Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.

כל הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה בעקבות הנחיות נדרשות ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי הוועדה השתמשתי, NIDCR / NIH. 1. להכין מראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת השלם: RPMI בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 יחידות / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל ו FBS 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת DNase: 50 מיליליטר של תקשורת RPMI השלים עם 7.5 מיקרוגרם DNase (הפוך טרי, לשמור על הקרח בכל עת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת Collagenase-DNase: 5 מ&quot;ל של התקשורת DNase בתוספת 3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של IV סוג Collagenase (הפוך טריים, לשמור על הקרח בכל עת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מגניב חיץ FACS: 0.5% FBS מדולל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות טרום מגניב עד 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה שייקר חם 37 ° C. </li></ol> בידוד 2., Dissection, ובידוד התא מפני חניכיים בלוקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי חשיפה אותם ל- CO 2 בתא מתאים, על פי הנחיות AraC. </li> &lt;li&gt; פתח את חלל בית החזה והבטן כדי לחשוף את הלב ואיברים פנימיים. כדי perfuse, עושים חתך את הווריד הנבוב נחות perfuse 3 מ&quot;ל של PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק 3 מ&quot;ל עם מחט 27 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את הגוף ואת הראש של עכבר על הכרית עם בטן כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל שליבה של השפה לכיוון הצוואר במספריים, הפרדת העור שמכסה באזור הלסת התחתונה והצוואר, חשיפת רקמות השרירים הבסיסית. לנתח את השפה התחתונה לחשוף את הלסת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך בין החותכות התחתונות להפריד משני צידי הלסת התחתונה ואת לשתק כל צד לגשת חלל הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו לנתח את החיך משם מחלל האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח אזורים באמצעות 10 להב וכוללים אזורי טוחנת בלסת העליונה mandibular עם הסובבים החניכיים (איור 1). ודא חתכים אנכיים רק קדמי טוחן ואת האחורי הראשונים הטוחן השלישי חתך אופקיהגבול של החניכיים (הצווארון הלבן של השיניים לרקמות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את לסתי וחוסם mandibular צינור חרוטי 50 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל Collagenase / DNase (לשמור על הקרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ובמהלך הדגירה 5 דקות של האחרון להוסיף 50 μl של 0.5 מ &#39;EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של התקשורת DNase קר אל הצינור 50 מ&quot;ל עם רקמות בעדינות מערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את 4 בלוקים של רקמות על צלחת פטרי ולכסות עם 500 μl של התקשורת DNase. סר חניכיימיים מכל גוש הרקמות, באמצעות סכין אזמל ומכוון את הלהב לתוך אזורי החניכיים ו-שיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמות ואת התקשורת מצלחת פטרי כמו גם בתקשורת DNase שהופעלה במהלך לנתיחה, לצינור חדש 50 מ&quot;ל דרך מסננת התא (70 מיקרומטר גודל). לשטוף עם התקשורת DNase (3-5 מ&quot;ל) כל המכשירים המשמשים ולסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר סטרילי, ומועך את הרקמה נגד המסננת,סינון עם התקשורת DNase קר (30 עד 35 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מסננת התא עם תקשורת DNase קרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 4 ° C, 314 XG במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות ב 1 מ&quot;ל של מדיה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים (סכום הצפוי צריך לנוע בין 8 x 10 5 כדי 1.2 x 10 6 תאים עם כדאיות של&gt; 80%) באמצעות דלפק תא אוטומטי. </li></ol> 3. גירוי ו FACS צביעת תאים חניכיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את ההשעיה תא בודד עם PMA (50 ng / ml) ו ionomycin (2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בנוכחות של 1 μl / מ&quot;ל ​​של Brefeldin א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה לשטוף עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס; 314 XG במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים באמצעות כתם כדאי בעקבות ההוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם על סמנים תאיים (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ או נמלהibodies בחירה) בעקבות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם חיץ צנטריפוגות קר FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבולת לשבש את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם paraformaldehyde 2% למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם חיץ FACS קר, צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות ו כתם ציטוקינים תאיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את צינורות FACS עם תמיסה של saponin 0.5% קר מדולל חיץ צנטריפוגות FACS ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl של פתרון saponin 0.5% אל צינורות FACS, דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס ואז צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם תאים עבור סמנים תאיים (IL-17A ו IFNγ או ציטוקינים בחירה) בעקבות הוראות יצרן. שוטפים את התאים עם פתרון צנטריפוגות saponin 0.5% ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו שוב עם FACSחיץ צנטריפוגות ב 4 ° C, 314 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את התאים 300 μl של חיץ FACS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתחו את התוצאות על cytometer הזרימה. </li></ol> 4. ניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו תאים להיות מנותח על קדימה (FSC) ולפזר בצד (SCC) ושער להוציא פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תאים בודדים עם שטח פיזור קדימה (FSC-A) לעומת פרמטרים גובים (FSC-H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שער תאים כי הם חיים (כפי שצוין על ידי מכתים כדאי) וחיוביים עבור + CD45 סמן hematopoietic לניתוח נוסף (איור 2 א ו 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניתוח של סמנים ספציפיים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3. </li></ol>

<ol>
	<li>Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+The+Normal+Bacterial+Flora+Of+The+Oral+Cavity.">Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).</li><li>Belkaid, Y., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+And+Systemic+Control+Of+Tissue+Immunity+By+Commensals.">Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals.</a> Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).</li><li>Darveau, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontitis:+A+Polymicrobial+Disruption+Of+Host+Homeostasis.">Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).</li><li>Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomicrobial+Pathogenesis+Of+Periodontitis:+Keystones,+Pathobionts,+And+Host+Response.">Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response.</a> Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).</li><li>Eke, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+Of+Periodontitis+In+Adults+In+The+United+States:+2009+And+2010.">Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010.</a> J Dent Res. 91, 914-920 (2012).</li><li>Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+Errors+In+Immunity:+Unique+Natural+Models+To+Dissect+Oral+Immunity.">Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity.</a> J Dent Res. , (2015).</li><li>Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enduring+Importance+Of+Animal+Modelsin+Understanding+Periodontal+Disease.">The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease.</a> Virulence. 6, 229-235 (2015).</li><li>Sharrow, S. O., Coligan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+Of+Flow+Cytometry+Data.">Analysis Of Flow Cytometry Data.</a> Current Protocols In Immunology. , (2001).</li><li>Arizon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+Cells+Down-Regulate+Inflammation-Driven+Alveolar+Bone+Loss.">Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).</li><li>Moutsopoulos, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Neutrophil+Recruitment+In+Leukocyte+Adhesion+Deficiency+Type+I+Disease+Causes+Local+IL-17-Driven+Inflammatory+Bone+Loss.">Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss.</a> Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).</li><li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-23-IL-17+Immune+Axis:+From+Mechanisms+To+Therapeutic+Testing.">The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing.</a> Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).</li></ol>

Authors have nothing to disclose

הטכניקה הנוכחית בהצלחה מניבה מספר רב של תאי מערכת חיסון (מתוך עכבר אחת) מתאים, לא רק לאפיון פנוטיפי, אלא גם עבור מחקרים פונקציונליים vivo לשעבר. קבוצה נוספת פרסמה בעבר פרוטוקול לבודד ולאפיין תאים בעכברי חניכיימיים חיסוניים והציגה את שווי השימוש ססגוני cytometry זרימה בחקר חניכיימיים במודלים של בעלי חי 9. בעקבות תקלות ניכר שינוי המפתח בפרוטוקול זה היה לכלול דיסקציה של בלוקים שלמים של רקמות על מנת לכלול בשני התחומים צווארון חניכיים ו החניכיים interdental (איור 1). עם דיסקציה חניכיים לבד, לעתים קרובות דשי בעובי מלא אינן מושגות וחלק החניכיים הוא החמיץ במיוחד בתחומים interdental. בגישה זו, מספר רב של תאי חיסון שנקטף עולים במידה הניכרת. טכניקה זו מאפשרת גם לבידוד מיטבי של רקמות החניכיים הן מתוך maxillaלסת תחתונה ד. צעדים קריטיים עבור פרוטוקול זה כוללים דיסקציה שמרנית תחומים חניכיים ושיעור יעיל של לנתיחה. באופן ספציפי, בלוקים של רקמה צריך להיות גזורים לכלול רקמות מינימאליות רק סביב שיניים (חניכיימיים) ורקמות buccal לא. בלוקים צריכים להיות גזורים במהירות רקמות ותאים צריכות להישאר על קרח כדי להבטיח כדאיויות תא אופטימליות. לצורך פתרון בעיות חשוב לציין כי התשואה הנמוכה של תאים יכול להיות קשור זמן לקוי של הדגירה עם collagenase, ריכוזי הולם של collagenase ו / או דיסקציה לקוי של החניכיים מהבלוקים רקמות. ובנימה זו, דיסקציה של כירורגיים מגדלת באמצעות חניכיימיים (2X-6X) יכולה להיות מועילה. כדאיות נמוכה של תא יכולה להיות קשור איחור בהליך וכדי תקשורת, מאגרים ותאיים לא הנותרים ברציפות על קרח. מגבלות של פרוטוקול זה, הטמון לסוג דיס רקמותsected הוא בגודל של רקמות חניכיימיים, בהשוואה לאתרים מחסום אנטומיים אחרים שנבדקה (לשעבר. עור או מערכת עיכול) שבו רקמות גדולות זמינות. עם זאת, טכניקה מוצגת כאן אפשר לנו לאפיין את אוכלוסיות תאים הדומיננטיים LFA - / - מודל אשר ספונטני שפותח חניכיימיים. ב LFA - / - עכברים זיהו חתימה ציטוקינים דומיננטית IL-17 במהלך פיתוח של פריודונטיטיס 10. באמצעות ניתוח תזרים cytometric הססגוני הצלחנו להגדיר את המקורות הסלולר של IL-17 11. במחלה זו הגדרת IL-17 הופק על ידי תאי T TCRγδ, תאי CD4 + T ותאי הלימפה מולד (ILC) מקומי בתוך החניכיים 10. עם מספר לא מבוטל של תאים מבודדים עם מתודולוגיה זו ואת היכולת לזהות אפילו תת-אוכלוסיות קטנות, זה עכשיו יהיה אפשרי לפתח מקיפה להביןing של רשת תא חיסון המיוחדת לשמירה שלמות מחסום חניכיימיים. ההבחנה חשובה הזאת תאפשר לנו להעריך תגובה חיסונית בסביבת החניכיים. על ידי העסקה בשיטה זו אנו מסוגלים כעת להמשיך לבודד מרכיבים ספציפיים של רשת תא החניכיים חיסוניות על ידי מיון תא התזרים cytometric, המאפשר ניתוחים נוספים ומאפיינים להתבצע.

רקמות חניכיימיים המקיפות את האדם השיניים בעכברים ונחשפות כל זמן אל ביופילם המורכב של שן 1. רשת תא חיסון שיטור מכשול החניכיים היא חיונית לשמירה על שלמות רקמות, הבטחת הומאוסטזיס עם חיידקי commensal מקומיים, בעת ובעונה אחת, מתן חסינות יעיל נגד אתגר פתוגניים 2. כדי להשיג הומאוסטזיס, מערכת החיסונית מותאם בקפידה לסביבת חניכיימיים יצירת רשת תא חיסון בעלי התמחות גבוהה, עדיין קצת בפירוט ידוע של אוכלוסיות תאי חיסון חניכיימיים ותפקידם בשמירת רקמה חסינה 2. כאשר הומאוסטזיס חיסוני מופר על החניכיים, בין אם באמצעות רגישות מארחת מוגברת ו / או נוכחות של קהילות מיקרוביאלי dysbiotic, מצב דלקתי, חניכיימיים עולות 3 4. חניכיים היא מחלה דלקתית נפוצה, שמוביל לאובדן השן sמבני upporting. במקרים חמורים שלה הוא נתפס בתוך כ -10% מכלל אוכלוסיית 5. הביתור הגורמים המרכזיים המעורבים הרגישות חניכיים והתקדמות הוכיחה קשה 6. עם זאת, במודלים של בעלי החיים היו מאוד שימושיים בהבנת מנגנוני חניכת חניכיימיים והתקדמות 7. מודלים יכולים להיות מועסקים על מנת להגדיר את אוכלוסיות תאי מפתח ומתווכים מולקולריים כי הם חיוניים לשמירה על הומאוסטזיס חיסון ופיתוח כונן של מיסב שן. תובנה כזו תהפוך הבנתנו שליטת חניכיימיים הספציפיות של הומאוסטזיס חיסונית לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של בהיווצרות מחלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fine Scissors</td>
			<td style="width:188px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:188px;">14058-11</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td style="width:188px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:188px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Scalpel Blades #10</td>
			<td style="width:188px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:188px;">10010-00</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Splinter Forceps</td>
			<td style="width:188px;">Integra Miltex</td>
			<td style="width:188px;">6-304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Needles with regular bevel&#160;</td>
			<td style="width:188px;">BD Medical</td>
			<td style="width:188px;">305109</td>
			<td>27G, 12.7 mm length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Monoject syringes</td>
			<td style="width:188px;">Covidien</td>
			<td style="width:188px;">8881513934</td>
			<td>Luer-lock tip, 3mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:188px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:188px;">10010-049</td>
			<td>Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:188px;">Lonza</td>
			<td style="width:188px;">12-167F</td>
			<td>Without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DNase I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Collagenase type IV</td>
			<td style="width:188px;">Gibco (by Life technologies)</td>
			<td style="width:188px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:188px;">Gemini Bio-products</td>
			<td style="width:188px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin 50 mg/ml</td>
			<td style="width:188px;">Quality biological</td>
			<td style="width:188px;">120-098-661EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:188px;">Gibco (by Life technologies)</td>
			<td style="width:188px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:304px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:188px;">Gibco (by Life technologies)</td>
			<td style="width:188px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA pH 8.0</td>
			<td style="width:188px;">Quality biological</td>
			<td style="width:188px;">351-027-721EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">352070</td>
			<td>Polypropylene, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">70 &#956;M Cell Strainers</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">351029</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">5 mL FACS tubes</td>
			<td style="width:188px;">Corning</td>
			<td style="width:188px;">352052</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD GolgiPlug</td>
			<td style="width:188px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:188px;">555029</td>
			<td>Contains brefeldin A solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ionomycin Calcium Salt</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">13909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Saponin from quillaja bark</td>
			<td style="width:188px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:188px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:188px;">Life Technologies</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">56-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD4 eFluor 450</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">48-0042-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">47-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse gamma delta TCR FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-5711-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse IL-17A APC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">12-7311-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse IFN-&#947; PE</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">25-5941-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">47-0902-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD3e FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD19 FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0193-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD11b FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse CD11c FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-0114-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse TCR beta FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse Ly-6G FITC</td>
			<td style="width:188px;">eBioscience</td>
			<td style="width:188px;">11-5931-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Anti-Mouse Ly-6C FITC</td>
			<td style="width:188px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:188px;">553104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and functional examination of the gingival immune cell network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

כדי להמחיש יישום של פרוטוקול, אנו מציגים תוצאות נציג לבחינת הרשת התא החיסונית החניכיים של עכברים עם ובלי חניכיים (WT לעומת LFA - / -, איור 2 א - ג). מגרשי FACS נציג להראות תאי CD45 + hematopoietic חי החניכיים (איור 2 א, 2 ג). בידוד ועיבוד של תאי מערכת החיסון עם פרוטוקול זה מניב מספיק תאים כדי לבצע vivo לשעבר גירוי ואפיון דפוסי הפרשת ציטוקינים. כאן אנו מראים IL-17 ו מכתים IFN-γ בתאים הכולל CD45 + במדינה יציבה (WT) ובעכברים מפגין חניכיים (עקב מחסור LFA) (איור 2 ב - D). נתונים אלו חושפים את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי ללכוד פרופילים ציטוקינים במהלך מצב יציב רקמות (WT) והן בהקשר של פריודונטיטיס המקומי (LFA - / -). מיקרופוןהדואר רגיש חניכיימיים נוסיף שאפיין את רכב תא חיסון החניכיים במיוחד של תאי T ותא הלימפה מולדת (ILC) תאים (איור 3 א - ב). הצלחנו להגדיר את הייצור של IL-17 ו- IFN-γ בתוך תא TCRβ + CD4 + T, תאי TCRβ + CD8 + T, תאי TCRγδ + T, NK ותאי ILC (איור 3 ג). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53736/53736fig1.jpg" /> איור 1:. בידוד של החניכיים murine איור הממחיש את הדיירים של דיסקציה של maxilla ומגזר חניכיים מבודד לשמש לנתיחה רקמת החניכיים. מגזרי (B) של maxilla בעכברים (באזור הטוחן) עם מתווה לנתיחה לחסום ולחסום מבודדים. Hematoxylin ו כתם Eosin (H &amp; E) של קטע טוחנת לסתי עם החניכיים<html> רקמות l התוו מוצג הנמוך (C) גדלה גבוהה (ד &#39;). בהגדלה מקורית מצוינת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53736/53736fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53736/53736fig2.jpg" /> איור 2: נציג נתונים FACS עבור ייצור ציטוקינים מתאי חניכיים. (A - C) FACS עלילה מראה שער תאי CD45 + חיו בהכנות תא עכבר חניכיימיים הבאות vivo לשעבר מחדש גירוי עם PMA ו ionomycin ב WT ו LFA - / -. (B - D) מגרשים נציג FACS מראה IFN-γ ו- IL-17 מכתים עכבר הכולל CD45 + תאים החניכיים של עכברים עם / בלי חניכיים (בשל LFA-חסר).Iles / ftp_upload / 53,736 / 53736fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53736/53736fig3.jpg" /> איור 3:. ייצור ציטוקינים על ידי אוכלוסיות חיסוניות חניכיימיים מודלקות (א) עלילת הנציג FACS מציג מכתים עבור TCRβ לעומת TCRγδ מגודר על תאי CD45 +. Gating על TCRβ + תאים, העלילה באמצע תערוכות CD4 לעומת מכתים TCRβ (מאפשר ניתוח של תאים TCRβ + CD4 + T, תאים TCRβ + CD8 + T ו TCRγδ + T תאים). Gating על TCRβ - TCRγδ - תאים, העלילה ימין מראה CD45 לעומת מכתים NK1.1 (מאפשר ניתוח של תאי NK). (ב) עלילת הנציג FACS מציג מכתים עבור CD90.2 מגודרת על תאים שליליים CD45 + שושלת (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -) אשר מזהה תאים הלימפה מולד. (ג) מגרשים נציג FACS מראה IFN-γ ו- IL-17 מכתים אוכלוסיות תאים המזוהים. ההכנות החניכיים הם בין 20 בן שבוע LFA - / - עכברים המתפתחים חניכיים; נתונים מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53736/53736fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network at JoVE.com

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

isolation-characterization-functional-examination-gingival-immune

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.7K Views.  NIH.  הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים. 

Video: Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.