ברצוננו להודות לטל Nawy ומרטין באייר לעצתם בבידוד עובר. MTR, VG, UG וCB פיתחו ציוד בידוד העובר. MTR, VG ו CB פיתחה פרוטוקול בידוד העובר. MTR, VG ו CB הקים את הפרוטוקול, בודד את העוברים, ועובר שנוצר cDNA, VG ביצע PCR, MTR מכתים גאס, ג&#39;יי ג&#39;יי ניסויי הדגים. MTR, VG, CG וUG כתבו את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת ציריך, אחוות קרן מחקר רוש (לMTR), ומענקים מהקרן הלאומית שוויצרי (לUG וCB).

ההליך מסוכם בתרשים הזרימה שמוצגת באיור 1. Microcapillaries והתקנת אינסטרומנטלי מוצגים באיור 2 ואיור 3, וצעדים אופייניים של בידוד עובר מוצגים באיור 4. 1. חומר והכנת המאגר 1.1 ציפוי הסיליקון של זכוכית microcapillaries <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את microcapillaries בצינור פלקון 15 מ&quot;ל עם ~ 5 מ&quot;ל של Sigmacote (סיגמא) ולהפוך כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון, במקום צינור פלקון המכיל את נימי הדם ברדיד אלומיניום ואופה אותם ל3 שעות ב 60 ° C. לאחסן בטמפרטורת חדר. </li></ol> השיגו 1.2 ~ 50-100 טיפים microcapillary מיקרומטר בקוטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך 1 מ&quot;מ בקוטר זכוכית נימים באופן ידני מעל מבער בונזן או באמצעות חולץ מסחרי (אנכי נימה חולץ או micropipette חולץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביהלומיםעט קצה להב או לחתוך את הקצה של הנימים משכו כדי ליצור את הפתיחה הרצויה. בחר את נימי הדם בצורת הטובה ביותר תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפתיחה צריכה להיות 50-100 מיקרומטר (איור 2). </li></ol> הכנת מצגת 1.3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבי סיליקון שקופיות נקיות על ידי כיסוי כל הבארות עם Sigmacote (~ מיליליטר שקופית 1 /) במשך 5 דקות, להסיר. שעות 3 אופים ברדיד אלומיניום. לאחסן בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שקופיות הזכוכית המיקרוסקופיות רב גם למשך 10 דקות ב10% SDS, דקות 2 X 2 במי nuclease (autoclaved DEPC שDDH 2 O), 2 דק &#39;ב 70% אתנול, 2 דקות ב 100% אתנול, אוויר ייבוש. כל הצעדים נעשים בצנצנות Coplin autoclaved. שקופיות יכולות להיות שימוש חוזרת מספר פעמים מתן ניקוי יסודי בין כל שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני התפשטות בידוד עובר ~ 0.5 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) עם טפטפת על כל פני השטח של כל טוב והאוויר יבש. </li></ol> 1.4 מיקרוסקופ והתקנת נימים &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ הפוכה עם 10x ומטרה בהגדלה 20x. לייעל את ניגוד האור (עוברים הם די שקופים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח micromanipulator להחזיק נימי הזכוכית לצד מיקרוסקופ. נימי הזכוכית הוא מחוברת לmicroinjector (איור 3 א) או P-200 פיפטה רגילה דרך צינור גומי (איור 3, ראה דיון לתיאור מפורט של התקנה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הנימים מעל שקופית מיקרוסקופ ב~ 70 ° זווית (איור 3), ולהתאים את המיקום ליש הפתח בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני בידוד עובר תופס ולשחרר ~ 5-10 μl BSA (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) למעייל הנימים. </li></ol> 1.5 חוצצים טבלה 1 מפרטת את מאגרי הבידוד ויעד בהתאם ליישומים במורד הזרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ~ בידוד חיץ 1 מ&quot;ל לדגימה טרי לפני שימוש ולשמור אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ היעד בצינור נמוך מחייב מיליליטר אפנדורף 0.5 על קרח (יישומים מולקולריים) או בשקופית מיקרוסקופ (יישומי ציטולוגיה) בתא לח. </li></ol> 2. Dissection הזרע וחילוץ העובר 2.1 סנכרון של פיתוח זרעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> לסרס פרחים ולשמור אותם 2 ימים בחדר הצמיחה תוך הימנעות ממגע של עליים שנחשפו עם פרחים אחרים, ולאחר מכן האביק אותם (למשל 11). </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השלב של התפתחות בתנאי הצמיחה שלך על ידי חקירה מיקרוסקופית של זרעים מנוקים. עם תנאי הגידול שלנו (אור 16 שעות ב21 מעלות צלזיוס, 8 שעות חשכה על 18 מעלות צלזיוס ו -70% לחות) זרעים נאספו 2.5 ימים לאחר האבקה (DAP) הניבו בעיקר 2-4 עוברים סלולריים וזרעים נאספים 3.5-4 DAP הניב כדורי עוברים. </li></ol> Dissection זרע 2.2 ושבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את יםeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) תחת stereomicroscope עם מלקחיים ומחטים לאינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הזרעים ב20 חיץ בידוד μl בצינור הונח על קרח מ&quot;ל מסביב לתחתית אפנדורף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למחוץ את הזרעים עם העלי פלסטיק (טרום לנקות עם 10% SDS, שטף עם DEPC שDDH 2 O ונשטף עם אתנול 70%) כדי לשחרר את העוברים עד תמצית הזרעים היא חלקית. כוח ליישם הוא שייקבע על ידי כל משתמש על פי דין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העלי עם 300 μl של חיץ בידוד כדי לשטוף את העלי ולדלל את הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התמצית ב 5000 XG במשך 5 שניות. בעדינות resuspend תמצית pelleted על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התמצית עם רשת ניילון 30 מיקרומטר (רכוב על מתאמי צינור, למשל, על פי PartecCelltricks). יש לשטוף את הרשת עם חיץ בידוד μl 200 נוסף. </li></ol> 3. בידוד עובר הכנת מצגת 3.1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; מקום שקופית רב גם נקי, BSA מצופה וsiliconized על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה, resuspend תמצית הזרעים המסוננים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה ופיפטה 2 טיפות של תמצית 40-50 μl זרע לתוך בארות 1 או 2 . הקרנה רק 1 או 2 טיפות בכל פעם מונעת אידוי של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום μl 50 של חיץ בידוד טרי (1 טיפת st לשטוף) בבאר של שקופית אחרת מוכנה כמו בעבר. שמור את השקופית הזו בתא מכוסה ולח על מנת למנוע אידוי. </li></ol> 3.2 מסך, לנקות, לאסוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך טיפות של תמצית זרעים לעוברים בשלב הרצוי עם המטרה בהגדלה 10x. במידת צורך, לאשר את הבמה עם הגדלת 20x. את העוברים לרוב לשקוע בתחתית של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר באופן ידני פסולת סביב העובר עם מחט טונגסטן, מחט אינסולין או ציוד דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את נימי הזכוכית ליד העובר באמצעות micromanipulator, לאהאייק את העובר עם כפתרון קטן ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כמה עוברים (למשל כל טיפה אחת) ולשחרר אותם בטיפה לשטוף -1 (יישום מולקולרי) או במאגר היעד (יישומי ציטולוגיה). כל סיבוב איסוף צריך להיות כל הזמן בתוך דקות ועובר 5-10 צריכים להיות שנאסף בנפח מינימאלי (הנפח הכולל של כל סבבי האיסוף צריך להיות &lt;5 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ההקרנה והגבייה עד לכמות הרצויה של עוברים שנאספה בירידת 1 st לשטוף (מרכזי, אם אפשר, כדי להקל על זכירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוכר את כל העוברים בבת אחת מהירידה לשטוף (אם הפסולת מתבצעת מעל, להסיר אותם עם מחט לפני הזיכרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים לירידה לשטוף 2 nd של 50 μl. חזור על 3.2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העוברים במאגר היעד. ההעברה צריכה להיות כרוכה רק קשר, ולא טבילה, של קצה הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את microcapilלארי למדגם הבא. </li></ol>

<ol>
	<li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus.">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li><li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development.">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li><li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm.">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פיתחנו פרוטוקול בידוד עובר שהוא מהיר, יעיל, וניתן להעביר בקלות למעבדות אחרות. הציוד המתואר כאן מורכב ממיקרוסקופ ההפוך, micromanipulator, זכוכית microcapillaries, חולץ נימה אנכי וmicroinjector (איור 3 א). ההתקנה דומה לזה שתואר לבידוד תא בעלי חיים יחיד לניתוחי transcriptomics 17. כמו כן, אנו עובדים בהצלחה עם התקנה בסיסית יותר שבו זכוכית microcapillaries נמתחו באופן ידני על אש (ולחתוך עם סכין יהלום) ומופעלת באמצעות מעבדה פיפטה סטנדרטית (Pipetman P-200) במקום microinjector (איור 3). במקרה שmicrocapillary מצורף לפיפטה באמצעות צינורית גומי. 10 filtertips μl שמשו כדי להפוך את צמתים, שהיו עטופים עם parafilm כדי לגרום להם אוויר חזק. נימי - שנערך על ידי קצה פיפטה - הייתה קבועות בMICRזרוע omanipulator באמצעות קוביות קלקר וקלטת (איור 3). הגדרה בסיסית זה הוכיח להיות יעיל ואמין 8. עם זאת, אחד הקשיים העיקריים היה השמירה של אוויר חזק צמתים בין microcapillary ופיפטה, במיוחד כאשר שינוי הנימים. אימות והתאמת לחץ בנימים - מנת להבטיח גביית עובר מכוילת בנפח מינימאלי - יכולה להיות זמן רב באמצעות ההתקנה הבסיסית הזה. ההתקנה המשופרת עם micromanipulator נשלט הידראולי וחולץ מנימים אנכי היא שיפור ניכר וחוסכת זמן. את המיומנויות הנדרשות ליישום המוצלח של שיטה זו הן בקלות להעברה. חמישה משתמשים במעבדה שלנו למדו את השיטה בהצלחה בזמן קצר יחסית. כמה הפשטות של הפרוטוקול הן אפשרית בהתאם לנוחותו של המשתמש במניפולציה. לדוגמה, אפשר לדלג על השלבים 2.2.5 ו2.2.6 תוךלנתח רק 5 siliques (במקום 15) ולנקות את סביבת העובר ביסודיות מלכלוך עם מחט טונגסטן (הליך זה הוחל ב8). סנכרון של פיתוח זרעים באמצעות סירוס והאבקה מתעכבת הוא פקולטטיבי אך מומלץ להגדיל את מספר העוברים באותו שלב התפתחותי, במיוחד בשלבים מוקדמים. בנוסף, יכול להיות מזורז בידוד עובר אם שלבי כביסה מושמטים, למשל עבור יישומי ציטולוגיה. יתר על כן, שקופית siliconization (שלב 1.3.2) אינו הכרחי למשתמשים שעובדים במהירות, באופן שבו עוברים להיצמד למשטח הזכוכית על פני זמן הוא לא בעיה. בין אם סינון או ניקוי ידני מוחל, זה מאוד חשוב כדי למנוע לשאת מעל הרקמה של פסולת שיוצרת פוטנציאל לזיהום במורד הזרם או יישומי RNA-DNA. סוגיה זו הועלתה לאחרונה במחקר אפיון transcriptome בשיטה של ​​בידוד עובר שונה18. בניגוד לפרוטוקול בידוד העובר בתפזורת שתואר כאן, החוקרים ניתח באופן ידני מעוברי ארבידופסיס בתוך זרעים בודדים באמצעות מחטים עדינות, תהליך ארוך הדורש מיומנויות נתיחה מצוינות. הליך זה נדרש, ככל הנראה 2 או יותר שוטף, כדי למנוע לשאת מעל תאים מזהמים אפשריים מרקמת זרעים שמסביב, מצב סביר נתקל בעת שימוש בשיטה זו בהתחשב בגודל הקטן של העוברים, הקשיים בגישה אליהם עם מחטים לנתיחה, והדביקות של תאים סמוכים. לעומת זאת, ההליך שלנו מאפשר (אני) הדילול של עוברים-נמתח מהזרעים על הריסוק והסביבה פסולת בנפח גדול (500 μl) לפני אוסף עובר, (ii) את הבחירה החזותית של עוברים נטולי דבק, זיהום פסולת, וכן (iii) דילול אפשרי RNA-זיהום דולף מקרע תאים אחר שלבי הכביסה. בעוד שניתן להשתמש רק בשלב לשטוף אחד אםהעוברים מופיעים נקיים מאוד, ונאספים בפחות מ -5 μl 8, שלב שני הוא שטיפה מומלץ, במיוחד עבור משתמשים בפעם הראשונה שעשויות לאסוף את העוברים במספר סבבים (כלומר עם נפח תוסף). עוברים צריכים להיות שנאסף כבפתרון קטן ככל האפשר, ומאפשרים דילול המקסימאלי של מזהמים פוטנציאליים בכל צעד וכביסה. כל סיבוב איסוף צריך להיות כל הזמן קצר (תוך 5-10 דקות), כדי לאפשר התאוששות מקסימלי עם שחרור לתוך הירידה לשטוף (נוכחות רבה יותר בנימים נוטה להקטין את שיעור ההחלמה). יתר על כן, ההעברה של העוברים שנאספו לתוך מדיום החילוץ (בעקבות הצעדים לשטוף) צריך רק להיות כרוכה במגע עם הפתיחה של קצה microcapillary ולא הטבילה של הקצה, כמו זה יכול גם להעביר את הפסולת דבוקה על הקיר מעל microcapillary הפתיחה. לבסוף, הנימים צריכים להיות שונה בין כל תמצית החדשה זרע. הפרוטוקול שלנו מאפשר לכמה ירידותיישומי tream פשוט על ידי שימוש חיץ בידוד מתאים, כי לשמור על שלמות מולקולרית של RNA, ה-DNA, הכרומטין, כתב אנזים או פלורסנט. אנחנו מבודדים בהצלחה עובר בחיץ בידוד RNA-RNA מגן למיצוי וניתוחי transcriptomics 8, 1x TE-חיץ עבור ניתוחי מתילציה DNA 9, פוספט 100 מ&quot;מ שנאגרו מלוח (PBS) לדגים וimmunostaining (יאניש, Grossniklaus וBaroux, לא פורסם, איור , פתרון מכתים ו5C) ללא מצע למבחני כתב גאס (19, איור 5). היישום רגיש ביותר לתנאי בידוד / איכות עובר בהחלט RNA מיצוי והגברה. הכמות של RNA חילוץ מעוברים מבודדים הייתה נמוכה למדי. מ ~ 30 עוברים בשלב התא 2-4 (ובכך 60-120 תאים בסך הכל) שנאמדו בסכום של ~ 1ng של רנ&quot;א הכל מבוסס על שני Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) וקיוביט (Invitrogen) מדידות. Following-RNA חילוץ, RNA איכות אומתה על צ&#39;יפ פיקו-RNA Agilent 6000 (Agilent Technologies). עם זאת, כמות הנמוכה של RNA חילוץ לא תמיד מספיק כדי לייצר פרופיל אמין. לפיכך, בדיקות נוספות חייבים להיעשות על החומר המוגבר (cDNA) (לדוגמא ה-PCR איתור גנים נמוכים באו לידי ביטוי, עובר ספציפי ו / או פרופיל Bioanalyzer). לבסוף, היכולת לבודד עוברים על ידי קריטריונים חזותיים בפרוטוקול שלנו היא נכס אדיר. עוברים מאותה Silique (פירות ארבידופסיס) לא לפתח סינכרוני. לפיכך, עובד על כל תמציות Silique (למשל עבור ניתוחי RT-PCR או מבחני כמותיים כתב) אינו מאפשר התאמה מושלמת עם שלב התפתחותי נתון. בידוד עוברים בשלב התפתחותי מסוים פותר בעיה זו. בנוסף, מציגה בעיה דומה בעת עבודה עם מוטציות הטרוזיגוטיים בי siliques מכילים גנוטיפים עובר שונים. בידוד עוברים על פי קריטריונים חזותיים לדistinguish למשל פראי סוג מפנוטיפים עובר מוטציה מאפשר correlating ניתוחי המשך בעלי גנוטיפ. אנחנו עשינו את זה בהצלחה לנתח מתילציה DNA בלוקוסים ספציפיים בגנוטיפים שונים 20.

העובר של צמחים פורחים מוקף האנדוספרם, רקמה תזונתית הנגזרת מאירוע הפריה שנייה. גם העובר והאנדוספרם מוקפים בכמה שכבות תאים של קליפת הזרע. ביחד רקמות אלה יוצרים זרעים, אשר יפתחו בתוך הפרי. לפיכך, רקמות וניתוחים ספציפיים של תאי עוברי ארבידופסיס לקויים בשל חוסר הנגישות שלהם בחום. עם זאת, עובר בשלבים מאוחר הכדוריים או במאוחר הם טוב יחסית נוחים לנתיחה ידנית על ידי שימוש במחטים עדינות תחת טונגסטן סטראו, או על ידי הפעלת לחץ קל על הזרע באמצעות מלקחיים כדי לחלץ אותם. טכניקות כאלה היו בשימוש בהצלחה לtranscriptome או ניתוחי אפיון epigenome כמו הכלאה microarray, רצף bisulfite, או RNA רצף (לדוגמה, 1-3). לעומת זאת, המחקרים של עוברים בשלב הזיגוטה לכדורי מוקדם יישארו מאתגרים מבחינה טכנית. נכון להיום, רק כמה מחקרים יש נציגניתוחי transcriptome orted על עוברים צעירים או באמצעות microdissection לייזר לכידה (LCM) של רקמות עוברי מסעיפי זרעים קבועים 4 או מיצוי ידני של עוברים נפרדים מתוך זרעים באמצעות כלים עדינים 5. עם זאת, ציוד LCM אינו זמין בדרך כלל והפקת מדריך לעובר בשלבים מוקדמים הוא זמן רב ודורשים מיומנויות נתיחה מצוינות כי הם לא בקלות להעברה. בנוסף לניתוחי הגנום כולו, בניתוח ביטוי גנים באתרו הם גם קשה לביצוע בעוברים של ארבידופסיס צעירים, כל ההר. במידה מסוימת, ניתן לשחרר עוברים צעירים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי לחץ עדין על הזרעים ומשמשים למבחני גן כתב או זיהוי חלבון על ידי immunostaining (לדוגמה ראה 6,7). טכניקה זו, עם זאת, אינה מאפשרת בידוד עובר תפוקה גבוהה, ובכך פוגע בניתוחים כמותיים. לכן, פיתחנו פרוטוקול יעיל ומהירלבידוד עובר מוקדם מזרעי ארבידופסיס כי הוא פשוט להתקנה, להעברה בקלות, ומתאים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם. העיקרון הבסיסי הוא לרסק את הזרעים בעדינות - גזור מsiliques צעיר בצינור Eppendorf באמצעות העלי פלסטיק בחיץ בידוד מתאים. תמצית הזרעים ממוקמת בטיפין בשקופית רב גם, והוא הוקרן בנוכחותם של עוברים שפורסמו בשלב הרצוי באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary המצורפת microinjector או פיפטה מעבדה סטנדרטית. עבור יישומים מולקולריים, עוברים נשטפים פעמיים על ידי שחרורו חזר לטיפין של חיץ בידוד חדש לפני העברתם למאגר שהיעד בנפח מינימאלי. עבור יישומי ציטולוגיה (מבחני כתב, immunostaining, דגים), ניתן להשמיט שלבי כביסה. השיטה מציעה מספר יתרונות: (i) זה מניב 25-40 עוברים ב~ 45 דקות לאפליקצית ציטולוגיהlications או בשעות 3-4 עבור יישומים מולקולריים (כולל שלבי הכביסה), (ב) שהוא מאפשר בידוד של שלבים עובריים ספציפיים, (iii) הוא בקלות להעברה לאנשים אחרים ומעבדות עקב ההתקנה הפשוטה שלה, (ד) אותה דורש ציוד במחיר סביר עבור ההתקנה הבסיסית, הניתנת לשדרוג, ו( V) זה היה בשימוש בהצלחה ליישומים שונים במורד הזרם, כגון RNA רצף 8, גן ספציפי ניתוח ה-DNA מתילציה 9, מבחני כתב (10 וRaissig et al., בהכנה.), ודגים (ג&#39;Jaenisch, ע Grossniklaus, ג Baroux לא פורסם, ראו איור 5).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>SIGMA </td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse OUT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>10777-019</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>First- strand buffer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td>
 <td>New England Biolabs Inc.</td>
 <td></td>
 <td>Different suppliers will also work </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>0030108.035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTrics&Delta; 30 &mu;m</td>
 <td>PARTEC</td>
 <td>04-0042-2316</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5wells 10 mm diameter slides</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>63421-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F1635</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus slide</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>J1800AMNZ</td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris</td>
 <td>Amaresco</td>
 <td>0497</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A2937</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycin</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>50050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS pellets</td>
 <td>Roth</td>
 <td>CN30.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Pestle</td>
 <td>VWR</td>
 <td>431-0094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microfine insulin syringes</td>
 <td>BD</td>
 <td>U-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5758</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Schaurlau</td>
 <td>ET00102500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps N5</td>
 <td>Dumont</td>
 <td>0108-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer Pico Chip</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td>Nikon TMS (Japan),</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Leitz</td>
 <td></td>
 <td>Leica</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td>
 <td>Leica microsystems</td>
 <td>39430101</td>
 <td>Different brand will also do the work</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vertical filament puller</td>
 <td>Sutter instrument</td>
 <td>P-20 model</td>
 <td>Other model are also suitable </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Tram vario</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>5176.000.033</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

בצמחים פורחים, העובר מתפתח בתוך רקמה מזינה - האנדוספרם - מוקפת נעשה עור הזרעים האימהי (או מעיל זרע). כתוצאה מכך, את הבידוד של עוברי צמחים בשלבים מוקדמים (שלב 1 עד תא כדורי) הוא מבחינה טכנית מאתגר בשל הנגישות היחסית שלהם. נתיחת שימוש יעילה בשלבים מוקדמים הנו פגומה מאוד על ידי הגודל הקטן של זרעי ארבידופסיס צעירים והדביקות של העובר לרקמות שמסביב. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת בידוד יעיל של עוברי ארבידופסיס צעירים, מניב עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. עוברים משתחררים לחיץ בידוד על ידי ריסוק מעט 250-750 זרעים עם העלי פלסטיק בצינור Eppendorf. זכוכית microcapillary קשורה הוא למעבדת פיפטה סטנדרטית (דרך צינור גומי) או microinjector נשלט הידראולי משמש כדי לאסוף עובר ממקום טיפותד בשקופית רב גם במיקרוסקופ אור הפוכה. את הכישורים הטכניים הנדרשים הם פשוט והעברה בקלות, וההתקנה הבסיסית אינה דורשת ציוד יקר. עוברים שנאספו מתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כגון מבחני גן כתב RT-PCR, RNA רצף, ניתוחי מתילציה DNA, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), immunostaining, ו.

הליך בידוד העובר שלנו (איור 1) מאפשר בידוד של עד 40 עוברים בשעה 4 אם שוטף מבוצע, למשל עבור יישומים מולקולריים, או בפחות משעה אם שוטף מושמט, למשל עבור יישומי ציטולוגיה. מציג איור 2 גבוה ונמוך טיפים microcapillary איכות ואיור 3 מציג את ההגדרה של המכונה בידוד העובר. איור 4 מציג תהליך של בידוד עובר במיקרוסקופ ההפוכה. אנחנו מיושמים בהצלחה ההליך שלנו עבור יישומים שונים שפורסמו בכמה מאמרים אחרונים. השיטה פותחה במקור כדי לנתח את תרומת ההורים לtranscriptome העוברי המוקדם. עוברים היברידיים שנוצרו באמצעות הכלאות בין שתי הצטרפויות ארבידופסיס שונות (לנדסברג erecta (L ER) וקולומביה (Col-0)) היו מבודדים בשלב התא 2-4. סך RNA הופק, cDNAספריות הופקו באמצעות הגברה ליניארית ורצף על פלטפורמה מוצקה. את transcriptomes האלל הספציפי היו שנוצר בהתבסס על ניתוח SNP 8. כדי לשלוט בספריות cDNA העובריים שלנו לפני שאנחנו רצף מוגבר תמלילי עובר ספציפיים, WUSCHEL-homeobox 2, 8 ו -9 (WOX2, WOX8, WOX9) ותקטין 11 (13,14, איור 5 א). בנוסף, בשיטה זו נעשתה שימוש כדי לבודד עוברים צעירים כדי לנתח את דפוסי ה-DNA מתילציה העובריים בלוקוסים ספציפיים בגנום. עוברים היו מבודדים ורחצו ב1x TE-חיץ. רצף bisulfite בקנה מידה קטן בוצע כפי שתואר 9,15. בדומה לכך, בידוד העובר הוכיח מאוד שימושי במבחני גן כתב עם ביטוי נמוך עוברי, ושבו מעיל האימהי הזרע מבלבל את זיהוי או שהוא רעול פנים על ידי ביטוי עיתונאי ברקמות הסובבות את העובר (האנדוספרם, מעיל זרע). עוברי קאר<html> יינג transgene הכתב מוכתם (SS-glucuronidase; גאס) או ישירות ניתחו (חלבון ניאון ירוק או אדום, GFP, RFP) לאחר בידוד. דוגמה לכך היא נתון באיור 5 ב לעוברים להביע גן כתב גאס תחת השליטה של אמרגן MEDEA (עמ &#39;MEA) 10. יחסית קלות שבה ניתן לבודד עוברים רבים גם מאפשרת לניתוחים כמותיים (לדוגמא מספר העוברים המוכתמים ברקע גנטי שונה, Raissig, Grossniklaus et al. בהכנה). לבסוף, אנו מיושמים בהצלחה ניאון הכלאה באתר (דגים) וטכניקות immunostaining לחקר הארכיטקטורה הגרעינית בעוברים מבודדים מוטבעת ברפידות acrylamide בשקופיות. דוגמה של דגים באמצעות בדיקות נגד חוזר centromere ואזורי ארגון nucleolar מוצגת באיור 5 ג. <html> 1 &quot;עבור: תוכן-width =&quot; 5IN &quot;עבור: src =&quot; / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. תרשים זרימה של הליך בידוד עובר הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים: 1 - הכנת חומר; 2 - נתיחת זרעים; 3 - בידוד העובר.. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50371/50371fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50371/50371fig2.jpg" /> איור 2. טיפים microcapillary. טיפים microcapillary באיכות גבוהה עם א פתיחה חלקה של כ -100 מיקרומטר. טיפים microcapillary נמוך באיכות B. עם פתח רחב יותר וקווי מתאר לא סדיר (הטיפים האלה הם מקובלים עבור יישומי ציטולוגיה בלבד). בר סולם: 2 מ&quot;מ. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. הגדרה של המיקרוסקופ בידוד העובר. א &#39;וההקרנה ב&#39; מתבצעת על שקופיות מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary קבוע על micromanipulator לשלוט במדויק את עמדתה (ראה גם איור 4) ומחוברים לשני microinjector () או הסטנדרטית המעבדה פיפטה (ב &#39;). א זכוכית microcapillary קשורה לשליטה הידראולית microinjector (למשל Eppendorf הסלולרי חשמלית Vario) לשליטה מדויקת בזמן עובר האוסף B. כוס microcapillary מחובר לפיפטה באמצעות צינור גמיש גומי סטנדרטי P-200. אוסף העובר ושחרורו נשלט על ידי סיבוב גלגל הכיול של פיפטה. טיפים פיפטה Cut-end משמשים כמחברים וצומת חתומים עם parafilm. מיילcrocapillary קבוע על micromanipulator באמצעות בלוקים קלקר, צינורות דיה ועל קלטת. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50371/50371fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50371/50371fig4.jpg" /> איור 4. תהליך בידוד עובר. א עובר תא 2-4 (חץ) זוהה בתמצית הזרעים (טיפת הקרנה) והוא מוקף בפסולת (שברי מעיל זרע). ב &#39;הפסולת שמסביב הוסרה באופן ידני באמצעות מחט. ג נימי הזכוכית הועברה לצד ימין את העובר (חץ). ד העובר נאסף ועכשיו בתוך כמה העוברים. E. הנימים (חץ) בטיפה האחרונה בעקבות שוטף. סולם = 50 מיקרומטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50371/50371fig5.jpg" /> F<html> igure 5. יישומים במורד הזרם של בידוד עובר ניתוחי התבטאות גנים א:. ההגברה PCR של WOX9, WOX2, WOX8 וACTIN11 13,14 בספריות cDNA (שנוצר כמתואר 8) בין 2-4 עוברים סלולריים שטפו 1x פעמים (מסלול 1) ועל הגנומי assay-DNA (מסלול 2) ב &#39;כתב:. עובר 8 תאים מבודדים מצמחים שנשאו AP MEA :: גאס המבנה היה מוכתם בשקופית בפתרון מכתים גאס סטנדרטי (לשכפל מRaissig et al, 2011 לאחר אישור. תא צמח, ASPB זכויות יוצרים). ג פלורסנט הכלאה באתרו (דגים): 8 תאי עובר היה הכלאה עם בדיקות חוזרת נגד centromeric (אדום), ו45s חזרות של rDNA (ירוק) לפני immunodetection העקיף 16. את תמונות הדגים כפולי הצבע היו מעולף עם counterstaining DAPI ותמונות DIC (מיקרוסקופ DM6000B epifluorescence, לייקה, גרמניה). תוכן &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בקשה </td><td> חיץ בידוד </td><td> חיץ יעד </td></tr><tr><td> RNA חילוץ (למשל להגברה וtranscriptomics) </td><td> 1x חיץ ראשון סטרנד (Invitrogen), 1 מ&quot;מ DTT, 4% RNAseOUT </td><td> חיץ מיצוי RNA </td></tr><tr><td> מיצוי DNA (לדוגמה עבור סידור bisulfite) </td><td> 100 מ&quot;מ טריס, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) </td><td> ה-DNA מיצוי חיץ או 1x TE חיץ </td></tr><tr><td> ניתוח כתב ה-GFP </td><td> 1 M Glycin ב0.5x 1 MS </td><td> 1 M Glycin ב-MS 0.5x </td></tr><tr><td> ניתוח כתב גאס </td><td> מכתים את החיץ 2 בלי ה-X Gluc (מצע) </td><td> מכתים את החיץ עם X-Gluc (מצע) </td></tr><tr><td> פיש &amp; Immunostaining </td><td> פוספט 100 מ&quot;מ נאגר מלוח (PBS) </td><td> תמהיל Bisacryl (33:3) על Superfrost פלוס שקופית פלמר למשך 30 דקות: הופעל אקריל </td></tr></tbody></table> טבלת מס &#39;1. ניתן להתאים בידוד ויעד עבור יישומים במורד הזרם מאגרים שונים. מאגרים לדרישות ניסוי ספציפיים Murashig 1 &amp; Skoog בינוני. 2 למשל ג&#39;פרסון et al., EMBO 6 (13) י, 3901-3907 (1987)..

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds at JoVE.com

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח מ<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים. יכולים להיות מבודדים עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. ההליך מתאים לtranscriptome, מתילציה DNA, ביטוי עיתונאי גן, immunostaining וקרינה<em&gt; באתר</em&gt; ניתוחי הכלאה.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

17.7K Views.  University of Zürich. אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח מ Thaliana ארבידופסיס זרעים. יכולים להיות מבודדים עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. ההליך מתאים לtranscriptome, מתילציה DNA, ביטוי עיתונאי גן, immunostaining וקרינה באתר ניתוח...

Video: Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video