המחברים מודים לד&quot;ר Pooneh Bagher וד&quot;ר אריקה וסטקוט להערות עריכה בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות במספרי הפרס R37-HL041026 וR01-HL086483 לSSS וF32-HL107050 לMJS. תוכן זה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

<ol>
	<li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors.">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circ. Res. 78, 415-423 (1996).</li><li>Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+release+of+prostacyclin+and+thromboxanes+from+bovine+pulmonary+artery+endothelial+cells.+Studies+with+lower+homologs+and+calcium+antagonists.">Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists.</a> Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).</li><li>Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+biologically+active+autacoids+is+regulated+by+calcium+influx+in+endothelial+cells.">Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).</li><li>Busse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDHF:+bringing+the+concepts+together.">EDHF: bringing the concepts together.</a> Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).</li><li>Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-activated+K++channels+in+murine+endothelial+cells:+block+by+intracellular+calcium+and+magnesium.">Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium.</a> J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).</li><li>Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+conduction+along+endothelial+cell+tubes+from+mouse+feed+arteries:+confounding+actions+of+glycyrrhetinic+acid+derivatives.">Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives.</a> Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).</li><li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+intercellular+Ca2++signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries.">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19, 757-770 (2012).</li><li>Cohen, K. D., Jackson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+hyperpolarization+is+not+required+for+sustained+muscarinic+agonist-induced+increases+in+intracellular+Ca2++in+arteriolar+endothelial+cells.">Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells.</a> Microcirculation. 12, 169-182 (2005).</li><li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2++signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes.">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).</li><li>Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+isoform+expression+in+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells+of+hamster+cheek+pouch+arterioles+and+retractor+feed+arteries.">Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries.</a> Microcirculation. 15, 503-514 (1908).</li><li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+electrical+conduction+along+endothelial+tubes+of+resistance+arteries+through+Ca2+-activated+K++channels.">Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels.</a> Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).</li><li>Bagher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+intravascular+pressure+activates+endothelial+cell+TRPV4+channels,+local+Ca2++events,+and+IKCa+channels,+reducing+arteriolar+tone.">Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).</li><li>Faraci, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+vascular+effects+of+angiotensin+II:+new+insights+from+genetic+models.">Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).</li><li>Emerson, G. G., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+coupling+between+endothelial+cells+and+smooth+muscle+cells+in+hamster+feed+arteries:+role+in+vasomotor+control.">Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control.</a> Circ. Res. 87, 474-479 (2000).</li><li>Ledoux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+inositol+1,4,5-trisphosphate+signaling+in+restricted+spaces+of+myoendothelial+projections.">Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).</li><li>Tran, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Ca2++wavelets+and+the+induction+of+myoendothelial+feedback.">Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).</li><li>Nausch, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nerve+stimulation+induces+local+endothelial+Ca2++signals+to+oppose+vasoconstriction+of+mouse+mesenteric+arteries.">Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).</li><li>Duza, T., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+endothelial+cell+Ca2++in+response+to+mouse+cremaster+muscle+contraction.">Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction.</a> J Physiol. 555, 459-469 (2004).</li><li>Colden-Stanfield, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradykinin-induced+increases+in+cytosolic+calcium+and+ionic+currents+in+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 61, 632-640 (1987).</li><li>Brunner, F., Kukovetz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+binding+to+muscarinic+receptors+of+bovine+aortic+endothelial+cells.">Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells.</a> Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).</li><li>Tracey, W. R., Peach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+muscarinic+receptor+mRNA+expression+by+freshly+isolated+and+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.">Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells.</a> Circ. Res. 70, 234-240 (1992).</li><li>Adams, D. J., Hill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

אף אחד.

כאן אנו מתארים את הבידוד של צינורות אנדותל מהים והשימוש בתכשיר זה כדי להמחיש Ca 2 + אירועי איתות בתוך ECs המכונן שלה. הליך זה הותאם מאחד שפותח במקור לבודד צינורות אנדותל מarterioles של שריר Cremaster האוגר 8. ניצול שינויים קלים של הטכניקות שהוצגו כאן, יש לנו לבודד צינורות אנדותל ממגוון רחב של מיטות וכלי דם, כוללים: עורקי הזנה של שריר מפשק אוגר והלחי arterioles כיס 10, עורק ברום הבטן מעולה עכבר 6,7,9, mesenteric עכבר ומוחות עורקים וmicrovessels הלימפה (תצפיות לא פורסמו; אזכור כלולים לבידוד כלי mesenteric 12 וכלי מוחין 13). בידוד צינורות אנדותל מהמיטות כלי דם חדשים עשוי לדרוש שינויים בפרוטוקול המקורי. אם הבידוד הוא לא מוצלח, עדיף להתחיל על ידי שינוי פעמים עיכול:להגדיל את זמן העיכול אם צינורות אנדותל קשים לבודד מתאי שריר חלק וadventitia ולהפחית את זמן עיכול אם צינור אנדותל לא נותר על כנן. אם שינוי זמני עיכול הוא לא מוצלח, התאמת הריכוז של אנזימי עיכול או טמפרטורת העיכול צריכה להישפט. אפשרות נוספת היא להקטין את הקוטר הפנימי של פיפטה טחינה דקה, אשר מגדילה את כוח גזירה בהסרת תאי שריר חלק. הגדלת המהירות של פליטת נוזל יכול להיות גם ניסיתי במשך אותו האפקט, אבל יש יותר סיכוי לפגוע בהכנה. יש להכיר בכך שזה לא יכול להיות אפשרי לבודד צינורות אנדותל ללא פגע מכלי שבו תאי האנדותל אינם מחוברים היטב זה לזה על ידי חלבוני junctional. דיסוציאציה של תאי שריר חלק הבאים עיכול אנזימטי בתחילה בוצעה באמצעות pipettor בסגנון יד 8. יש לנו מעודן הליך טחינה דקה באמצעות microsyrמערכת אינגה, שאפשרה בידוד עקבי של צינורות אנדותל ארוכים יותר (עד 3 מ&quot;מ) 6. בעת שימוש במערכת זו, פיפטה טחינה דקה היא backfilled עם שמן מינרלים כדי לספק עמודת נוזל רציפה בין הבוכנה שליטה בתנועה וPSS המכיל את קטע כלי נוזל. Incompressibility של נוזל יחד עם כוח המניע המתמיד של תוצאות הבוכנה microsyringe בגזירה קבועה כמו הספינה נאלץ באמצעות קצה פיפטה. לעומת זאת, טכניקות ידיים המשמשות לעתים קרובות לתאים מתנערים (למשל לסחוט נורת גומי בסוף פיפטה פסטר) כרוכה בדחיסה של אוויר, אשר מציגה השתנות בלחץ הנהיגה, ובכך גזירה המופעל בקצה פיפטה. ישנם יתרונות רבים להכנת הצינור ללימוד תפקוד האנדותל בmicrovessels. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק אוכלוסיות מובחנות הומוגנית ילידים סלולריות של ECS ו mu החלקתאי scle. מאז ECs יישאר מחובר פיזי כמו צינורות, הם נבדלים מהתאים בודדים שרירים חלקים, אשר שומרים על תצורת &quot;C&quot; אם הם נשארים רגועים במהלך טחינה דקה. סוגים כך בהתאמה תא בקלות נבדלים, למשל, כאשר קבלת דגימות לשיטות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה 10. מאז צינורות מרובים מבודדים מכלי אחד (או מכלי דו צדדיים כפי שנעשה לים), ניתן לקבל נתונים מולקולריים ונתונים תפקודיים מאותו כלי של בעלי חיים מסוימים. ביטוי כך מולקולרי יכול להיות מתואם עם ההתנהגות הפונקציונלית של האנדותל כלי הדם. יתר על כן, ניתן לפתור אירועי איתות שני פנים ובין תאית מהותיים להאנדותל כלי הדם עצמאיים מהשפעתם של כוחות המודינמית (לחץ, זרימה), סוכני vasoactive נשאו בזרם הדם (למשל הורמונים), או מתאי שריר חלק שמסביב (לדוגמא60; באמצעות צימוד myoendothelial 14-16), עצבי 17, או parenchyma הרקמה 18. חשוב לציין, שכן האנדותל מבודד טרי מmicrovessels המיועד, אין שינוי של פנוטיפ שקשור בדרך אחרת עם culturing ECs 19-21. לדוגמא, ECS תרבית מאבד ביטוי הקולטן מוסקריניים ובכך לשנות את פרופילי סידן האיתות שלהם. יתר על כן, מאפייני אלקטרו של ECs יכולים לשנות בתרבות 22. בגלל ECs הבודד להישאר יחד בערוצי צומת פער פונקציונליים, צינור אנדותל מציג מודל אידיאלי לחקר ההולכה של 2 + אותות חשמליים בין התאים וCa 6,7. צריכים גם להכיר בכך שתאי שריר חלק ניתקו נלמדים בקלות עם טכניקות תיקון מהדק לנתונים משלימים שבסיס תפקוד כלי הדם 23. מגבלה העיקרית למ &#39;צינור אנדותלאודל הוא חוסר היציבות של התכשיר עם הגדלת טמפרטורה. בעוד ההכנות שלנו מהים הוכיחו יציבה ובריאים בטמפרטורת הסביבה חדר (~ 24 ° C) ובמשך כמה שעות ב32 ° C, השפלה מורפולוגיים ופונקציונלית מתרחשת בפחות משעה על 37 ° C 9. הגבלה חשובה שנייה של צינור אנדותל היא האובדן של צמתים myoendothelial ותחומים האיתות הטבועות בם, כי הם חלק בלתי נפרד מתפקוד EC בדפנות כלי הדם בשלמותה 14-16. צריך גם להכיר בכך שבעוד שצינורות ארוכים יותר יאפשר איתות אינטר להיחקר על פני מרחקים גדולים יחסית 6, הכנת הצינורות מסובכת כפי שהם מקבלים יותר, כי זה הופך להיות קשה יותר כדי לנתק באופן מלא המקיף את תאי שריר חלק וadventitia. מצאנו כי צינורות ארוכים יותר מ1-2 מ&quot;מ גם קשים יותר למצב ובטוח בתא הזרימה. בניגוד לכך, בעוד שצינורות קצרים יותר (לדוגמא: &lt;1 מ&quot;מ) ENACa 2 + וחשמל אותות ble להיחקר 8, הם קשה לשמור במהלך superfusion בתא הזרימה. לבסוף, גם עם בידוד אופטימלי של צינורות בילטרלי, יש חומר מספיק לכימות מסורתי של ביטוי חלבון באמצעות כתמים מערביים, אם כי immunolabeling מספק מדד של ביטוי חלבון ולוקליזציה. למרות מגבלות אלה, צינור אנדותל מייצג הכנה חדשנית למתן תובנה חדשה מנגנונים של תפקוד תא אנדותל כלי הדם בגוף חי.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבידוד של צינורות תא האנדותל מהים העכבר. הים נובע מהדם בעורק ואספקת בית החזה הפנימי מחומצן לשרירי בטן הקדמי. שלנו עובד עם הים כמודל ניתן לייחסו לזה מתן מגזרים ארוכים יחסית, unbranched דם קטן שמתאים גם ללימוד אירועי איתות אינטר בדבר תפקידה הבסיסי של האנדותל בשלטון ותיאום הרפיה תא שריר חלק. למעוניינים ברקמות אחרות מאשר שרירי שלד, מצאנו בטכניקה זו כדי להתאים בקלות להשגת צינורות אנדותל מmicrovessels של מערכת הלימפה במוח, מעיים ו. התכונות העיקריות של שיטה זו הן שאורכים שלמים (1-3 מ&quot;מ) של האנדותל כלי הדם מבודדים, מאובטח נגד coverslip זכוכית בתא זרימה שבו הם superfused עם PSS, וצלמת עבור Ca 2 + איתות 7-9 אומשופד ל6,8 איתות החשמלי. בתוך תא הזרימה, חיצו העליון של צינור חשוף לפתרון superfusion ומגיב להתערבויות ניסיוניות, בעוד החצי התחתון (במגע עם coverslip) מוגן ונשאר שקט. בנוסף ללימוד שני 2 אירועי Ca התוך ואינטר + איתות, צינורות האנדותל יכולים לשמש בזמן אמת PCR כמוני להערכת ביטוי גני 6,10, אימונוהיסטוכימיה לחקור ביטוי חלבון 6,10, ומחקרי אלקטרו להגדיר מאפייני biophysical של 6,11 הולכה חשמליות. ישנם מספר יתרונות להכנת צינור אנדותל ללימוד תפקוד האנדותל. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק הבחנה פשוטה בין שתי אוכלוסיות תאים: תאי האנדותל (שיישארו בהיווצרות צינור) ותאי שריר חלק (ניתקה בנפרד, בדרך כלל &quot;C&quot; בצורה שבירגוע). זה מאפשר לדגימה ומחקר של מאפיינים ייחודיים שבבסיס תרומת תאי בהתאמה לתפקוד כלי סלקטיבית. שנית, מודל זה מאפשר הרזולוציה של איתות אירועים מהותיים לאנדותל, עצמאי מההשפעה של זרימת הדם, המקיף את שריר חלק, עצבים, וparenchyma. שלישית, האנדותל הוא למד תוך מבודד טרי, ובכך להימנע משינויים בגן או ביטוי חלבונים הקשורים בתרבית תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

השליטה על זרימת דם בכלי הדם על ידי ההתנגדות מווסתת את אספקת חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של חילוף חומרים לפי מוצרים, כפי שהודגמה על ידי פעילות גופנית שרירי שלד. תאי אנדותל (ECs) מרפדים את אינטימה של כל כלי ההתנגדות ולשרת את התפקיד מרכזי בשליטה בקוטר (vasodilation למשל תלוי האנדותל), ובכך, את הגודל וההפצה של זרימת דם לרקמות. הרגולציה של התנגדות כלי דם על ידי ECs הוא התבצע על ידי Ca 2 + איתות תאית, שמובילה לייצור של autacoids diffusible (למשל תחמוצת חנקן ומטבוליטים חומצה הארכידונית) 1-3 וhyperpolarization 4,5 כי לעורר רגיעה תא שריר חלק. לכן הבנה של הדינמיקה של Ca 2 + איתות אנדותל היא צעד מפתח להבנת מנגנונים המסדירים בקרת זרימת דם. בידוד צינורות אנדותל מבטל משתנים מבלבלים קשורים blood בלומן הכלי ועם תאים המקיפים את שריר חלק ועצבי perivascular, אשר אחרת להשפיע על מבנה EC ותפקוד. כאן אנו מציגים את הבידוד של צינורות האנדותל בעורק מעולה ברום הבטן (SEA) באמצעות פרוטוקול מותאם לכלי זה. כדי לבודד צינורות אנדותל מעכבר הרדים, הים הוא את הגבעול באתר כדי לשמור על דם בתוך לומן הכלי (כדי להקל על לדמיין את זה בזמן נתיחה), ואת כל הגיליון של שרירים בטן הוא נכרת. הים הוא גזור חופשי מסביב סיבי שריר שלד ורקמות חיבור, דם סמוק מהלום, ועיכול אנזימטי מתון מתבצע כדי לאפשר הסרת adventitia, עצבים ותאי שריר חלק באמצעות טחינה דקה עדינה. הכנות טריות מבודדים אלה של האנדותל בשלמות לשמור על המורפולוגיה האם שלהם, עם ECs הבודד שנותר בשילוב פונקציונלי זו לזו, תוכל להעביר כימית וחשמלי signals intercellularly דרך צמתים פער 6,7. בנוסף לאספקת תובנה חדשה ביופיסיקה איתות סיד והקרום, הכנות אלה יאפשרו מחקרים מולקולריים של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון בתוך האנדותל כלי הדם מקומי.

יכולות להיות יזם תגובות סידן בצינורות מבודדים טרי אנדותל באמצעות אצטילכולין (ACH). בסרט הזה, צינור אנדותל עמוס 10 מיקרומטר fluo-4 AM האם מגורה עם superfusion של מיקרומטר ACH 1 (סרט 1). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בסרט.</a> הצבע הוא נרגש ב491 ננומטר ופליטה נרשמת 500-550 ננומטר באמצעות מצלמת מכשיר תשלום מצמידים התעצמה. ערימות תמונה נרכשות ב120 פריימים / השני לתקופה שניות 25 ואז יכולות להיות בממוצע (למשל ל40 מסגרות / sec). תמונות הקרינה נציג לאורך הזמן מוצגות באיור 4. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> איור 1. תא הזרימה וטפטפות שימוש במהלך הבידוד של צינורות אנדותל. </stro<html> ng&gt;) דוגמאות תא הזרימה מורכבת עם coverslip זכוכית x 50 מ&quot;מ 24 מ&quot;מ כבסיס. ב) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה, מלוטשת וזווית cannulation. פיפטה זה משמשת כדי לשטוף אריתרוציטים מלומן של העורק לאחר נתיחה. דוגמאות בקנה מידה בר = 200 מיקרומטר. ג) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה ומלוטשת טחינה דקה. הקוטר הפנימי של פיפטה זה נקבע על ידי הקוטר החיצוני של העורק. דוגמאות בר סולם = 200 מיקרומטר. ד) פיפטה משכה, שבורה ומלוטשת (משך (משמאל) וימין) מצמיד. קצה פיפטה זה מעוגל ואטום לגמרי כדי לאבטח את צינור אנדותל בתא הזרימה. בר = 200 מיקרומטר קנה המידה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> class = &quot;jove_content&quot; עבור: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> איור 2. ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק להדמיה של Ca 2 + אותות.) מיקרוסקופ הזקוף המשמש להדמית סידן. (א) יחידת דיסק ספינינג confocal עם מטרות טבילה (ב) התעצמה מצלמה מכשיר תשלום מצמידים. ג) (א) 63X (ב &#39;) NA = 1) ו (ב) 20X (NA = 0.5) המשמש להדמיה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> איור 3. בידוד של השרירים הבטן ועורק ברום הבטן מעולה. </st<html> rong&gt;) מורדם עכבר עם שרירי בטן חשופה ושלחין עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. חיצים אדומים מסמנים את האתרים תחת רפידות שומן שבימי בהתאמה להיכנס כל שריר rectus abdominis (כלומר היכן יש מקשרים את כלי דם). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. B) שרירים בטן מבודדים (חד צדדי) וSEA תלו בחדר נתיחה לmicrodissection. חץ אדום מציין את האתר הגדול הראשון של הסתעפות של הים (כלומר, הנקודה שבה ניקוי של הכלי הופסק). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. C) צינור מבודד אנדותל תא מים. תמונת ההפרש התערבות ניגודיות של צינור אנדותל הבא דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר. צינור אנדותל היה superfused עם חיץ superfusion ב3 מיליליטר / דקה. בר = 50 מיקרומטר קנה המידה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> ether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig4.jpg" width="500px" /> איור 4. הקרינה סידן בצינור תא האנדותל. תמונות ניאון נציג של צינור אנדותל בתגובה לגירוי עם אצטילכולין 1 מיקרומטר.) פלואורסצנטי לפני גירוי. ב &#39;) הקרינה צינור אנדותל בזמן ממשל אצטילכולין, t = 0 שניות. C) הקרינה צינור אנדותל ב t = 5 שניות. ד) הקרינה צינור אנדותל ב t = הקרינה 10 שניות. E) אנדותל צינור ב t = 15 שניות הקרינה צינור אנדותל. F) בזמן t = 20 שניות. ברים סולם = 40 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries at JoVE.com

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

isolation-microvascular-endothelial-tubes-from-mouse-resistance

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Views.  University of Missouri.  אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels ...

Video: Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...