עבודה זו נתמכה על ידי ברית לאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות מענק R01NS073635 לAV.

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של צלחת תרבות 35 מ&quot;מ: פתרון סוג קולגן 1 מסופק כתמיסה מימית ב20 מ&quot;מ חומצה אצטית (~ 100 חלבון מ&quot;ג / בקבוקון). לדלל נפח מתאים של תמיסת קולגן לריכוז עבודה של 0.01% משימוש במים בכיתה רקמת סטרילית תרבות. מנות מעילים עם 1 מיליליטר של תמיסת קולגן ל3-4 שעות בטמפרטורת חדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס, או הלילה ב 2-8 ° C. הסר פתרון עודף מהצלחת המצופה ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה. יש לשטוף את הצלחת עם מים כיתה תרבית רקמה או PBS לפני הוספת מדיה. ניתן לאחסן כלים מצופים על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הנשר בינוני של Dulbecco המלא השתנה (DMEM). מוסף DMEM (500 מיליליטר) עם FBS 10% ופתרון האנטיביוטיקה antimycotic (ריכוז 1x; 1 ml/100 מיליליטר). ניתן לאחסן DMEM המלא על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot (50 מיליליטר) של DMEM עם DNase אני (0.001 מ&quot;ג / מיליליטר), (המכונה DMEM-DNase אני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot אחר (10 מיליליטר) של DMEM עם collagenase וdispase (1 מ&quot;ג / מיליליטר) (המכונה DMEM-collagenase/dispase). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא האנדותל תרבות בינונית (ECCM 500 מיליליטר), בתוספת EGF (5 מיקרוגרם), ECGs (100 מ&quot;ג) ו -5 μl של פתרון האנטיביוטיקה antimycotic. ניתן לאחסן ECCM על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm כל אמצעי התקשורת לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ טיהור: PBS, pH 7.2 עם BSA 0.5% ו2 מ&quot;מ EDTA. שמור על חיץ קר (2-8 ° C). </li></ol> 2. ההסרה של עוברים וDissection של telencephalon כל הניסויים באמצעות חיות מעבדה מאושרים על ידי ועדות טיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים מקלין ותואמים את הנחיות NIH לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברים בעיתוי הריון CD1 (יום עוברי 15). היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב יום עוברי 0 (E0). סכרי CD1 בדרך כלל מייצרים המלטות גדולות, ולכן 10-12 עוברים צפוי מסכר בהריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לhysterotomy, להרדים עכברים בהריון עם זריקת intraperitoneal של קטמין / Xylazine (5 מ&quot;ג / קילוגרם) (100 מ&quot;ג / קילוגרם). לעכברים כ 20-30 גרם, לספק 0.3 מיליליטר של חומר הרדמה 10 מיליליטר / קילוגרם קטמין / Xylazine ולהבטיח שכאב והמצוקה היא מינימאלית במהלך זריקות intraperitoneal של חומר ההרדמה. השתמש ביד איפוק לזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן. הסר את העוברים מעכברים בהרדמה עמוקה. לערוף כל עובר מייד עם ההסרה מהאם. מניחים את הראשים העובריים בצלחות פטרי סטרילית בקרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב כריתת רחם על ידי המתת חסד מיידית עם מנת יתר של חומר הרדמה (130 מ&quot;ג / pentobarbital קילוגרם, ה-IP), שיטה להמתת חסד, אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים: 2013 Edition. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את המוח מהראש במספריים microtip בסדר ומלקחיים בסדר. הערה: לנתח באיכות גבוההיון הוא חיוני כדי להסיר בהצלחה את קרום pial מהמוח העוברי. זו מושגת על ידי תרגול. מלקחיים בסדר ומספריים microtip גם כלים מרכזיים להשגת נתיחה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי לקבל אחיזה איתנה על המוח ומספרי microtip לקלף את קרום pial. הסר את mesencephalon וmetencephalon ולבודד את telencephalon. העבר telencephalon pial נטול מכל העוברים למנת תרבות 35 מ&quot;מ עם 2 מיליליטר PBS בקרח. </li></ol> 3. בידוד תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר בtelencephalon ל1-2 ברי מ&quot;מ עם להב סכין מנתחים ולאסוף רקמה בצינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של DMEM המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הרקמה בעדינות אך ביסודיות עם טפטפת מיליליטר 1 עד גושים נעלמים והשעיה חלבית מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ניתקה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את supernatant וגלול resuspend ב DMEM-DNase I. בזהירות בעדינות לנתק את ceLLS שוב באמצעות פיפטה 1 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 800-1,000 במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור בDMEM המלא החם. תאי סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר סטרילי. איסוף תאים מסוננים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תא החלקים נשמרו ברשת ולעכל נוסף עם DMEM-collagenase/dispase (2 מיליליטר) ל1-2 דקות ב RT. לשטוף 3x תאי DMEM-DNase אני באמצעות צנטריפוגה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT. בריכת תאים אלה עם התאים המסוננים שנאספו בשלב 3.5. שטוף תאים בסך הכל פעם אחת עם DMEM מלא. המשך כדי לקבוע מספר תא וצעדי תיוג מגנטיים. הערה: חשוב לקבל השעיה תא בודד לפני תיוג מגנטי. </li></ol> 4. תיוג מגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מראה את התיוג המגנטי של 10 7 תאים. למספרים סלולריים נמוך מ10 7, להשתמש באותו נפח ומגיבים למספרים סלולריים גדול מ10 7, בהיקף של עד כל הכרכים מגיב וכרכים בסך הכלבהתאם (למשל עבור 2 x 10 7 תאים בסך הכל, השתמש פעמיים בנפח של כל ריאגנטים מצויינים). שמור את כל חומרים כימיים ותאים בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר סלולרי עם hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 90 μl/10 7 תאים של חיץ טיהור לתא גלולה ואחרי 10 μl של microbeads CD31. Microbeads המסופק על ידי יצרן הם מצומדת לmonoclonal נוגדן CD31 אנטי עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר. הערה: בטמפרטורות גבוהות ו / או זמן דגירה ארוך יותר בתיוג מגנטי עלולות לגרום ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי הוספת 1-2 ml/10 7 תאים של חיץ טיהור ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 500 μl של חיץ טיהור. המשך להפרדה מגנטית או צעד טיהור. </li></ol> 5. פוrification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עמודת MS בשדה המגנטי של MACS מפריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העמודה עם 500 μl של חיץ טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל השעיה תא על הטור. טען מספר המתאים של תאים לעמודת MS כמספר תאים גבוהים יותר עשוי לסתום את העמודה. זהירות: כל עמודת MS יכול להכיל מספר מרבי של 2 x 10 7 תאים, למספר תא גבוה יותר, להשתמש יותר עמודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף וזורקים זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור עם 500 μl של חיץ טיהור שלוש פעמים. במהלך שלבים לשטוף, לוודא כי מאגר העמודה ריק לפני הוספת aliquots חיץ טיהור שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה ממפריד MACS ולמקם אותו על צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוכנה מסופקת יחד עם עמודת הטרשת הנפוצה. פיפטה 1 מיליליטר של חיץ טיהור על טור MS ומייד לשטוף את התאים שכותרתו מגנטית על ידי תקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cel פלייטls על צלחת תרבות 35 מ&quot;מ precoated עם סוג קולגן 1 ולגדל תאים בECCM בחממה מוגדרת 37 ° C עם 95% O 2 ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל ארבעה ימים. השתמש PVECs לניסויים או תת לאחר 10-12 ימים כאשר המנה היא מחוברת. </li></ol> 6. תת של PV ECS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ECCM ולשטוף monolayer של PVECS עם 1-2 מיליליטר של PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 1.5 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA כדי לכסות את monolayer התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. בתוך 5-7 דקות, תאים להתנתק מהמשטח של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי התאים יש מנותקים, מייד להוסיף נפח שווה של מעכבי טריפסין וtriturate מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי צינור פלקון 15 מיליליטר סטרילי. צנטריפוגות הצינור ב XG 500 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של ECCM prewarmed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים להרחבת התרבות, imהזדקנות או מבחני אחרים. </li></ol>

<ol>
	<li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system.">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li><li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo.">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS:+a+new+twist+on+an+old+tale.">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li><li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li><li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia,+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits.">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain.">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream.">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

PVEC של יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תאי בוגרים מוח אנדותל וECs ממקורות רקמות אחרים ללימודים המתמקדים באינטראקציות עצבים וכלי דם וגם יש פוטנציאל טיפולי. להכנת PVEC, זה קריטי עם תחילת נתיחה כדי לעבוד מהר כדי להשיג את כדאיות טובה שכן תאים מתים עלולים להיקשר nonspecifically לmicrobeads CD31. בנוסף, אם ההשעיה תא בודד לא תושג לפני צעד התיוג המגנטי, זה יביא לפתרון בעיות שכן גושי תא יהיה לסתום את העמודה. יתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בדגירה עם טריפסין לנתק את התאים מחרוזים מגנטיים, צעד זמן רב וקשה המשמש לעתים קרובות בשיטות אחרות מגנטיות מבוסס חרוז הפרדה להכנות EC 4,7. בנוסף, טכניקת הבידוד הזה אינה דורשת כמויות גדולות של רקמת מוח עוברית. ניתן להכין PVEC של עקביות עם השימוש בעכבר בהריון בעיתוי בודד בapproximately 12 ימים, subcultured, ולהשתמש במגוון רחב של במבחנה בניסויי vivo. טוהר PVECs לאחר הבידוד הוא מעל 90% אבל טוהר PVECs לאחר תת 100%. בנוסף לתאי אנדותל, PECAM-1 נמצא על פני השטח של מונוציטים / מקרופאגים. מיקרוגליה, אוכלוסיית macrophage של מערכת העצבים המרכזית הוא אולם נמוך מאוד במוח העכבר העוברי בהשוואה לאחרי לידה או מוח בוגר 8. מונוציטים / מיקרוגליה צריכים בינוניים בתוספת 10% עוברי עגל בסרום וגורמי גדילה ספציפיים לגדול, הם יגוועו בסופו של דבר ECCM ולא יחזיקו מעמד אחרי תת של PVECs. כאשר PVECs הטהור 100% יש צורך מייד לאחר בידוד (לדוגמא, כדי לבדוק את ביטוי הגנים), אנו משתמשים בתא קרינה המופעל מיון שיטה (FACS). אז PVECs מבודדים מעוברי Tie2GFP (שבו רק תאי אנדותל להביע GFP) ומסודר בקפדנות על ידי ניתוח FACS כפול. טוהר endothelia הממויןתאי l מובטחים על ידי אוסף של תאים, כי הם חיוביים כפולים עבור ה-GFP וCD31/PECAM-1 6. תרבויות גם הם נצפו מקרוב בשבוע של הבידוד הראשון לזיהום סוגי תאים כמו pericytes. מאחר ותאי pericyte סדירות הם בצורה ולא יהוו monolayer ומחוברות בניגוד לתאי האנדותל אשר מורכב של ציר בצורה או תאי מצולעים, פנו הגדלים כמושבות, הם קלים לזיהוי אם הוא קיים. אם זיהום pericyte מזוהה, ריכוז נמוך של טריפסין (0.05%) ואחריו הליך trypsinization מהיר (2-3 דק &#39;) משמש לתת של PVECs. Pericytes דורש זמן ממושך trypsinization (7-10 דק &#39;) ויישאר מחובר. בנוסף, יעילות ציפוי של pericytes trypsinized (אם בכלל) היא גרועה מאוד. צעדים אלה למנוע זיהום pericyte ולהבטיח כי PVECs subcultured הם טהורים. בינוני ECCM הוא מדיום בסרום נמוך המכיל הידרוקורטיזון,הפרין ו -2% בסרום שור העובר והוא השלימו עם עוריות Growth Factor (EGF) ותוספת צמיחת תאי האנדותל (ECGs). PVECs גדל בECCM הראה מורפולוגיה ציר בצורה עקבית. ECGM מוח החולדה מכיל 10% בסרום שור עוברי, גורמי גדילה, וVEGF. יש לי PVECs גדל בתקשורת זה מורפולוגיות מאוד מוארכות וייקח זמן רב יותר כדי להשיג confluency. מדיום DMEM-F12 הוא תוספת 10% בסרום שור עוברי, Glutamax ותוספת צמיחת תאי אנדותל וזה גורם ליותר תפוצה מאשר אמצעי תקשורת אחרת. למרות PVECs גדל בתקשורת זה הראה צמיחה מהירה מאוד וconfluency שהושג ב4 ימים, המורפולוגיות שלהם היו שטוחות או מצולעים בלבד. יש לנו גדלו PVECs בECCM לתקופה של עד שלושה קטעים ללא הפסד של הפנוטיפ ותפקוד. לכן, ECCM הוא המדיום שאנחנו מעדיפים לתרבות PVEC. PVECs cocultured עם מבשרים עצביים על ידי פרוטוקול זה, צפוי לעורר נוירוגנזה ונדידת נוירונים לfaהיקפים r-גדולים מתאי אנדותל ממוח בוגר או ממקורות אחרים ועשויים להיות בעל ערך לסיוע להתאוששות של תפקוד נוירולוגים בשבץ מוחי, פגיעה מוחית טראומטית או ניוון מוחיים. מבשרים עצביים המושתלים במוח הבוגר כבר דיווחו פעמים רבות לדוכן ולא מצליחים להעביר לאזורים שדורשים נוירונים חדשים. בעיה זו היוותה להיעדרות של מצעים המאפשרים העברה עצבית כמו מדריכי גליה רדיאלי 9. כלי דם הוא יותר ויותר מוערך כמו מצעים לנדידת נוירונים 6,10,11. PVECs עשויה להציע פתרון למבשרים עצביים נתקע אלה באתרי השתלה. Coimplantation של PVECs ונוירונים לאזורי מוח פגועים עשוי להקל על הגירה מודרכת של הנוירונים על ידי תאי האנדותל ולסייע בהשגת התאוששות תפקודית. הקשר ההדוק של תאי האנדותל עם נוירונים נודדים גם גורם להם מתאים באופן ייחודי כדי לספק גורמי גדילה וmorphogens ישירות ובאופן סלקטיבי לתוךנודד תאי עצב.

אנגיוגנזה, נוירוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים קריטיים במערכת עצבים מרכזית (CNS) פיתוח, תיקון והתחדשות. מספר מחקרים אלגנטיים הראו כי תאי האנדותל לעורר התפשטות עצבית ולהיפך באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים ועל ידי מגע ישיר. מצאנו את זה מוזר, כי ברוב המחקרים הללו 1-3, ואילו אבות עצביים / תאי גזע עצביים מבודדים מהמוח העוברי, הם cocultured עם תאי אנדותל מהמוח הבוגר, מקורות רקמות מבוגרים אחרים, או עם שורות תאי האנדותל. זה עשוי בחלקו להיות בשל הקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וculturing אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מהמוח העוברי. עם זאת, אנגיוגנזה, נוירוגנזה, ונדידת נוירונים הן אירועים מקבילים המתרחשים בסדרי גודל חזק יותר במוח העוברי מאשר במוח המבוגר הנורמלי. רשת כלי דם periventricular של embryoniמוח קדמי ג (telencephalon) מקורו בכלי הממוקם בתוך primordium הגרעינים הבזליים ומתפתח בצורת הדרגתית מסודר מגחון להגבה telencephalon ידי היום עוברי 11 (E11) 4,5. מקלעת זו של כלי שיט של רשת כלי דם periventricular נבדלת כלי pial מבוסס על מקורות, מיקום האנטומי, דפוסי צמיחה, ורגולציה התפתחותית 4,5. הכיוון של התפשטות של שיפוע אנגיוגנזה periventricular תואם את שיפוע neurogenetic הרוחבי telencephalic. בתוך telencephalon, שיפוע אנגיוגנזה periventricular והשיפוע של נוירונים GABA הנודדים בעקיפין חופף מרחבית, כמו גם 6. עם כל כבוד לעיתוי, שיפוע אנגיוגנזה הוא מראש של שיפוע השיפוע ונוירון GABA neurogenetic ידי על יום. לכן, תאי האנדותל periventricular הם מרחב ובזמן בעמדה טובה כדי לספק רמזים קריטיים לתמוך נוירוגנזה telencephalic ו4,6 נדידת נוירונים. לכן, שימוש בתאי אנדותל periventricular עובריים בניסויי coculture עם אבות ו / או נוירונים עצביים יספק מודל חיובי יותר ללימוד אינטראקציות עצבים וכלי דם ובפיתוח אפיקים חדשים לטיפול במחלות ניווניות או פגיעה המוחית איסכמי / טראומטית. אנו מדגישים את החשיבות של הסרת קרום pial, לא רק כדי להגביל את זיהום תאי אפיתל, אלא גם כדי להפריד בין תאי האנדותל pial אשר מולקולריים ומובחנים מבחינה פונקציונלית מתאי האנדותל של הרשת periventricular כלי דם 4,6 (PVECs מכונה להבדיל מECs pial) . כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו משתמשים באופן שיגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג תשואה עשירה וטהורה של PVECs. תאי האנדותל אלה הוכנו מforebrains העוברי בודד מעכבר מתוזמן בהריון אחד. הם יכולים להיות מורחבים, subcultured, וקפוא למטה בהצלחה לשימוש עתידי.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagen, Type 1 solution from rat tail&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Quality Biologicals</td><td>114057-131</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MS column</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CD31 microbeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MACS separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MACS multi stand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antibiotic and antimycotic solution</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Culture dish</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ECCM kit</td><td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF, and Soybean Trypsin Inhibitor</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RBECGM</td><td>Cell Applications</td><td>R819-500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue culture grade water</td><td>Life Technologies</td><td>15230162</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q25021</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Biotinylated Isolectin B4 antibody</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Von Willebrand factor</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hardset Mounting Media with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein Animal Health Supply</td><td>44028</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>7 inox</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine microtip scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS5611</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of endothelial cells from the embryonic forebrain

תאי האנדותל המוח עובריים יכולים לשמש ככלי חשוב במחקר של אנגיוגנזה ופיתוח neurovascular ואינטראקציות. שתי רשתות כלי הדם של המוח הקדמי העוברי, pial וperiventricular, הן במרחב ייחודיים ויש להם מקורות שונים ודפוסי צמיחה. יש תאי אנדותל מרשתות כלי דם pial וperiventricular פרופילים ייחודיים ביטוי גנים ופונקציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מרשת periventricular כלי הדם (PVECs) של המוח הקדמי העוברי (telencephalon). בגישה זו, telencephalon נטולת קרום pial מתקבל מיום עוברי 15 עכברים טחונים, מעוכל עם collagenase / dispase, והתפזרה באופן מכאני לתוך השעיה תא בודדת. PVECs הם מטוהרים מהשעית תא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן anti-CD-31/PECAM-1 מצומדת לmicrobeads באמצעות חזק מגנטישיטת הפרדה. תאים מטוהרים בתרבית על קולגן 1 מנות תרבות מצופים במדיום תרבית תאי האנדותל עד שהם הופכים ומחוברות וsubcultured נוסף. PVECs שהושג עם מרוצף זה פרוטוקול תערוכה ופנוטיפים ציר בצורה, כפי שדמיין ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טוהר של תרבויות PVEC הוקם עם סמני תא האנדותל. בידיים שלנו, שיטה זו אמינה ועקבי תשואות אוכלוסיות טהורות של PVECs. פרוטוקול זה יהיה לטובת מחקרים שמטרתם להשיג תובנות מכניסטית לאנגיוגנזה המוח הקדמי, הבנת אינטראקציות PVEC, ושיחות צולבות עם סוגים עצביים תא ובעל פוטנציאל אדיר לאנגיוגנזה הטיפולית.

האפיון פנוטיפי של PVECs מהיום 1-12 מוצג על ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד (איור 2). התאים מחוברים לצלחת על מאפיין מורפולוגיה מופע יום 1 של חלוקת תא (איור 2 א). בין 5-8 ימים, מעבר PVECs מאבן חלוק לציר מורפולוגיה בצורה אופיינית לתאי האנדותל ודומים יותר למצבו בvivo (2B דמויות ו2C). ביום 12 תרבות PVEC משיגה מפגש מלא (איור 2 ד). ניתן subcultured PVECs קלות להרחיב את המושבה (איורים 2E-G). הטוהר של תרביות תאי אנדותל הוקם עם סמני תא האנדותל - isolectin B4, CD-31/PECAM-1, פון Willebrand פקטור (VWF) וVE-cadherin והיה נחוש להיות מאה אחוז לאחר תת (איורים 2H-K). תמונות בהגדלה גבוהה של PVECs הוכנו מעוברי CD1 כמו גם עניבהעוברי 2-GFP 4 (תאי האנדותל שמבטאים GFP) מוצגים (איור 3). בנוסף למרוצף המשותפת ומורפולוגיה ציר בצורה (איורים 3A-C), מורפולוגיות מצולעים עם תהליכים רזים נצפו גם בisolectin וTie2-GFP + יש PVECs (3D דמויות ו3E) שכותרתו B4. בחלק ממנות תרבות קולגן המצופה שלנו (בהעדר Matrigel), PVECs נוצר דפוסי סריג דומים למאפיין הייחודי של in vivo periventricular רשת כלי הדם (איור 3F). זה משקף את פוטנציאל angiogenic הגבוה של PVECs. Assay אנגיוגנזה בוצע בי PVECs (2 x 10 4 תאים) נוספו מנות תרבות מצופים במטריצת Matrigel. PVECs הראה היווצרות צינור חזקה בתוך 18 שעה (איור 3G). תוצאות אלו מספקות ראיות חזקות כי מערכת זו יכולה לשמש כמודל במבחנה תא האנדותל. PVECs מבודדמעוברים CD1 יכול להיות מתויג במהירות עם nanocrystals Qdot (איור 3H) המספקים הקרינה יציבה אינטנסיבית לתוך הציטופלסמה של תאי חיים ויכולים לשמש למחקרים ארוך טווח של PVECs החי, כולל הגירה, תנועתיות, מורפולוגיה, מבחני תא פונקציה כמו גם בניסויי vivo. ניתן transfected PVECs עם קליעים נותבים תא כמו תא אור פלזמה ממברנה-RFP, BacMam 2.0 (איור 3I) לפי הוראות יצרן להדמיה ברורה של מורפולוגיה של תאים בניסויי הדמיה תא חיים. אנחנו מתורבת PVECs לא רק בECCM, אלא גם במדיום עכברוש אנדותל מוח צמיחת תאים (RBECGM) ובינוני F12 DMEM. שניהם בניגוד השלב (איורים 4 א, ​​4C, ו4E) וB4 isolectin כותרת תמונות (4B דמויות, 4D, ו4F) של PVECs תרבית ECCM (איורים 4 א ו -4 ב), RBECGM (4C דמויות ו <strong&gt; 4D) וF12 DMEM (4E דמויות ו4F) מוצגים. מעניין לציין, כי הבדלים במורפולוגיה PVEC ושיעור צמיחה הפכו בולטים. בעוד PVECs גדל בECCM הראה מורפולוגיה ציר בצורה (איורים 4 א ו -4 ב) והיה מחוברות ביום 12, PVECs גדל בRBECGM הראה מורפולוגיה מאוד מוארכת (4C דמויות ו4D) והיה מחוברות ביום 20. מצד השני, PVECs התרבותי בתקשורת F12 DMEM הראה מורפולוגיה רק שטוחה ומצולע (4E דמויות ו4F) ללא היווצרות ציר, צמיחה מהירה מאוד והיה מחוברות ביום 4. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51021/51021fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51021/51021fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. סכמטי של בידוד PVEC. הפרוטוקול המשמש לבידוד וpurification של PVECs מtelencephalon העוברית מסוכם לסכימה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51021/51021fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51021/51021fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51021/51021fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. אפיון פנוטיפי של PVECs. (AG) בניגוד שלב תמונות של תרבות PVEC בנקודות זמן שונה לאחר ציפוי. () תרבות PVEC ביום 1. התאים מצורפים ולהראות מורפולוגיות החלוקה. (ב) תרבות PVEC ביום 5 ו (ג) ביום במעבר 8 ממרוצפים לציר מורפולוגיה צורה. (ד) PVEC תרבות השיגה נקודת המפגש ביום 12. (ה) לאחר תת PVECs ביום 1, היום (ו &#39;) 5 (G </strאונג&gt;) ויום 15. (HJ) immunolabeling של PVECs באמצעות סמני תא האנדותל: isolectin B4 (H), פון Willebrand פקטור (I), CD31/PECAM (J) וVE-cadherin (K). סולם ברים:, 100 מיקרומטר (חל ב&quot;ג), K, 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51021/51021fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51021/51021fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51021/51021fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. מורפולוגיות של PVECs. (AE) תמונות בהגדלה גבוהה של isolectin וTie2-GFP + יש PVECs מראה מרוצף ומורפולוגיה ציר בצורה (AC), כמו גם מורפולוגיה מצולעים עם סיומות ארוכות ודקים (D, E) שכותרתו B4. (&lt;PVECs strong&gt; F) מראה פוטנציאל angiogenic גבוה בצלחת התרבות גם בהיעדר של Matrigel. PVECs (G) מראה היווצרות צינור חזקה בassay אנגיוגנזה על Matrigel. PVECs (H) שכותרתו עם nanocrystals Qdot. PVECs (I) transfected עם תא אור פלזמה ממברנה-RFP, BacMam 2.0. סולם ברים:, 50 מיקרומטר, B, 15 מיקרומטר (חל לספירה), F, 100 מיקרומטר (חל G, H), אני, 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51021/51021fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51021/51021fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51021/51021fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. PVECs גדל במורפולוגיה גרסת מופע תרבות תקשורת שונה. ( <strB4 אונג&gt; AF בניגוד שלב) (A, C, E) וisolectin כותרת תמונות (B, (A, B), RBECGM (C, D) וF12 DMEM D, F) של PVECs תרבית ECCM (E, F) . ברים סולם:., 100 מיקרומטר (חל BF) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51021/51021fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain at JoVE.com

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Views.  Harvard Medical School.  וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין. 

Video: Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Developmental Biology

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biology

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls and restrict access to the brain parenchyma. However, with the development of nanotechnologies, large panels of new nanomaterials were developed to improve drug delivery, highlighting the need for reliable in vitro microsystems to predict brain penetration in the frame of preclinical assays. Here is a straightforward method to set up a microphysiological system to model the BBB using solely human cells. In its configuration, the model consists of a triple culture including brain-like endothelial cells (BLECs), pericytes, and astrocytes, the three main BBB cellular actors necessary to induce and regulate the BBB properties in a more physiological manner without the requirement of tightening compounds. The model developed in a 12-well plate format, ready after 6 days of triple culture, is characterized in physical properties, gene, and protein expressions and used for polymeric nanogel transport measurement. The model can be used for an extensive range of experiments in healthy and pathological conditions and represents a valuable tool for preclinical assessments of molecule and particle transport, as well as inter-and intracellular trafficking.

This protocol describes a method to establish a human blood-brain barrier (BBB) in vitro model. The endothelial cells and pericytes are seeded on each side of an insert filter (blood compartment), and astrocytes are seeded in the bottom well (brain compartment). The model characterized was used for nanoparticles transport experiments.

מערכת תאי תרבית משולשת המדגימה את מחסום הדם-מוח האנושי

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

Source: Molino, Y. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/51278/setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb">Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2014)
This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

תרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה: הליך לבידוד ותרבית תאי אנדותל מכלי דם זעירים במוח חולדה

Source: Molino, Y. et al. Setting-up an&#160;In Vitro&#160;Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated ...