surgical procedure. The primary efficacy endpoint was serum prealbumin levels on day 5 of the study. Noninferiority was proved if the anti-log of the lower bound of the 95% confidence interval (CI) of the treatment difference was at least 0.80. Other efficacy measures included treatment preparation time; duration to achieve tolerability of oral nutrition; associated infectious complications; length of hospitalization; and laboratory assessment of markers of nutrition, inflammation, metabolism, and oxidative stress. A total of 458 patients were enrolled in the study. The results showed that olive-oil-based 3CBs were non-inferior to soybean-based CoBs, besides being well tolerated. The infection rate was found to be significantly lower in the olive-oil-based 3CB group. Thus, this study may be used as a reference for future research on lipid emulsion and 3CBs.

Here, we present a protocol for a study comparing the efficacy, safety, and delivery of olive-oil-based 3CB and soybean-oil-based CoB formulations in adults requiring parenteral nutrition. The results revealed that olive-oil-based 3CBs is non-inferior and well tolerated compared to soybean formulations.

ניסוי קליני מעריך את הבטיחות, היעילות והאספקה של תיקים בעלי שמן זית בעלי שלושה חדרי מזון עבור הזנה פריבאל

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

דרך יעילה Sieving כדי לבודד Glomeruli ללא פגע מן החולדה למבוגרים כליות

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Ultrasonography of the Adult Male Urinary Tract for Urinary Functional Testing

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting in a significant economic and quality of life burden. Transgenic and other mouse models have been developed to recreate various aspects of this multifactorial disease; however, methods to accurately quantitate urinary dysfunction and the effectiveness of new therapeutic options are lacking. Here, we describe a method that can be used to measure bladder volume and detrusor wall thickness, urinary velocity, void volume and void duration, and urethral diameter. This would allow for the evaluation of disease progression and treatment efficacy over time. Mice were anesthetized with isoflurane, and the bladder was visualized by ultrasound. For non-contrast imaging, a 3D image was taken of the bladder to calculate volume and evaluate shape; the bladder wall thickness was measured from this image. For contrast-enhanced imaging, a catheter was placed through the dome of the bladder using a 27-gauge needle connected to a syringe by PE50 tubing. A bolus of 0.5 mL of contrast was infused into the bladder until a urination event occurred. Urethral diameter was determined at the point of the Doppler velocity sample window during the first voiding event. Velocity was measured for each subsequent event yielding a flow rate. In conclusion, high frequency ultrasound proved to be an effective method for assessing bladder and urethral measurements during urinary function in mice. This technique may be useful in the assessment of novel therapies for BPH/LUTS in an experimental setting.

We describe the use of high frequency ultrasound with contrast imaging as a method to measure bladder volume, bladder wall thickness, urine velocity, void volume, void duration, and urethral diameter. This strategy can be used to assess voiding dysfunction and treatment efficacy in various mouse models of lower urinary tract dysfunction (LUTD).

Ultrasonography של בוגרים זכר בדרכי השתן עבור בדיקות פונקציונליות השתן

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI remodeling and evaluation of novel therapeutics. Different methods (e.g., isoproterenol treatment, cryoinjury, coronary artery ligation, etc.) have been used to induce MI. Compared with isoproterenol treatment and cryoinjury, coronary artery ligation may better reflect the ischemic response and chronic remodeling after MI. However, traditional methods for coronary ligation in mice are technically challenging. The current study describes a simple and efficient process for induction of MI in mice with readily available materials. The mouse chest skin was cut open under stable anesthesia. The heart was immediately externalized through the intercostal space after blunt separation of the pectoralis major and pectoralis minor. The left anterior descending branch (LAD) was ligated with a 6-0 suture 3 mm from its origin. Following LAD ligation, staining with 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) indicated successful induction of MI and temporal changes of post-MI scar size. Meanwhile, survival analysis results showed overt mortality within 7 days after MI, mainly due to cardiac rupture. Moreover, post-MI echocardiographic assessment demonstrated successful induction of contractile dysfunction and ventricular remodeling. Once mastered, an MI model can be established in mice within 2-3 min with readily available materials.

Under adequate anesthesia, the mouse heart was externalized through the intercostal space, and myocardial infarction was successfully induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using materials readily available in most laboratories.

שיטה פשוטה שונה להשראת אוטם שריר הלב בעכברים

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...

A Modified Vessel-Sparing Microsurgical Vasoepididymostomy

Microsurgical vasoepididymostomy (MVE) is the main surgical treatment for epididymal obstruction. The vasal vessels are ligated during MVE. However, preserving the vasal vessels during MVE might better simulate the normal physiological structure and be meaningful for patients who have undergone varicocelectomy. Nevertheless, preserving the vasal vessels might elevate the risk of increasing the tension of anastomosis, affecting the patency rate and leading to delayed postoperative bleeding. Therefore, we developed a novel vessel-sparing MVE to make it safer. Here is a summary of the improvements to the procedure. 1) The retrograde dissociation of the vasal vessels on the proximal testicular side was adopted as the main method, and the anterograde dissociation of the vasal vessels on the distal testicular side was adopted as a supplement to dissociate the vasal vessels to be preserved. This improvement ensures the blood supply to the vas deferens that will be used for anastomosis and also provides longer vasal vessels, which reduces the tension of anastomosis. 2) By fixing the vas deferens to be anastomosed and the broken end of the vas deferens, the free vasal vessels get fixed, which resolves the problem of transmission of vas tension to the vasal vessels and reduces the risk of vasal vessel hemorrhage. 3) Dissociation of the vas deferens after opening the tunica vaginalis increases the mobilization of the vas deferens, which also makes the new procedure easier to complete. The evaluation of the outcomes of this new procedure showed that no significant postoperative complications occurred in the patients, and the patency rate was no different from that of the conventional procedure. Therefore, this new, improved procedure can be considered safe, with satisfactory postoperative results.

Here, we present a protocol to preserve the vasal vessels in microsurgical vasoepididymostomy. The surgical security is enhanced by preserving the vasal vessels using a retrograde-anterograde dissociation and fixing the vasal vessels.

כריתת כלי דם מיקרו-כירורגית חסכונית בכלי דם

Microsurgical vasoepididymostomy (MVE) is the main surgical treatment for epididymal obstruction. The vasal vessels are ligated during MVE. However, ...