המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר אליסטר Garratt (מקס Delbrück מרכז ברלין) על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מחקר שיתופי (SFB665) של מועצת המחקר הגרמנית (DFG).

1. Dissection ההליך הערה: שימוש ניסיוני של עכברים צריך לעקוב אושרה רשמית הנחיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההכנה, להגדיר מיקרוסקופ לנתח שלך לפרוס את מכשירי ניתוח הדרוש לנתיחה כולל מספריים גדולים וקטנים, מלקחיים שיניים גדולות, מלקחיים מעוקל ארבעה סטים של דומון No.5 לנתח מלקחיים (שתיים מהן בתוך מלוטשת טיפים) ( לפרטים ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד). מניחים פיסת נייר מסנן צלחת 100 מ&quot;מ פטרי Sylgard מצופה. יוצקים קר PBS בבארות של צלחת 12 באר, צלחת פטרי 100 מ&quot;מ ו - צינור 12 מ&quot;ל ולהשאיר על הקרח. פיפטה 2ml של חיץ קיבעון (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.4) היטב כל צלחת 12 גם המקום השני על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה, להקריב את הסכר בהריון בעיתוי ב E12.5 (זיהוי של תוסף הנרתיק יועד E0.5), במקום את העכברעם למעלה בצד הגחון שלו על שלושה גיליונות של מגבות נייר להשרות את אזור הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל abdominopelvic, לבודד את קרני הרחם דו צדדי ולהעביר אותם לתוך אחד 100 מ&quot;מ עם מאכלים קרים כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בקרה מיקרוסקופית, לעשות חתך אורכי דופן הרחם עם, מספריים קטנים ישר לחתוך כל שק השפיר של השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלף את שק השפיר של העובר כל לחתוך את חבל הטבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים קטנים, לערוף את העוברים ולשים את הראש או חלק מהם בצד הבידוד של הדנ&quot;א הגנומי אם genotyping צריכה להיות חובה. לאחר מכן, להעביר את torsi את בארות בהתאמה של הצלחת 12-היטב עם קור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את נייר הסינון בצלחת Sylgard עם כמה טיפות של PBS ואת המיקום הטורסו עובריים עם הצד הגבי שלה על הנייר. כדי להשיג יציבות טובה יותר, ליישר את זנבו הגפיים מהגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודהתחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה של כ 16x, בזהירות קמצוץ את עור העובר מעל חוט השדרה עם שני זוגות מלקחיים היטה בסדר בעדינות לקרוע אותו לגזרים. החל באמצע, המשך ראשון לקראת הזנב ואז לחדש מאמצע כלפי הצד הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את העובר מעת לעת עם שתיים או שלוש טיפות של PBS כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זאת DRG הם דמעו מן חוט השדרה כאשר הוא הוסר העובר לנתק את DRG ואת חוט השדרה מהעמודה סביב השדרה סחוסי ידי תנועות החלקה אופקי עם להב של מלקחיים בסדר בתוך מלוטשת טיפים. החל באמצע הצד הימני של העובר, דרך העבודה שלך לכיוון הזנב ואז לסיים את הקדמי. לאחר מכן, לחזור על התהליך בצד השני. היזהר שלא לקרוע את DRG קשור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק לחלוטין את חוט השדרה משוחרר מן העובר, להרים cervic שלהאל חלק עם מלקחיים בסדר למשוך אותו החוצה בחתיכה אחת לקראת סוף הזנב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את חוט השדרה מבודד עם DRG מחוברת היטב של צלחת 12-הבאר מלא חיץ קיבעון ולהמשיך עם הכנת מיתרי השדרה של העוברים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מיתרי השדרה לפחות שעתיים על הקרח. </li></ol> 2. DiI תיוג של נוירונים DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל חוט השדרה כדי להיות מתויג, להכין שתי מחטים זכוכית עם חולץ micropipette. אנו משתמשים במודל סאטר חולץ P-97 אלקטרודה (הגדרת התוכנית: 1 היט = 625, לוול ךיב = 35, TIME = 175; היט 2 = 600, לוול ךיב = 25, TIME = 175; היט 3 = 630, לוול ךיב =... 30, TIME = 150). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בקרה מיקרוסקופית לטבול את קצה מחט כל כוס שלוש עד חמש פעמים בתמיסה (w / v) 5% DiI באתנול. אידוי של אתנול יוצר שכבה דקה של קריסטלים DiI על המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה של 40X בערך, במקום חוט השדרה שלה עם vבצד entral עד בשקופית. בעזרת מספריים באביב, פתח את חוט בצד הגחון ב אורכו על ידי חיתוך דרך floorplate כדי לאפשר לאחר מכן הרכבה של הכנת במצב ספר פתוח, הפוכה (ראה סעיף ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את חוט השדרה עם הצד הגבי עד בשקופית. ואז באופן ידני הגישה את כבל עם קצה DiI המכוסה של המחט תחת זכוכית להדמיה מיקרוסקופית ובזהירות לנקב כל DRG השני בצד אחד של חוט השדרה. אין כמעט עקבות של DiI צריך להיות גלוי DRG פירסינג כדי להבטיח את תיוג של מספר קטן בלבד של נוירונים. קח מחט השני בצד השני של החוט. מכוון רק כל DRG second נמנעת חפיפה של תחזיות axonal שכותרתו מ DRG שכנות אשר עלול לסבך את הבידול של אקסונים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את חוט השדרה למאגר קיבעון ו דגירה בחושך במשך לפחות שש שעות בטמפרטורת הסביבה או לילה ב 4 ° C כדי לתת זמן כדי לצבוע diffuse לאורך האקסון בתוך קרום התא. אפשר לתקופת דגירה ארוכה יותר (עד יומיים ב 4 ° C) אם הניתוח של צמיחה בטחונות לתוך חוט השדרה הוא הרצוי. </li></ol> 3. הרכבה ואת ניתוח מיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עמדת לצבוע דיפוזיה, חוט השדרה יחיד עם הצד הגבי שלה על coverslip לירידה של PBS. תשמרי על עצמך כי DRG המחוברים בצורה נכונה אוריינטציה רוחבית לא להתערבב. לשאוב נוזל עודף לרדד את כבל במצב פתוח ספר הפוכה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהר הכנה בשקופית באמצעות מיקרוסקופ PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע גידול של ניתוח כתמים לא רצויים ברקע מיקרוסקופיים הקרינה של תחזיות axonal שכותרתו אמור להתבצע ביום גובר. עד אז לשמור את השקופיות בחושך ב 4 ° C. </li></ol> 4. נציג תוצאות: חוט השדרה של העכבר מקבל יחסי ציבור מביאojections מתוך 8 זוגות של צוואר הרחם, 13 זוגות של החזה, 5 זוגות זוגות המותני ו -4 של עצם העצה DRG בהיקף של עד 60 הגרעינים השדרה. לאחר כמה אימונים חוט שדרה עם DRG הכי מחוברת עדיין יכול להיות מבודד העובר בתוך פחות מחמש דקות. הליך זה מתאים הבידוד של מיתרי השדרה עם DRG המצורפת מתוך E11.5 כדי E13.5 עוברי עכברים. עם זאת, התוצאות הטובות ביותר מושגות מתוך E12.5. תוצאות למופת של ההליך תיוג המתואר כאן מוצגים באיור 3. תיוג של DRG על אורכו של חוט השדרה עלול לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת התנהגות הסתעפות axonal ברמות שונות בחוליות (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> באיור 1. תוכנית המתארת ​​את שני המצבים העיקריים של הסתעפות axonal. (א) מסעף ידי הפעילויות של חרוט צמיחה שעלולה להוביל הסתעפות - כפי שצוין כאן - כמו גם סוכות מסוף מורכבים או(ב) בטחונות היווצרות הפיר האקסון (ביניים הסתעפות). מצב זה האחרון הוא סוג של הסתעפות שולט מקרין אקסונים הקורטיקליים thalamocortical 6,7. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> איור 2 מביא תחזיות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר להציג שני סוגים של הסתעפות axonal:. אקסונים הסניף הראשון דח על ידי הסתעפות (1) ו מן הטופס סניפים בטחונות וכתוצאה מכך הבת לאחר תקופת המתנה על ידי ביניים הסתעפות (2). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> באיור 3. ויזואליזציה של מסלולי axonal יחיד של נוירונים DRG עובריים בעכבר. (א) חוט השדרה עם DRG מצורף מוכן מעובר E12.5 העכבר. (סרגל קנה מידה, 1 מ&quot;מ.) (BD) צפיות הגבי של DRG-DiI שכותרתו של wild-type עכברים בהגדלה הגדלת מוצגים. ב &#39;כל DRG השני הוא labeleד על ידי DiI. תמונות הקרינה הם הפוכים, הזנב הוא בצד שמאל וב C ו-D, לרוחב הוא בתחתית. ב C מספר קטן של אקסונים הוא שכותרתו בהגדלה גבוהה נוכחות של T-כמו ענפים ניתן לזהות דח של חוט השדרה. (מוטות קנה מידה, 250 מיקרומטר (ב), 100 מיקרומטר (ג) ו - 50 מיקרומטר (ד)). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> איור 4. כימות בצורת האות T סניפים, פונה מקורי או הזנב יחיד wild-type ו-C-type natriuretic פפטיד (CNP) מחסר עכברים בבית E13.5. המספרים של אקסונים יחיד נספר ניתנים בסוגריים רמות גזע שונה גנוטיפ של כל אחד. C-או R-הופך - צמיחה רק בכיוון הזנב או מקורי, בהתאמה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> איור 5. מסלול איתות cGMP מעורר הסתעפות האקסון חושי בשעה דח של חוט השדרה. (א) סכמתאת מסלול איתות cGMP המורכבת ליגנד CNP, הקולטן guanylyl cyclase Npr2 ואת סרין / תראונין קינאז cGKIα בנוירונים DRG עובריים. Npr2 מייצר cGMP מ GTP על ידי גירוי CNP. (ב) DiI מעקב של אקסונים יחיד של DRG נוירונים בעכברים wild-type ו-CNP לקוי. (סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר).

<ol>
	<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li><li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites.">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li><li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord.">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord.">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li><li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system.">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li><li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding:+implications+for+target+recognition+and+&amp;quot;waiting+periods&amp;quot;.">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &amp;quot;waiting periods&amp;quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li><li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li><li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye.">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li><li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+(CNP)+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons.">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li><li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons.">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li><li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones.">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li><li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo.">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li><li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דפוסי הקרנת סטריאוטיפית הכוללת את שני הסוגים של היווצרות ענף axonal יחד עם קלות הכנה בשילוב עם שימוש ברקמת קבוע DiI תיוג הופך את חוט השדרה העובר צמוד עם DRG מודל חיובי ללמוד axonal הסתעפות. היישום של כמויות זעירות של DiI באמצעות מחטים זכוכית מצופה מאפשר - בניגוד תיוג עיקר DRG - להדמיה של קבוצות קטנות של נוירונים DRG ובכך ניתוח של אקסונים הפרט דפוסי הסתעפות שלהם. השיטה המתוארת אפשר לשפר עוד יותר על ידי הזרקת iontophoretic של נותב lipophilic אשר מקטין עוד יותר את מספר הנוירונים שכותרתו 8. עם זאת, זה יהיה עוד זמן רב. תיוג DiI של מסלולי axonal יחיד בהכנות הר שלם של חוט השדרה העובר היה אינסטרומנטלי זיהוי של CNP cGMP האיתות מפל, המהווים ליגנד, הרצפטור שלו Npr2, ואתcGMP תלויי קינאז cGKIα - המווסת את סוג אחד של הסתעפות axonal: הסתעפות של DRG נוירונים ב דח 4,5,9-12. בניגוד wild-type, האקסונים של הנוירונים DRG מוטנטים איתות cGMP לפנות רק בכיוון אחד, במקום מתפצל ב דח (איור 5). מחקרים אלו הראו גם, כי היווצרות בטחונות לא היה מושפע מוטנטים איתות cGMP המציין כי זה הסוג השני של היווצרות ענף שנצפתה נוירונים DRG מוסדר באופן שונה 4. לחלופין, התנהגות ההסתעפות של אקסונים DRG יחיד יכול להיות גם למד קווי עכבר מהונדס או לבטא חלבון פלואורסצנטי בתת קטן בלבד של DRG נוירונים 13 או המכיל שילוב של סמנים ניאון המאפשר אחד כדי להבחין בין נוירונים בודדים 14. עם זאת, מאמץ לחצות מסוגם במודל עכבר מוטנטי כדי להיות מנותח עם קווי עכבר פלורסנט יש לבחון. יתר על כן, בשל promotor (Thy1) ביטוי בשימוש של חלבוני ניאון בקווי עכבר מהונדס מתחיל רק בשלבים שלאחר הלידה ולכן קשה לברר אם פנוטיפ הסתעפות שנצפה הוא תוצאה של היווצרות ענף לקוי במהלך ההתפתחות העוברית או ניוון מאוחר יותר התהליך במקום. לעומת זאת, DiI תיוג של עוברי DRG יש יתרון ללמוד את התהליך של הסתעפות axonal והפרעה שלה מוטנטים העכבר המתאים בזמן הסתעפות axonal מתרחשת. ההכנות של מיתרי השדרה עובריים עם DRG המצורף עשוי לשמש נוסף עבור הליכים תיוג אחרים (הר שלם ב-situ הכלאה, LacZ או AP-מכתים של העכברים הטרנסגניים), אוסף של חוט השדרה וברקמות DRG לבידוד-RNA, או כאשר מותאם בתנאים סטריליים לתרבות ניסויים ברקמות ואפליקציות הדמיה במורד הזרם כמו סידן או מדידות אלקטרו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope STEMI DRC </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו פתרון (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> מרק </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> מספריים כירורגית רגילה </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים תקן שיניים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> תוספת קנס איריס מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Curved מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> דומון No.5 בסדר טיפים מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> דומון No.5 המראה לסיים מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas-טובינגן באביב מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> מסנן נייר </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Precission העולם מכשירים </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ צלחות פטרי </td><td> גריינר </td><td> 663102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 מ&quot;ל צינור פוליפרופילן </td><td> קרל רוט GmbH </td><td> ECO3.1 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 גם תרבות צלחת </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> מרק </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette חולץ P-97 </td><td> סאטר Instrument ושות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בורוסיליקט זכוכית נימי </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DiI (1,1 &#39;-Dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethyl - indocarbocyanine פרכלורט) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 468495 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות SuperFrost פלוס </td><td> קרל רוט GmbH </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית תלושי </td><td> קרל רוט GmbH </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord

כאן אנו מציגים טכניקה התווית מסלולים של קבוצות קטנות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר על ידי מכתים diffusive באמצעות נותב lipophilic 1,1 &#39;-dioctadecyl-3, 3,3 &quot;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine (DiI) פרכלורט 1 . ההשוואה בין המסלולים axonal של wild-type עם אלה של קווי העכבר אילו גנים שעברו מוטציה המאפשרת בדיקת תפקיד פונקציונלי של חלבונים מועמד בשליטה על הסתעפות axonal המהווה מנגנון חיוני החיווט של מערכת העצבים. הסתעפות axonal מאפשר נוירון יחיד להתחבר עם מטרות מרובות, ובכך לספק את הבסיס הפיזי של עיבוד מקבילי של מידע. השלכות על אזורים יעד ביניים של צמיחה axonal ניתן להבחין בין arborization סופנית. יתר על כן, מצבים שונים של היווצרות ענף axonal ניתן לסווג תלוי אם תוצאות מסתעפת מן הפעילויות של חרוט צמיחה (פיצול או חזייה מתעכבnching) או מפני נביטה של בטחונות מן הפיר האקסון בתהליך הנקרא הסתעפות ביניים 2 (איור 1). תחזיות המרכזית של נוירונים של DRG להציע מערכת ניסיונית שימושי ללמוד את שני הסוגים של הסתעפות axonal: כאשר האקסונים שלהם מביא להגיע השורש הגבי כניסה לאזור (דח) של חוט השדרה העובר בין ימים 10-13 (E10 - E13) הם התצוגה דפוס סטריאוטיפי של T-Y או בצורת הסתעפות. שני אקסונים הבת וכתוצאה מכן להמשיך בכיוונים מקורי או הזנב, בהתאמה, בשוליים דורסולטרלי של חוט ורק לאחר תקופת המתנה בטחונות צומחים מתוך גזע אקסונים אלה לחדור את החומר האפור (ביניים הסתעפות) ואת פרויקט ספציפי של נוירונים ממסר רבדים של חוט השדרה שם הם עוד arborize (מסוף הסתעפות) 3. העתקים DiI חשפו קונוסים צמיחה בכל אזור הכניסה השורש הגבי של חוט השדרה זה נראה ב-PRocess של פיצול טוען כי הסתעפות נגרמת על ידי פיצול של חרוט הצמיחה עצמה 4 (איור 2), עם זאת, אפשרויות אחרות נדונו גם 5. וידאו זה מדגים הראשונה איך לנתח את עמוד השדרה של עכברים E12.5 עוזב DRG המצורפת. קיבעון בעקבות הסכומים דגימה קטנה של DiI מוחלים DRG באמצעות מחטים זכוכית משך משפופרות נימי. לאחר שלב דגירה, חוט השדרה שכותרתו מותקן כהכנה פתוח ספר הפוך לנתח אקסונים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Watch this Scientific Journal Video about DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

תחזיות סטריאוטיפית של afferents חושי אל חוט השדרה מכרסם להציע מערכת ניסיונית נגיש ללמוד axonal מסתעפת דרך התחקות של אקסונים יחיד.

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.8K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine. תחזיות סטריאוטיפית של afferents חושי אל חוט השדרה מכרסם להציע מערכת ניסיונית נגיש ללמוד axonal מסתעפת דרך התחקות של אקסונים יחיד.

Video: DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...