Os autores agradecem ao Dr. Pooneh Bagher e Dr. Erika Westcott para comentários editoriais na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde, com os números de atribuição R37-R01-HL041026 e HL086483 de SSS e F32-HL107050 para MJS. Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.

1. Preparação do Equipamento: Fluxo de Câmara, pipetas e Soluções <ol><li> Fluxo de câmara: Usar uma câmara de fluxo, com um de 24 x 50 mm lamela de vidro na parte inferior para os tubos superfuse endoteliais isoladas (ver Figura 1A). Antes de montar a câmara, lavar as lamelas de vidro com ambos 3% HCl e 70% de etanol, lave com água ultrapura, e seque com gás nitrogênio. </li><li> Pipettes: Três tipos diferentes de pipetas são utilizadas durante o protocolo: punção, trituração e pinagem. Tanto a canulação e pipetas de imobilização pode ser feito antes do dia da experiência, mas a pipeta trituração devem ser feitas no dia de, uma vez que requer o conhecimento do diâmetro do recipiente com o tamanho do lúmen apropriadamente. <ol><li> Pipetas de punção: Para liberar as células vermelhas do sangue a partir do lúmen, puxe tubos capilares de vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta ter extremidades afiladas, longas. Quebre as pontas com uma pinça para um diâmetro externo ~ 30% less do que a das artérias (~ 50-80 um), e fogo polonês ponta para ser lisa (ver Figura 1B). É útil também ângulo das pontas das pipetas de aproximadamente 45 °. </li><li> Pipetas trituração: dissociar mecanicamente as células do músculo liso e adventícia dos tubos endoteliais, fazem pipetas trituração de tubos capilares de vidro de borosilicato. Preparar tubos capilares, como acima, e quebrar a extremidade com uma pinça. Dica: Usar um dispositivo de dobragem de vidro para torná-lo mais fácil de quebrar a parede mais espessa do vidro trituração pipeta limpa. Quebrar a pipeta para o diâmetro interno determinado no dia da experiência, cerca de 10-20 mM maior do que o diâmetro exterior do recipiente a partir do qual os tubos endoteliais será isolado. Polonês Fogo as pontas quebradas até ficar homogêneo (Figura 1C). </li><li> Fixando pipetas: Para estabilizar o tubo endotelial dentro da câmara de fluxo, faça fixando pipetas para garantir a endotelial tUBE contra o fundo lamela da câmara. Retire os tubos capilares de vidro da mesma maneira como as pipetas de canulação. Em seguida, quebrar as pontas com uma pinça para um diâmetro de ~ 100 mm, e polonês fogo até que as pontas são selados, arredondada e lisa (Figura 1D). Nota: Se a ponta da pipeta fixar não é completamente fechada, o fluido entra no lúmen e pode confundir os resultados experimentais. </li></ol></li><li> Soluções: Preparar todas as soluções em ultrapura (18,2 mohms) H 2 O e esterilizá-los através de um filtro de 0,2 um. Certifique-se que a pressão osmótica das soluções é entre 285-300 mOsm. Soluções permanecem boas durante cerca de duas semanas, quando armazenado a 4 ° C. <ol><li> Solução de dissecção: A solução de sal utilizada durante a dissecção da artéria epigástrica superior é composta por (em mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanossulfónico ( HEPES), 10 de glucose, 0,01 o nitroprussiato de sódio (SNP), umd 0,1% albumina de soro bovino (BSA) com um pH de 7,4. O doador SNP NO é incluído para ajudar a relaxar células musculares lisas, tornando-os mais fáceis de canular a artéria e para facilitar a remoção de células de músculo liso durante a trituração. </li><li> Solução de dissociação: A solução de sal utilizada durante a dissociação do tubo endotelial é composta por (em mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 2 de CaCl2, e 0,1% de BSA, com um pH de 7,4. A uma alíquota de 1 ml deste tampão, adicionar: papaína 0,62 mg / ml, 1,5 mg / ml de colagenase e de 1,0 mg / ml ditioeritritol. Desde que as enzimas de diferentes fornecedores podem ter diferentes níveis de atividade enzimática, os números dos produtos daqueles utilizados para este trabalho estão incluídas para referência na tabela de materiais. Nota: Durante o protocolo tanto tampão de dissociação e tampão de dissociação com enzimas são utilizadas em diferentes etapas. </li><li> Superfusão solução: A solução salina fisiológica (PSS) usado para superfusing o tubo endotelial isolado é composto por (em mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose e 2 CaCl 2, com um pH de 7,4. </li><li> Prepare tampões e soluções antes de iniciar os procedimentos cirúrgicos. Retirar as soluções a partir de 4 ° C, e alíquota de 50 ml de tampão de dissecção para um balão de Erlenmeyer de 200 ml e colocá-lo em gelo. Além disso, a alíquota de 50 ml de dissociação tampão sem enzimas e coloque-o na bancada para atingir a temperatura ambiente. Remover a solução de superfusão de 4 ° C e deixar equilibrar à temperatura ambiente na bancada. </li></ol></li></ol> 2. Preparação animal Certifique-se de que todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais estão de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê da Universidade do Animal Care e UseMissouri. <ol><li> Use masculino ou camundongos fêmeas pelo menos 9 semanas de idade e estudar cada um individualmente. Anestesiar um rato com pentobarbital sódico (60 mg / kg) por via intraperitoneal (ip) de injecção. Dica: Diluir o pentobarbital a 10 mg / ml em soro fisiológico estéril antes da injecção reduz a possibilidade de sobredosagem. </li><li> Anestesia compromete a regulação da temperatura, de modo a manter o mouse aquecer imediatamente após a primeira injeção de pentobarbital. Usando um suporte metálico (cesta de alumínio ventilado) no topo de uma placa de aquecimento (calibrado para ~ 37 ° C) funciona bem para manter a temperatura do rato estável. Como alternativa, use uma lâmpada de calor, tendo o cuidado de posicioná-lo a uma distância apropriada do mouse. Monitorar o mouse cada 5-10 min até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada aos pés ou cauda pitada). Uma dose suplementar pode ser requerido depois de 15-20 minutos. É melhor ir devagar e com cuidado para evitar overdose, especialmente com obesos, idosos, ou animals de outro modo estressado. </li><li> Remova o cabelo do lado ventral com cuidado raspar ele com pequenos cortar cabelo pet. Deve ser prestada especial atenção para evitar trauma ao animal. É útil para remover todos os pêlos de uma área que abrange as axilas para a área pubiana. Remova qualquer cabelo solto apego com um cotonete fresco álcool. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas, deitando-se com os dois frente-e membros posteriores espalhados expor tanto da parede abdominal possível. Se necessário, use fita de laboratório para garantir as pernas de uma forma spread-águia. </li></ol> 3. Isolamento da Artéria epigástrica Superior <ol><li> Fazer uma pequena incisão através da pele logo acima da área da região púbica. Certifique-se que apenas a pele está sendo cortado, evitando danos ao músculo abdominal subjacente; estender a incisão lateral em cada direção para fora aos respectivos membros posteriores. Continuar a incisão rostralmente ao longo da linha média ventral para o topo da caixa torácica e don estender a incisão lateral em cada direção aos respectivos membros anteriores. </li><li> Suavemente levantar a pele e utilize uma tesoura para cortar o tecido conjuntivo que prende a pele ao músculo subjacente, expondo assim toda a superfície da musculatura abdominal (ver Figura 3A). Irrigam o músculo exposta com uma solução de soro fisiológico a 0,9% temperatura ambiente. </li><li> Devido ao pequeno tamanho da SEA, posicione o animal debaixo de um microscópio estereoscópico para outros procedimentos. Levantar a almofada de gordura localizada na parte inferior do esterno com uma pinça, e fazer uma incisão através dele. Continuar a incisão ao longo da costela inferior, tomando cuidado para não cortar profundamente o tecido subjacente. A AAE deve ser visível; tomar cuidado para não danificá-lo. Uma vez que a incisão é completa, irrigar o tecido exposto com uma solução salina a 0,9% temperatura ambiente. </li><li> Após a camada superior do músculo esquelético foi retraída, a SEA eo músculo subjacente são facilmente identificados. Dica: Observe o comprimento doo SEA in vivo antes de isolar a estender tubos endoteliais (que encurtam ao longo de seu eixo no isolamento) para aproximar seu comprimento original. Utilizando uma pinça e tesouras, extirpar cuidadosamente a camada muscular fina debaixo do mar. </li><li> Utilizando uma pinça em ângulo, passe um pedaço de seda 6-0 sutura debaixo do mar e ligar a artéria e sua veia adjacente para mantê-lo sob pressão e sangue retido no interior do lúmen do vaso para facilitar a visualização durante o isolamento e limpeza posterior. </li><li> Repita o procedimento de ligadura SEA no lado contralateral. </li><li> Uma vez que ambos os oceanos têm sido ligados, fazer uma incisão ao longo da linha média dos músculos abdominais para separar respectivos lados. </li><li> Estender a incisão lateralmente em cada direcção tal como para a pele, em seguida, continuar a incisão na vertical ao longo da aresta exterior para separar completamente o músculo abdominal do corpo. Evite danos à vasculatura alimentado pela SEA para manter o lúmen pressurizados. </li><li> Cut a SEA acima da ligadura para manter o selo, e coloque o músculo isolado e artéria em um copo de 50 ml contendo 10 ml de 4 ° C tampão dissecção. </li><li> Repetir o procedimento para o outro lado do abdómen e incubar os tecidos no buffer de dissecção durante 10 min. </li><li> Coloque o músculo abdominal contendo o mar em um (4 ° C) câmara de dissecção contendo tampão dissecção refrigerados (Figura 3B). A câmara de esvaziamento é constituído por uma placa de Petri com uma camada de Sylgard (polidimetilsiloxano [PDMS]) na parte inferior. </li><li> Usando os pinos de insetos (0,15 mm), esticar a SEA isolado e músculo abdominal para aproximar in vivo comprimentos (citadas acima) e fixá-lo ao Sylgard. Dica: Orientando o músculo de tal forma que a fina camada de frente para o peritônio está no topo faz com que a SEA facilmente visível através de transiluminação. </li><li> Utilizando instrumentos microdissection finas e trabalhando a partir do local a montante da ligação para oextremidade a jusante, limpar o mar de sua veia emparelhados eo tecido circundante até o primeiro site da filial de grande porte (1-2 cm). Então extirpar o SEA, cortando-um pouco acima do site da filial e, logo abaixo da ligadura. </li><li> Para remover o sangue retido dentro do lúmen do vaso, canular a SEA e lave-o com um tampão de gelo dissecção fria. Usando um pedaço de tubo de silastic, prenda a extremidade traseira de uma pipeta de punção de uma seringa de 5 ml contendo tampão dissecção gelada e garantir a micropipeta em um micromanipulador para posicionar a ponta dentro da câmara de dissecção para canulação da SEA. </li><li> Depois de todos os eritrócitos são lavadas para fora, retire o mar da pipeta de punção, e levante a pipeta para fora do prato dissecção. </li><li> Corte a SEA em segmentos menores cada 1-3 mm de comprimento. Estes segmentos mais curtos facilitar o isolamento de tubos endoteliais. </li></ol> 4. Isolamento do tubo endotelial <ol><li> Encha um cult 12 milímetros x 75 milímetros de vidrona metade do tubo ure com tampão dissecção gelada. Utilizando uma pinça em ângulo, transfira os pedaços arteriais dentro do tubo de cultura e colocar no gelo. Neste momento, combinar as enzimas de digestão com tampão de dissociação para um volume final de 1 ml de uma de 12 mm x 75 milímetros tubo de cultura em separado (ver 1.3.2 Soluções) e pré-aquecer a solução a 37 ° C com um bloco de aquecimento. </li><li> Enquanto o buffer de dissociação e enzimas estão se aquecendo, aspirar cuidadosamente o buffer de dissecção do tubo de cultura deixando um pequeno volume que contém os segmentos de navios. </li><li> Delicadamente adicionar tampão de dissociação temperatura ambiente sem enzimas para lavar tampão dissecção restante. Dica: Adicionar o tampão de dissociação lenta de modo a que as peças arteriais permanecer na parte inferior do tubo de cultura para conservar o tempo de espera para que a reinstalação. Elevar a temperatura tampão ao longo de vários passos a partir de gelo (4 ° C), a temperatura ambiente (~ 24 ° C), a 37 ° C para minimizar o choque. </li><li> Aspirar cuidadosamente o dissociation tampão do tubo de cultura, mais uma vez tendo a certeza de deixar um pequeno volume que contém os segmentos de navios. </li><li> Remover o tampão de dissociação com enzimas pré-aquecimento do bloco de aquecimento, transferir os 1 ml de solução de enzima com o tubo de cultura contendo os segmentos do vaso, e colocar o tubo de cultura de volta ao bloco de aquecimento. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Durante a incubação com enzimas, preparar a pipeta de trituração, aterramento com óleo mineral e fixá-lo em uma micro que é montado em um micromanipulador. Em seguida, retirar o êmbolo microseringa para encher a pipeta com 2 nl de tampão de dissociação e posicionar a ponta da pipeta sobre a câmara de fluxo. </li><li> No final da incubação de 30 minutos, retirar o tubo de cultura a partir do bloco de aquecimento e aspirar cuidadosamente o tampão como acima. </li><li> Lave os segmentos arteriais com 4 ml de tampão de dissociação à temperatura ambiente. Nota: Não é mais necessário manter o segm navioentos no fundo do tubo de cultura; perturbar as peças arteriais efectivamente ajuda a assegurar que as enzimas residuais são eficazmente removidos. </li><li> Transferência de um segmento de vaso para a câmara de fluxo por suavemente a aspiração com uma micropipeta 1 ml, e colocá-lo na câmara de fluxo de 1 ml do tampão de dissociação. </li><li> Utilizando o micromanipulador que contém o micro-seringa, posicionar a ponta da pipeta de trituração perto de uma extremidade do segmento do vaso. </li><li> Aspirar o segmento do vaso (500 nl retirado) para a pipeta de trituração lentamente (225 nl / seg), de modo a não causar tensão mecânica ao ECs, e, em seguida, o ejectar volta para dentro da câmara. Se a digestão foi bem sucedida, as células musculares lisas e adventícia será dissociado do tubo endotelial. </li><li> Repetir a trituração até todas as células de músculo liso são dissociados. Esteja ciente de que a trituração excessiva (4x ou mais) podem danificar o ECs e torná-los sem resposta aos agonistas. Dica:utilizando a pipeta de trituração, mover a adventícia de distância a partir do tubo endotelial tão rapidamente quanto possível para evitar que o tubo de enredamento. Nota: Utilizando a pipeta de trituração, o tubo endotelial isolado pode ser aspirado e transferido para um recipiente em separado. </li><li> Posicionar o tubo endotelial no centro da câmara de fluxo, alinhados ao longo da direcção de fluxo, e remover a pipeta trituração. </li><li> Pipetas aprisionamento seguros em micromanipuladores montado em ambas as extremidades da câmara de escoamento, e posicionar as suas pontas, nas respectivas extremidades do tubo endotelial. </li><li> Diminuir uma pipeta fixar sobre uma extremidade do tubo para pressioná-lo contra a parte inferior da câmara. Posicionar a segunda pipeta de pinagem, da mesma forma, na extremidade oposta do tubo. Observação: Colocação das pipetas aprisionamento é um trade-off entre fixar o tubo (colocando-os mais longe da extremidade do tubo) e permitindo uma maior imagem / área experimental (colocando-as mais perto da extremidade do tubo). Localizando tbainha ~ 50 mm a partir de cada extremidade do tubo funciona bem. Assim como a pipeta fixar toca o tubo, retirá-la lentamente, ao longo do eixo do tubo, alargando-o, assim, para aproximar in vivo comprimento e pressione a pipeta contra o fundo da câmara para fixar o tubo. </li><li> Começar o fluxo de solução de superfusão, e permitir que o tubo endotelial em repouso durante pelo menos 20 minutos para equilibrar e aderir (ver Figura 3C). Utilizar uma bomba peristáltica para manter constante o fluxo de fluido (superfusão) através do tubo endotelial. Nota: pipetas Pinning pode ser removido uma vez que o tubo endotelial tenha aderido ao fundo da câmara de fluxo (~ 25 min) ou deixado no local para garantir que o tubo endotelial não ser desalojada. </li></ol> 5. Dye Carregando e Imagem de cálcio <ol><li> Para visualizar as respostas intracelulares de cálcio, carregar o tubo endotelial com fluo-4 AM corante à temperatura ambiente (~ 24 ° C). Parar o fluxo de fluido no banho, e adicionar 4-fluoAM para a câmara a uma concentração final de 10 uM. Esperar 10 min para permitir que o corante de entrar nas células, então superfuse o tubo endotelial com PSS fresco durante 20 minutos para assegurar corante extracelular é removido e que o corante intracelular foi totalmente des-esterificada. </li><li> Realizar imagem de cálcio. Para este trabalho, um microscópio vertical (ver Figura 2) equipado com um sistema de imagem confocal de disco rotativo foi utilizado à temperatura ambiente. Excite o corante fluorescente de cálcio com um laser de 491 nm e aquisição de imagens (em 500-550 nm de emissão) usando uma câmera digital se intensificou. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

Aqui nós descrevemos o isolamento de tubos endoteliais do mar e da utilização desta preparação para visualizar Ca 2 + eventos de sinalização dentro de sua constitutiva ECs. Este processo foi adaptado a partir de um originalmente desenvolvido para isolar tubos endoteliais de arteríolas do músculo cremaster hamster 8. Utilizando pequenas variações das técnicas apresentadas aqui, nós isolamos tubos endoteliais de uma variedade de leitos vasculares, incluindo: artérias de alimentação do músculo retrator hamster e bochecha arteríolas bolsa 10, rato superiores artéria epigástrica 6,7,9, rato mesentérica e cerebral artérias e microvasos linfáticos (observações não publicadas; referências são incluídas para isolar os vasos mesentéricos 12 e vasos cerebrais 13). Isolar os tubos endoteliais dos novos leitos vasculares podem exigir modificações no protocolo original. Se o isolamento não for bem sucedida, é melhor começar por alterar tempos de digestão:Aumentar o tempo de digestão se tubos endoteliais são difíceis de isolar a partir de células musculares lisas e adventícia e reduzir o tempo de digestão, se o tubo endotelial não permanece intacta. Se alterar tempos de digestão não for bem sucedida, ajustando a concentração de enzimas de digestão ou a temperatura de digestão devem ser julgados. Uma outra opção é o de reduzir o diâmetro interno da pipeta trituração, o que aumenta a força de cisalhamento na remoção das células musculares lisas. Aumentando a velocidade de ejecção de fluido também pode ser tentado para o mesmo efeito, mas é mais provável para danificar a preparação. Deve reconhecer-se que pode não ser possível isolar tubos endoteliais intactas a partir de recipientes em que as células endoteliais não são assim ligados um ao outro por proteínas de junção. A dissociação das células musculares lisas após digestão enzimática foi realizada inicialmente usando uma pipeta de estilo mão 8. Nós refinamos o processo de trituração utilizando um microsyrsistema inge, o que permitiu o isolamento consistente de tubos endoteliais mais longos (até 3 mm) 6. Ao utilizar este sistema, a pipeta de trituração é preenchido com óleo mineral para proporcionar uma coluna de fluido contínuo entre o êmbolo de controlar o movimento de fluido e PSS contendo o segmento do vaso. A incompressibilidade do fluido, juntamente com a força motriz constante do pistão resulta em micro-seringa de cisalhamento constante, como o navio é forçado através da ponta da pipeta. Em contraste, técnicas manuais frequentemente utilizadas para as células de dissociação (por exemplo, apertando bolbo de borracha na extremidade de uma pipeta de Pasteur) envolve a compressão de ar, que introduz variabilidade na pressão de condução e, por conseguinte, de cisalhamento exercida na ponta da pipeta. Existem várias vantagens para a preparação de tubo para estudar a função endotelial em microvasos. A primeira é que o processo de isolamento fornece populações distintas homogêneos nativas celulares de ECs e mu suavecélulas LECSA. Desde o ECs permanecer conectado fisicamente como tubos, eles são distintos de células musculares lisas individuais, que retêm uma configuração &quot;C&quot; se eles permanecem relaxados durante a trituração. Assim respectivos tipos de células são facilmente distinguidos, por exemplo, quando a obtenção de amostras para técnicas moleculares, como a PCR em tempo real e imuno-histoquímica 10. Desde múltiplos tubos são isolados a partir de um único recipiente (ou a partir de navios bilaterais como feito para o SEA), dados moleculares e dados funcionais podem ser obtidos a partir dos mesmos vasos de um determinado animal. Assim, a expressão molecular pode estar correlacionado com o comportamento funcional do endotélio microvascular. Além disso, eventos, tanto intra e intercelulares sinalização intrínsecas ao endotélio microvascular pode ser resolvido independente da influência de forças hemodinâmicos (pressão, fluxo), agentes vasoativos transportados na corrente sanguínea (por exemplo, hormônios), ou de que cercam as células musculares lisas (eg60; via acoplamento mioendoteliais 14-16), os nervos 17, ou parênquima do tecido 18. Importante, uma vez que o endotélio é isolada de fresco a partir de microvasos designados, não há alteração de fenótipo que é de outro modo associado com a cultura CEs 19-21. Por exemplo, ECs cultivadas perder a expressão do receptor e, assim, alterar muscarinic seus perfis de sinalização de cálcio. Além disso, propriedades eletrofisiológicas de ECs pode mudar na cultura 22. Porque CEs individuais permanecem acoplados através dos canais de junções de hiato funcionais, o tubo endotelial apresenta um modelo ideal para estudar a condução de sinais eléctricos 2 + e Ca entre células 6,7. Também deve-se reconhecer que as células musculares lisas dissociados são facilmente estudado com técnicas de patch-clamp para dados complementares subjacentes função microvascular 23. Uma limitação fundamental para o tubo endotelial modelo é a instabilidade da preparação, com o aumento da temperatura. Enquanto as preparações do MAR provaram estável e saudável, à temperatura ambiente (~ 24 ° C) e durante várias horas a 32 ° C, a degradação morfológica e funcional ocorrer em menos de uma hora a 37 ° C 9. Uma segunda limitação importante do tubo endotelial é a perda de junções mioendoteliais e os seus domínios de sinalização inerentes que são essenciais para a função CE na parede do vaso intacto 14-16. Também deve-se reconhecer que, enquanto os tubos mais longos permitem sinalização intercelular a ser estudado ao longo relativamente grandes distâncias 6, a preparação de tubos é complicado, pois eles ficam mais longos, pois torna-se mais difícil dissociar completamente envolve as células musculares lisas e adventícia. Verificou-se que os tubos mais longos do que 1-2 mm são também mais difíceis de posicionar e fixar na câmara de fluxo. Em contraste, enquanto que os tubos mais curtos (por exemplo, &lt;1 mm) enaCa 2 + e sinais eléctricos ble a ser estudados 8, eles são difíceis de manter durante a superfusão na câmara de fluxo. Finalmente, mesmo com o isolamento de tubos bilateralmente óptima, não há material suficiente para a quantificação da expressão da proteína tradicional utilizando Western blot, embora imunomarcação fornece um índice da expressão da proteína e da localização. Apesar dessas limitações, o tubo endotelial representa uma nova preparação para proporcionar uma nova visão sobre os mecanismos da função endotelial microvascular in vivo.

Neste protocolo, descrevemos o isolamento de tubos de células endoteliais do mar mouse. A AAE surge da artéria torácica e suprimentos sangue oxigenado interno para a musculatura abdominal anterior. Nosso trabalho com o mar como um modelo pode ser atribuído a ele, proporcionando segmentos microvasos não ramificados relativamente longos que estão bem adaptados para o estudo de eventos de sinalização intracelulares subjacentes ao papel do endotélio em governar e coordenar o relaxamento das células musculares lisas. Para os interessados ​​em diferentes tecidos do músculo esquelético, descobrimos esta técnica para ser facilmente adaptado para a obtenção de tubos endoteliais de microvasos de cérebro, intestino e do sistema linfático. As principais características deste método são que extensões intactas (1-3 mm) de endotélio microvascular são isolados, garantidos contra uma lamela de vidro em uma câmara de fluxo em que são superfundidos com PSS, e fotografada por Ca 2 + sinalização 7-9 ouempalado por 6,8 sinalização elétrica. Dentro da câmara de escoamento, a metade superior de um tubo é exposto à solução de superfusão e responde à intervenção experimental, enquanto que a metade inferior (em contacto com a lamela) é protegida e permaneça em repouso. Além de estudar tanto de Ca 2 + os eventos de sinalização intra e intercelular, tubos endoteliais pode ser usado para quantitativa PCR em tempo real para avaliar a expressão do gene 6,10, imuno-histoquímica para investigar a expressão da proteína 6,10, e os estudos electrofisiológicos para definir as propriedades biofísicas de 6,11 a condução elétrica. Existem várias vantagens para a preparação tubo endotelial para o estudo da função endotelial. Em primeiro lugar é que o processo de isolamento proporciona uma distinção simples entre duas populações de células: células endoteliais (que permanecem na formação do tubo) e de células do músculo liso (dissociada individualmente; tipicamente &quot;C&quot; em forma quandorelaxado). Isto permite a amostragem seletiva e estudo das propriedades únicas subjacentes contribuição respectivas células para a função dos vasos. Em segundo lugar, este modelo permite a resolução de eventos de sinalização intrínseca para o endotélio, independentemente da influência do fluxo de sangue, no músculo liso, os nervos, e parênquima. Em terceiro lugar, o endotélio é estudada enquanto recentemente isolada, evitando assim alterações na expressão do gene ou a proteína associada à cultura de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

O controle do fluxo sanguíneo pela vascularização resistência regula o fornecimento de oxigênio e nutrientes concomitante com a remoção de subprodutos metabólicos, como exemplificado pelo exercício do músculo esquelético. Células endoteliais (ECs) alinhar a íntima de todos os vasos de resistência e têm um papel importante no controle de diâmetro (por exemplo, a vasodilatação dependente do endotélio) e, desse modo, a magnitude e distribuição do fluxo de sangue no tecido. A regulação da resistência vascular por ECs é efectuada por Ca 2 + intracelular de sinalização, o que leva à produção de autacóides difusíveis (por exemplo, óxido nítrico e os metabolitos do ácido araquidónico) 1-3 e hiperpolarização 4,5 que provocam relaxamento das células do músculo liso. Assim, a compreensão da dinâmica de endotelial Ca 2 + sinalização é um passo fundamental para a compreensão dos mecanismos que regem o controle de fluxo de sangue. Isolar os tubos endoteliais elimina variáveis ​​de confusão associados com blood no lúmen do vaso e com áreas células musculares lisas e nervos perivasculares, que de outra forma influenciam a estrutura e função da CE. Aqui apresentamos o isolamento de tubos endoteliais da artéria epigástrica superior (SEA), utilizando um protocolo otimizado para este vaso. Para isolar os tubos endoteliais de um rato anestesiado, o mar é ligado in situ para manter o sangue dentro do lúmen do vaso (para facilitar a visualização durante a dissecção), e toda a folha de músculo abdominal é extirpado. O mar é dissecado livre de que envolve as fibras musculares esqueléticas e do tecido conjuntivo, o sangue é liberado do lúmen, e digestão enzimática suave é realizada para permitir a remoção da adventícia, nervos e células musculares lisas utilizando trituração suave. Estas preparações recém-isoladas de endotélio intacto mantêm a sua morfologia nativa, com CEs indivíduo permanecendo funcionalmente acoplados um ao outro, capaz de transferir química e Si eléctricosgnals intercellularly através de junções 6,7. Além de oferecer uma nova visão sobre sinalização de cálcio e de membrana biofísica, estas preparações permitir estudos moleculares da expressão gênica e localização de proteínas dentro endotélio microvascular nativa.

As respostas de cálcio pode ser iniciada em tubos endoteliais isoladas de fresco utilizando a acetilcolina (ACh). Neste filme, um tubo endotelial carregado com 10 mM fluo-4 AM é estimulado com superfusão de 1 mM ACh (Filme 1). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . O corante é excitada a 491 nm e emissão é registada 500-550 nm utilizando uma câmara de dispositivo de carga acoplada intensificada. Pilhas de imagens são adquiridas em 120 frames / seg, por um período de 25 seg e pode, então, ser calculada a média (por exemplo, a 40 frames / seg.) Imagens de fluorescência representativos ao longo do tempo são mostrados na Figura 4. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Fluxo de câmara e pipetas utilizados durante o isolamento de tubos endoteliais. </strong&gt; A) da câmara de fluxo montado com um 24 milímetros x 50 mm lamela de vidro como base. B) Exemplos de um puxado (esquerda) e um puxado, quebrado, polida e angular (à direita) pipeta de punção. Esta pipeta é usado para lavar os eritrócitos a partir do lúmen da artéria a seguir a dissecção. Escala bar = 200 m. C) Exemplos de um puxado (esquerda) e um puxado, quebrado e polido (direita) pipeta trituração. O diâmetro interno da pipeta é determinada pelo diâmetro exterior da artéria. D) Exemplos Barra de escala = 200 m. De um puxado (esquerda) e uma pipeta de direita) fixando puxado, quebrado e polido (. A ponta de pipeta esta é arredondada e completamente selada para prender o tubo endotelial na câmara de fluxo. Escala bar = 200 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: manter-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Spinning disco microscópio confocal para imagens de Ca 2 + sinais. A) microscópio vertical usado para imagens de cálcio. B) (a) unidade de disco giratório confocal com um (b) intensificou carga câmera do dispositivo acoplado. C) objetivos Imersão (a) 63X ( NA = 1) e (b) 20X (NA = 0,5) utilizado para a geração de imagens. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. O isolamento do músculo abdominal e artéria epigástrica superior. Um </strong&gt;) Anestesiados rato com o músculo abdominal exposta e irrigados com solução salina temperatura ambiente 0,9%. As setas vermelhas marcam os sites em bolsas de gordura na qual respectivos SEAs entram cada músculo reto abdominal (ou seja, onde os vasos devem ser ligados). Escala bar = 1 cm. B) músculo abdominal isolada (unilateral) e SEA preso em câmara dissecção para microdissecção. A seta vermelha indica o primeiro local principal bifurcação da ASE (isto é, o ponto em que a limpeza do recipiente está parado). Escala bar = 1 cm. C) tubo de células endoteliais isolada de uma AAE. Imagem de contraste de interferência diferencial de um tubo endotelial após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. O tubo endotelial foi superfundidas com tampão de superfusão de 3 ml / min. Escala bar = 50 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Figura 4. Fluorescência de cálcio em um tubo de células endoteliais. Imagens fluorescentes representativos de um tubo endotelial em resposta a estimulação com 1 uM de acetilcolina. D) fluorescência antes da estimulação. B) fluorescência tubo endotelial no momento da administração de acetilcolina, t = 0 seg. C) da fluorescência do tubo endotelial em t = 5 segundos. D) do tubo endotelial de fluorescência a t = 10 seg. E) Fluorescência tubo endotelial em t = 15 seg. F) fluorescência tubo endotelial em t = 20 seg. Barras de escala = 40 m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K visualizações.  University of Missouri.  Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos. 

Vídeo: Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento de DNA genômico de Tails rato

Biologia

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolamento e cultura de células endoteliais aórticas primárias de suínos em miniatura

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...