מע&quot;צ נתמכת על ידי מכון קנדי ​​לבריאות מחקר מלגה (CIHR) ומענק CIHR לג&#39;רלד קידר באוניברסיטה מערבית. המחבר גם רוצה להכיר Julang לי באוניברסיטת Guelph לעזרה בפיתוח של הפרוטוקול המובא כאן.

1. מדיה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת 2-3 שעות מראש של שימוש ומקום עם כובע משוחרר בתא שבו תרבות חממת הניסוי יהיה מתרחש. מדיה בשימוש בפרוטוקול הנוכחי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נובע מדיום סלולרי בהיקף של DMEM/F12 בתוספת 1 X B27, 40 ng / ml bFGF, ו20 ng / ml EGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום התמיינות תאים נבט בהיקף של M199 בתוספת FSH 0.05 IU, 0.03 IU LH, 3 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, 5, פירובט הנתרן 0.23 מ&quot;מ μl / מ&quot;ל, 1 מ&quot;ג / מיליליטר Fetuin, וng 1 / מיליליטר EGF. מדיום בסיס המורכב של כל התוספים אבל השמטת FSH, LH יכול להיות מוכן וEGF ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol></li></ol> 2. גזע הכנת תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי גזע מגורי עכבר יילוד כפי שתואר לעיל 12. לנצל את תאי גזע בחלוף 2-4 בהתמיינות תאי נבט מבחנה. היעילות שלהיווצרות של נקודתי טיסה קשורה באופן ישיר לאיכות של תאי הגזע מתחילים. עדיף להתחיל את הבידול בהקדם האוכלוסייה נראית נקי ובריא שהוא בדרך כלל בסביבות מעבר 2. culturing עוד 2 מעבר העבר בתאי גזע משפיע לרעה על יעילות היווצרות של נקודתי הטיסה (תוצאות לא פורסמו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לפני ייזום בידול תת תרבות תאי הגזע. הסר את כל המצרפים המושעים כדוריים הסלולריים והתקשורת בילתה ממנת התרבות, באמצעות פיפטה סרולוגיות ומניחה בשפופרת 15 מ&quot;ל. חשוב לאסוף רק המצרפים המושעים כדוריים של תאים ולא התאים המחוברים לתחתית הצלחת, כי הם באופן ספונטני מבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות., לבטל את supernatant, resuspend ב 500 μl של תקשורת תאי גזע טרי חימם עד 37 ° C. בעדינות פיפטה המצרפים לניתק באופן חלקי את התאים. לא באגרסיביות אל פיפטה תאים כמו זה יפחית כדאיות תא. לשטוף את התאים באופן חלקי ניתק לתוך 9.5 מ&quot;ל של מדיום תאי גזע מראש חימם טרי על צלחת נמוכה מצורף 10 ס&quot;מ תא תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את התאים ל37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתרבית תאים באינקובטור במשך 48 שעות לפני תחילתו של הבידול. </li></ol> 3. בידול של נקודתי טיסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגיות להסיר את תאי גזע ממנת התרבות והמקום בצינור 15 מ&quot;ל, להשאיר מאחור את כל תאים מחוברים אליו. גלולה התאים ב XG 500 ו resuspend ב 500 PBS סטרילי μl. פיפטה הנמרצת את התאים באמצעות רחב נשאו 1,000 קצה μl לתוך גושים לא גדולים יותר מ 10-20 תאים. מעת לעת להסיר כמות קטנה של תאים, בעת הניתוק, ולבדוק תחת מיקרוסקופ אור לבן כדי לאשר תאים מצטברים בגושים של 10-20 תאים בודדים. על ניתוק יגרום לכדאיויות תא מופחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9.5 מ&quot;ל PBS לתאים ניתק ולהוסיף 15 μl של השעיה תא זה לhemocytometer לספירת תאים. גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התאים בריכוז של 6 1.32X10 תאים / מ&quot;ל במדיום התמיינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים על ידי הוספת 500 μl לכל גם לתחתית שטוחה 24 מנה השעיה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 24 גם לתוך תא תרבות חממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 48 שעות. הסר 250 בינוניות μl מכל טוב ומקום בצינור שכותרתו 1.5 מ&quot;ל בהתאמה. הוסף 250 בינוני בידול טרי μl היטב כל אחד. צנטריפוגה את המדיום בילה בXG 500 במשך 5 דקות. וזורקים supernatant. Resuspend כל תאי pelleted ב50 בינוני בידול טרי μl ולחזור לתרבות המקבילה גם על צלחת הבידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל 48 שעות לשנות את המחצית בינונית עד 12 יום של בידול. </li></ol>

<ol>
	<li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth,+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles.">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li><li>Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+living+mouse+germ+cell+migration.">Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration.</a> Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).</li><li>Lawson, K. A., Hage, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+origin+of+primordial+germ+cells+in+the+mouse.">Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse.</a> Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).</li><li>Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cells+in+the+mouse+embryo+during+gastrulation.">Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation.</a> Development. 110, 521-528 (1990).</li><li>Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+oocytes+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells.</a> Science. 300, 1251-1256 (2003).</li><li>Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+can+form+germ+cells+in+vitro.">Embryonic stem cells can form germ cells in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).</li><li>Wang, L., Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-like+Cells+Induced+from+Mouse+Spermatogonial+Stem+Cells.">Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells.</a> Cell Biosci. 2, 27 (2012).</li><li>Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+germline+potential+of+stem+cells+derived+from+fetal+porcine+skin.">In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin.</a> Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).</li><li>Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+oocyte-like+cells+from+a+clonal+pancreatic+stem+cell+line.">Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line.</a> Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).</li><li>Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP15+gene+is+activated+during+human+amniotic+fluid+stem+cell+differentiation+into+oocyte-like+cells.">BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells.</a> DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).</li><li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+porcine+multipotent+stem/stromal+cells+derived+from+skin,+adipose,+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells.">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li><li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin.">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339 (2011).</li><li>Linher, K., Dyce, P., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primordial+germ+cell-like+cells+differentiated+in+vitro+from+skin-derived+stem+cells.">Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells.</a> PLoS One. 4, e8263 (2009).</li><li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice.">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עד כה OLCs הפונקציונלי לא פותחו באמצעות לחלוטין בassay חוץ גופית. לאחרונה מחקר על ידי הייאשי et al. היה מסוגל לייצר צאצאים מדמויים PGC תאים שנוצרו במבחנה והועברו in vivo להמשך פיתוח 14. החל עם תאי גזע עובריים או תאי pluripotent מושרה הם הצליחו ליצור תאים PGC כמו אשר, כאשר התאוששו בעקבות in vivo ההשתלה היו מסוגלים להיות התבגר, מופרה, ומשמש ליצירת צאצאים 14. זה מוכיח כי תאי גזע ממקורות שונים שיש לו את הפוטנציאל, בתנאים הנכונים, כדי ליצור ביציות תפקודיות. היבטים מסוימים של מערכת התרבות הנן קריטיים לתפקודו. הזן של עכברים מנוצלים כדי לבודד את תאי הגזע הוא מאוד חשוב. פרוטוקול זה פותח ושימוש עם עכברי B6 מהמעבדה ג&#39;קסון (צילומים # 008,214). עכברים אלה נושאים transgene Oct4-EGFP מאפשר מולualization של תאים לבטא Oct4 באמצעות חלבון EGFP. כאשר הפרוטוקול היה ניסיון בשימוש בתאי גזע מעכברי CD1 היעילות הייתה נמוכה בהרבה וההיווצרות של נקודתי הטיסה הייתה פחות אמינה. נכון לעכשיו את היעילות של היווצרות של נקודתי טיסה נשארת נמוכה גם בעת שימוש B6 עכברים. תאי הגזע צריכים להיות מנוצלים בחלוף 2-4 לפני התמיינות תאי נבט ייזום כיעילות של היווצרות תאי נבט היא נמוכה בהרבה, כאשר שימוש בתאי מעבר מאוחרים יותר. המקור של חומרים כימיים שונים גם הוכיח את עצמו חשוב. הניתוח של תעתיקי mRNA שונים בOLCs עשוי להיות שימושי באופטימיזציה של מערכת התרבות. באמצעות PCR חצי כמותית מאפשר השוואה של מספר רמות ביטוי בין סמני OLCs וביציות (איור 2). התוצאות מראות כי את OLCs להביע פחות Zpc מביציות, מה שעשוי להסביר את האופי השברירי וקרום דק של pellucida Zona OLCs. הביטוי של סמן מיוזה <eמ &#39;&gt; Scp3 הוא גבוה יותר בOLCs בהשוואה לביציות טבעיות זאת CMOS הוא באות לידי ביטוי ברמה נמוכה יותר (איור 2). אי התאמה זו ברמות הביטוי באופן חלקי עשויה להסביר את הכישלון הנוכחי של OLCs כדי להשלים מיוזה. סמנים אחרים כגון Bmp15 וושה הם לא שונים באופן משמעותי בין OLCs וביציות. הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטת שליטה במבחנה ללמוד היווצרות תאי נבט ובידול. נכון לעכשיו התאים דמויי PGC שנוצרו אינם יכולים ליצור OLCs הפונקציונלי כאשר נשמר במבחנה. כאשר מצטברים בתאים הסומטיים בשחלות יילוד ולהשתיל את תאי in vivo כמו PGC מסוגלים ליצור זקיקים משניים בשלבים מוקדמים. עם זאת, כאשר הם התאוששו OLCs הם עדיין מצליח להיות אמין והתבגרו מופרה 12. השירות בassay זה מגיע מלימוד תאי הנבט מראש meiotic מקורם בתאי גזע הסומטיים.

במהלך העובר בשלב מוקדם, gametogenesis מתרחש דרך סדרה של שלבים, כולל תא חיידק קדמוני (PGC) היווצרות, הגירה, ולבסוף קולוניזציה של רכסי האשכים. במהלך תקופה זו עובר PGCs ריבוי והתמיינות לתאי מין יותר ויותר בוגרים יותר 1. העובדה שPGCs נודד מהבסיס של allantois לעובר במעי האחורי ולבסוף לאורך הקיר הגבי סופו של דבר ליישב את רכסי האשכים הופכת אותם קשה מאוד ללמוד 2. למרות התקדמות בתחום, מחקרים המנסים להבין את היווצרות והתמיינות PGC כבר הקשו על ידי המספר המוגבל שלהם, מיקום ואופי נדידת 3,4. בשנים האחרונות הוכחו בתאי גזע עובריים יש פוטנציאל ליצירת תאי הנבט במבחנה 5,6. כמו כן, כמה תאי גזע הסומטיים יש גם הוכחו כבעלי הפוטנציאל ליצירת תאי הנבט Follבשל בגידול חוץ 7-11. לאחרונה תאי גזע שבודדו מעור עכבר יילוד היו מובחן במבחנה לתאים דמויי חיידק וביציות בשלבים מוקדמים 12. במהלך בידול תת הקבוצה של תאי הגזע המבטאים Oct4 גדלה ומתחמים המזכירים מבני קומולוס-ביצית נוצרו. הביצית דמויות התאים (OLCs) ניתן לאסוף מהתרבויות ובהשוואה לביציות טבעיות. שימוש בשיטה זו התרבות OLCs מדידת 40-45 מיקרומטר מתקבלים כי סמנים דומים מפורשים לביציות כגון Gdf9b, ושה, וDAZL. עד כה את OLCs התוצאה יישאר מסוגל להתבגר או להיות מופרה 12. למרות OLCs יישאר מסוגל לתפקד פרוטוקול המשמש ליצירת OLCs אלה ייתכן שעדיין יש שירות כassay ללמוד היווצרות וההתפתחות של תאי הנבט בשלבים מוקדמים יותר בתוך מערכת סגורה במבחנה. הפרסום המקורי שדן בהיווצרות של OLCs מכךתאי גזע matic מנוצלים עור עוברי חזירי כמקור תאי גזע 8. הרחבת על מחקר שהתאים דמויי PGC נוצרו מוקדם במהלך התמיינות מושרה הוצגו להיות מבשרי לסמנים כאלה PGC מפורש OLCs וכOct4, ושה, סטלה, C-KIT, וDAZL 13. נתונים אלו תומך בפוטנציאל של ניצול מערכת זו כדי ללמוד היווצרות חיידק והתמיינות של תאים במבחנה. הפרוטוקול מנוצל כדי ליצור OLCs מעור עכבר יילוד יהיה הפגין במאמר זה וידאו. פרוטוקול זה מציע במודל חוץ גופית ללמוד פיתוח תא חיידק שעשוי לספק אמצעי על מנת להבהיר גורמים חשובים להתפשטות וההתמיינות שלהם.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400-045</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetuin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3385</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sioux Biochemicals</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LH</td>
			<td>Sioux Biochemicals</td>
			<td>925</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>144530</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352095</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

differentiation of newborn mouse skin derived stem cells into germ-like cells in vitro

לומד היווצרות תאי נבט ובידול באופן מסורתי היה קשה מאוד עקב מספרים סלולריים נמוכים ומיקומם העמוק בתוך עוברים מתפתחים. הזמינות של &quot;סגור&quot; במערכת מבוססת מבחנה יכולה להוכיח לא יסולא בפז להבנה של gametogenesis שלנו. היווצרות של ביצית דמויות תאים (OLCs) מתאי גזע סומטיים, שבודדו מעור עכבר יילוד, הודגמה ויכולה להיות דמיינו בפרוטוקול בסרטון זה. את OLCs כתוצאה להביע סמנים שונים בקנה אחד עם ביציות כגון Oct4, ושה, Bmp15, וScp3. עם זאת, הם נשארים מסוגלים לעבור התבגרות או הפריה בשל אי השלמת המיוזה. פרוטוקול זה יספק מערכת שהיא שימושית לחקר היווצרות השלב מוקדם והתמיינות של תאי הנבט לתוך תאי מין בוגרים יותר. במהלך ההתמיינות מוקדמת במספר התאים המבטאים Oct4 (כמו תאי חיידק פוטנציאליים) מגיע ל ~ 5%, עם זאת בשלב זה Formation של OLCs נותר בלתי יעיל יחסית. הפרוטוקול הוא יחסית ישר קדימה אם כי יש לנקוט זהירות מיוחדת על מנת להבטיח את אוכלוסיית התאים בריאה ומתחיל במעבר מוקדם.

בתחילה את התאים לצרף לתחתית צלחת התרבות ונפרשו. ב42-72 שעות להתמיינות תאי Oct4 חיוביים קטנים מושעים להיוצר ולהתרבות (איור 1 א). זמן קצר לאחר ההדמיה של תאים אלה הרוב ייעלם והתאים המצורפים יהוו אגרגטים מושבה צפופים בתחתית התרבות. בעקבות כמה ימי אגרגטים אלה להתנתק ממשטח התרבות. בחלק מאגרגטים אלה ניתן לראות תאים גדולים (איור 1b ו1 ג&#39;). על ההדמיה ראשונית התאים יהיו ~ 35 מיקרומטר בקוטר. עם תרבות המשך את OLCs יגדל להגיע ~ 45 מיקרומטר בקוטר. אלה הם OLCs ויכולים להיות שנאספו עם תאי תמיכה או trypsinized להשיג OLCs ללא תאים אחרים מצורפים (1D איור). על מנת לאשר כי OLCs להביע תמלילים דומים כביציות טבעיות ניתן לאסוף את OLCs ונבדק עלביטוי של סמנים כגון Zpc, Scp3, CMOS, Oct4, Bmp15, ושה. בעוד שה Oct4 ובאים לידי ביטוי בתאי גזע התמיינות כמה סמנים כגון Bmp15 וZpc הם ביצית ספציפיות. BMP15 הוא חבר של משפחת TGF-β, והוא מעורב בביצית והתפתחות זקיקים. מבנה קרום pellucida הביצית הספציפי Zona מורכב מכמה חלבונים, כולל ZP3. הביטוי של סמנים ספציפי ביצית אלה ניתן להשתמש כדי לאשר את קיומו של OLCs בבידול. יתר על כן, הביטוי של סמני meiotic ספציפיים כגון Scp3 ו-CMOS יכול לזהות תאים שעלולים להיות meiotic בתוך מערכת התרבות. בדוגמא שספקה 10 ו -10 ביציות OLCs נאספו וסינתזת cDNA ישירה בוצעה (איור 2). הדגימות נובעות לאחר מכן נבדקו באמצעות PCR חצי כמותית. השוואה בין הביטוי של סמנים אלה לביציות עכבר טבעיות שאנו רואיםהבדלים ברמות של תמלילים (איור 2). סמנים רבים שהביעו ביציות יבואו לידי ביטוי על ידי OLCs אם הבידול היה מוצלח. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50486/50486fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50486/50486fig1.jpg" /> איור 1. מורפולוגיות שכיחות במהלך התמיינות מושרה של תאי גזע שמקורם בעור. א) בתאי התמיינות בשלבים מוקדמים חיוביים לOct4 (ירוק) יכול להיות מזוהה בתרבות. Nucleuses הם מוכתמים דלפק עם Hoechst (כחול). ב) עם התקדמות בידול מסוימים אגרגטים תא יהיה לראות עם Oct4 (ירוק) תאים חיוביים מוקפים Oct4 תאים שליליים. מכתים גרעיני עם Hoechst גם מתואר (כחול). ג) תמונת אור לבנה של מבנה דמוי זקיק לאחר ניתוק ממשטח התרבות. ד) במהלך הבדלניתן לראות גם מוקפים בתאים או ביחידות בתוך התרבות Oct4 תאים חיוביים גדולים erentiation (ירוק) כמו ביצית. סולם ברים: א = 20 מיקרומטר, B = 100 מיקרומטר, C = 40 מיקרומטר, ד = 10 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50486/50486fig2.jpg" /> איור 2. רמת תעתיק בOLCs, בהשוואה לביציות, ביצית של סמנים נפוצים. תוצאות בזמן אמת PCR נציג המראות את רמת התעתיק של סמני ביצית נפוצות בOLCs. השוואה זו היא כתוצאה מ10 דמויי תאי ביצית שלעומת 10 ביציות עכבר זה עתה נולדו.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro at JoVE.com

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

9.2K Views.  The University of Western Ontario. בשנים האחרונות להיווצרות של תאי הנבט המשתמשים בשיטות תרבות במבחנה הודגמה תוך שימוש בסוגים שונים של תאי גזע סומטיים. מאמר זה יציג חזותי התמיינות של תאי גזע שמקורם יילוד עכבר לתאים דמויי ביצית מוקדמות.

Video: Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the behavior of cells in a standardized in vivo environment. The main advantages of the chicken embryo include low cost, high accessibility, ease of surgical manipulation and lack of a fully developed immune system. Xenotransplantation into chicken embryos can provide valuable information about cell proliferation, differentiation and behavior, the responses of cells to signals in defined embryonic tissue niches, and tumorigenic potential. Transplanting cells into chicken embryos can also be a step towards transplantation experiments in other animal models. Recently the chicken embryo has been used to evaluate the neurogenic potential of human stem and progenitor cells following implantation into neural anlage1-6. In this video we document the entire procedure for transplanting human stem cells into the developing central nervous system of the chicken embryo. The procedure starts with incubation of fertilized eggs until embryos of the desired age have developed. The eggshell is then opened, and the embryo contrasted by injecting dye between the embryo and the yolk. Small lesions are made in the neural tube using microsurgery, creating a regenerative site for cell deposition that promotes subsequent integration into the host tissue. We demonstrate injections of human stem cells into such lesions made in the part of the neural tube that forms the hindbrain and the spinal cord, and into the lumen of the part of the neural tube that forms the brain. Systemic injections into extraembryonic veins and arteries are also demonstrated as an alternative way to deliver cells to vascularized tissues including the central nervous system. Finally we show how to remove the embryo from the egg after several days of further development and how to dissect the spinal cord free for subsequent physiological, histological or biochemical analyses.

In this paper we present a method for transplanting human stem cells into various regions of the central nervous system of the chicken embryo. This provides an in vivo model for assessing the proliferation and differentiation of various types of human stem cells in embryonic tissue environments.

Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video