Doz נתמך על ידי מענק הוענק מטעם קרן ז&#39;נבה. SN נתמך על ידי מענק מלגה דוקטורים מן היוזמה הנדסת רקמות פיטסבורג.

1. בידוד הנגזרות שומן גזע תאים (ASC) הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את השומן עכברוש perirenal ו epididymal ולשטוף עם פתרון שנאגרו האנק של מלח סטרילית (HBSS) המכיל 1% בסרום שור עוברית (FBS) כפי שתואר קודם 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה ולהעביר 1-2 גרם בתוך 25 מ&quot;ל של HBSS המכילים FBS 1% אל תוך צינור 50 מ&quot;ל ו 500 גרם צנטריפוגות ב 8 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הספונטנית רקמת שומן שכבת והעברה בקבוק 125 מ&quot;ל erlenmeyer ולטפל עם 25 מ&quot;ל של collagenase מסוג II (200 יח&#39; / מ&quot;ל) ב HBSS 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (125 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את החלק היחסי נוזלי (להלן נפט שכבת השומן) ולסנן ברצף דרך מסנן של 100 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר רשת ניילון. בצנטריפוגה תסנין ב 500 גרם 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב supernatanלא לשטוף גלולה פעמיים עם 25 HBSS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה ב 50 מ&quot;ל של מדיום הגידול (MesenPRO בינוני RS בסל) השלימו עם תוספת RS צמיחה MesenPRO, אנטיביוטיקה antimycotic (100 U / mL של פניצילין G, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין סולפט מ&quot;ל, ו -0.25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​amphotericin B) , אל 2 T75 צלוחיות (25 מ&quot;ל / בקבוק) 2 מ&quot;מ L-גלוטמין ותאי pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ASC ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C (המעבר 2-4 ASC משמשים לניסויים בכלל). </li></ol> 2. הכנת Chitosan microspheres (CSM) הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CSM מוכנים בתהליך תחליב מים בתוך שמן יחד עם הטכניקה coacervation יוניים באמצעות פרוטוקול הקודמת שלנו 6. Emulsify בתמיסה מימית של chitosan (6 מ&quot;ל של chitosan 3% w / v בחומצה אצטית 0.5 מ &#39;) 100 מ&quot;ל של תערובת שמן השלב המורכב סויהשמן, N-octanol (01:02 v / v) ו 5% sorbitan-מונו oleate (פרק 80) מתחלב, באמצעות תקורה (1,700 סל&quot;ד) ו בחישה מגנטי (1000 סל&quot;ד) בו זמנית, בכיוונים מנוגדים. בשיטה הכפולה של ערבוב מבטיח כי micelles נוצרו בשלב מוקדם לפני cross-linking מתרחשת יכול להישאר פתרון ולא להסתפק לתחתית. יתר על כן, מערבבים המגנטי בר מסייע דה צבירה chitosan במהלך היווצרות micelle ו rigidization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התערובת היא עוררה ברציפות עד האמולסיה יציבה מים על שמן מתקבל במשך שעה בערך 1. Crosslinking יונית נשלחת עם תוספת של 1.5 מ&quot;ל של הידרוקסיד 1% w / v אשלגן דקות N-octanol 15 עבור כל 4 שעות (24 מ&quot;ל בסך הכל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת התגובה crosslinking, למזוג לאט את השלב הנפט של CSM תערובת המכילה ומיד להוסיף את התחומים עד 100 מ&quot;ל של אצטון. לשטוף את התחומים עם אצטון עד לשלב שמן נמחק לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את התחומים התאוששה תא ייבוש ואקום אנאליyze ללא עיבוד נוסף. CSM הממוצע החלקיקים בגודל, שטח הפנים מיליגרם ו מעוקב יחידת נפח נקבע באמצעות גודל החלקיקים Analyzer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים שבאו לאחר מכן, לשטוף CSM שלוש פעמים עם מים סטריליים כדי להסיר שאריות מלחי ו לחטא עם אלכוהול מוחלט. </li></ol> 3. קביעת מספר קבוצות אמינו חופשיות ב CSM הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר קבוצות אמינו חופשיות הנמצאים CSM לאחר crosslinking יוניים באמצעות benzenesulfonic trinitro (TNBS) assay של חומצה Bubins ו Ofner 7. דגירה של 5 מ&quot;ג microspheres עם 1 מ&quot;ל של תמיסת TNBS 0.5% בשנת צינור זכוכית 50 מ&quot;ל במשך 4 שעות ב 40 מעלות צלזיוס, hydrolyze עם תוספת של 3 מ&quot;ל של HCl 6N ב 60 ° C ל 2h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את דגימות לטמפרטורת החדר, ולחלץ את TNBS בחינם על ידי הוספת 5 מ&quot;ל מים deionized ו 10 מ&quot;ל של אתילהאתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם aliquot 5 מ&quot;ל של שלב מימית עד 40 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות להתאדות בכל האתר שיורית, מצננים לטמפרטורת החדר, לדלל עם 15 מ&quot;ל מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ספיגת ב 345 ננומטר עם ספקטרופוטומטר באמצעות פתרון TNBS ללא chitosan כמו ריק chitosan משמש להכנת CSM כדי לקבוע את המספר הכולל של קבוצות אמינו. להעריך את מספר קבוצות אמינו חופשיות של CSM ביחס chitosan. </li></ol> 4. טוען ASC ב CSM הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן 5 מ&quot;ג של CSM עיקור מסעיף 2.5 ב HBSS סטריליים לילה ולהוסיף 8-מיקרומטר גודל הנקבוביות להוסיף קרום צלחת תרבות (24 גם צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר CSM התיישבו על הממברנה, בזהירות לשאוב את HBSS ולהוסיף 300 μL של מדיום הגידול הפנימי של הכנס ו 700 μL של התקשורת הצמיחה ל הדואר מחוץ להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ASC בריכוז המתאים (1 x 4-04 אוקטובר 10 x 4) 200 μL של המדיום צמיחה זרע על CSM בתוך להוסיף את הצלחת התרבות. היקף הסופי של המדיום תוך הוספה התרבות, לאחר זריעה, הוא 500 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה seeded ASC על CSM עבור H 24 ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C. </li></ol> 5. קביעת אחוז טוען ASC ו כדאיות התא ב CSM הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לאסוף CSM ASC-טעון צינור 1.5-מ&quot;ל סטרילי microcentrifuge מבלי להפריע את התאים אשר היגרו אל קרום הוספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את שאריות בינוני ומוסיפים 250 μL של מדיום הגידול טרי הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל צינור זה להוסיף 25 MTT μL [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-י.ל.) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד]הפתרון (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו - דגירה של 4 שעות ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, הסר בינוני, מוסיפים 250 μL של sulfoxide דימתיל, ואת המערבולת התערובת במשך 2-5 דקות כדי solubilize מורכבת formazan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה CSM ב 2700 x g 5 דקות, ולקבוע את ספיגת supernatant נמדד ב 570 ננומטר באמצעות 630 ננומטר כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר הסלולרי קשור CSM יחסית לערך ספיגת לקבל מספרים הידועים של ASC בת קיימא. </li></ol> 6. אפיון ASC-CSM-Embedded קולגן ג&#39;ל הערה: כל הנהלים בוצעו בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ASC-CSM טעון (5 מ&quot;ג המכיל ≈ 2 x 10 4 תאים) עם קולגן סוג 1 (7.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) המופק גיד זנב עכברוש על פי השיטה של בורנשטיין 8 ו לרעוד לאחר התאמת נתוני pH 6.8 כדי שימוש 2 N NaOH. </lאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת פירפר קולגן-ASC-CSM לצלחת 12-טוב ו דגירה של 30 דקות בשעה של 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פרפור מלאה, דגירה של קולגן-ASC-CSM ג&#39;ל של עד 14 יום ב 5% CO 2 באינקובטור humidified ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרור והעברה של תאים CSM לתוך הג&#39;ל נצפו באמצעות שיטות מיקרוסקופיה רגילות. </li></ol> 7. נציג תוצאות במחקר הנוכחי, פיתחנו אסטרטגיה במבחנה כדי לספק לתאי גזע של chitosan microspheres (CSM) לתוך קולגן ג&#39;ל הפיגום. CSM נקבובי בגודל אחיד (175-225 מיקרומטר קוטר) והרכב היו מוכנים ושימש ספקים סלולריים (איור 2). על דוגרים ASC עם CSM, התאים מחוברים בריכוז של 2 cells/5mg x 4 10 של CSM. התאים מסוגלים להתפשט על microsphere, תוך הארכת filopodiaלתוך הסדקים נקבוביים של microsphere (איור 3). לאחר CSM התא טעון היו מעורבים עם ג&#39;ל קולגן, התאים החלו מיד נודדות אל ג &#39;ל (איור 4). <img alt="טבלה מס &#39;1" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> טבלה 1. יתרונות ביולוגיים לשימוש של chitosan ו הקולגן מערכת תא גזע הלידה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי המתאר את האסטרטגיה הכוללת לשימוש כפול של ASC-CSM פיגומים טעון קולגן. איורים 2, 3 ו -4 הם המבואר בתוך סכמטי לסייע בפרשנות של התמונות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי המתאר את תהליך זריעת בתאי גזע על chitosan microspheres. ProcESS כוללת שיתוף culturing ASC עם CSM ב 8 - נקבוביות מיקרומטר בגודל הממברנה התרבות להוסיף צלחת. לאחר 24 שעות, microspheres יוסרו להוסיף והם מוכנים להטבעת לתוך המטריצה ​​בחומר ביולוגי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> איור 3. אפיון מורפולוגי של CSM-עמוסה ASC. לוח מתאר מיקרוסקופ אור של CSM ASC טעונים, בעוד לוח ב &#39;מראה את אותו שדה הראייה גבי בתמונה מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ASC היו מראש עם calcein בבוקר (ירוק). לוח ג מתאר תמונה של תמונה SEM של microsphere פרקו, בעוד לוח ד ניתן לראות תאים הועמסו על microsphere (כוכביות). תמונת TEM ב E לוח מראה חתך של microsphere טעון. מספר רב של נקבוביות הסדקים נמצאים ברחבי microsphere. לוח F מראה microsphere בחתך רוחב עם תאים (חיצים) מחובר הארכת filopodia אל creהמידות הרעות. בהגדלה מקור: &amp; B = 70x, C = 500X, D = 2000 x, E &amp; F = 2,500 x. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> איור 4. הגירה של ASC מ CSM לתוך תלת מימדי קולגן הפיגום. לוחות א &#39;וב&#39; מתארים CSM עם תאים נודדות הרחק microsphere לתוך המטריצה ​​קולגן ביום 3 (א &#39;, חיצים). לוח ב &#39;מציג את התרבות דומה לאחר 12 יום. מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) תמונות מתוארים ג&#39;, ד &#39;, וא&#39; כוכביות ב-C ו-D להראות microsphere כי כבר בחתך רוחב עם תאים נודדות הרחק microsphere (חיצים). ההגדלה גבוה יותר של לוח ד מתואר E לוח, ומראה filopodia התא מחוברת את סיבי הקולגן (השיבוץ). ההגדלה המקורי: A ו-B = 100x: C &amp; D = 6000 x, E = 20,000 X, הבלעה = 150000 x. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> איור 5.סכמה המתארת ​​את השימושים עצומות של CSM ברפואה רגנרטיבית משלוח סמים.

<ol>
	<li>Krampera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+bone,+cartilage,+tendon+and+skeletal+muscle+repair.">Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair.</a> Bone. 39, 678-683 (2006).</li><li>Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+strategies+for+adipose+tissue+repair.">Tissue engineering strategies for adipose tissue repair.</a> Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).</li><li>Pountos, I., Giannoudis, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+mesenchymal+stem+cells.">Biology of mesenchymal stem cells.</a> Injury. 36, S8-S12 (2005).</li><li>Kim, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+and+its+derivatives+for+tissue+engineering+applications.">Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications.</a> Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).</li><li>Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+chitosan+and+its+derivatives+in+regenerative+medicine.">Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine.</a> J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).</li><li>Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cell+delivery+into+collagen+gels+using+chitosan+microspheres.">Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres.</a> Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).</li><li>Bubnis, W. A., Ofner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+determination+of+epsilon-amino+groups+in+soluble+and+poorly+soluble+proteinaceous+materials+by+a+spectrophotometric+method+using+trinitrobenzenesulfonic+acid.">The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).</li><li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes.">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Lab Invest. 7, 134-137 (1958).</li><li>Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+production+prevents+anoikis+in+human+mesenchymal+stem+cells.">Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).</li><li>Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+hydrogel+niches+that+promote+hMSC+viability.">Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability.</a> Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).</li><li>Shanmuganathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+chitosan+microspheres+for+doxycycline+delivery.">Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery.</a> Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).</li><li>Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+a+new+microcapsule+membrane+combining+alginate,+chitosan,+polyethylene+glycol+and+poly-L-lysine+for+cell+transplantation+applications.">Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications.</a> Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).</li><li>Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells:+a+unique+hypoimmunogenic+platform+for+long-term+cellular+therapy.">Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy.</a> FASEB J. 24, 22-31 (2010).</li><li>Zielinski, B. A., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+as+a+matrix+for+mammalian+cell+encapsulation.">Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation.</a> Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).</li><li>Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Bo&#382;ikov, K., Barli&#231;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Models+for+Adipose+Tissue+Engineering+with+Adipose-Derived+Stem+Cells+Using+Different+Scaffolds+of+Natural+Origin.">In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin.</a> Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).</li><li>Baruch, L., Machluf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate-chitosan+complex+coacervation+for+cell+encapsulation:+effect+on+mechanical+properties+and+on+long-term+viability.">Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability.</a> Biopolymers. 82, 570-579 (2006).</li><li>Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/silk+fibroin-based+tissue-engineered+graft+seeded+with+adipose-derived+stem+cells+enhances+nerve+regeneration+in+a+rat+model.">Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).</li><li>Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLGA-chitosan/PLGA-alginate+nanoparticle+blends+as+biodegradable+colloidal+gels+for+seeding+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells.">PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).</li><li>Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor.">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2010).</li><li>Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+biocompatibility+study+of+electrospun+chitosan+microfiber+for+tissue+engineering.">In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering.</a> Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).</li><li>Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+channels+containing+spinal+cord-derived+stem/progenitor+cells+for+repair+of+subacute+spinal+cord+injury+in+the+rat.">Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat.</a> Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).</li><li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds.">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32, 57-64 (2011).</li><li>Altman, A. M., Gupta, V., RÃ­os, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion,+migration+and+mechanics+of+human+adipose-tissue-derived+stem+cells+on+silk+fibroin-chitosan+matrix.">Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix.</a> Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).</li><li>Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Human+adipose-derived+stem+cells+seeded+on+a+silk+fibroin-chitosan+scaffold+enhance+wound+repair+in+a+murine+soft+tissue+injury+model.">IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model.</a> Stem Cells. 27, 250-258 (2009).</li><li>Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+chitosan-gelatin-chondroitin+porous+scaffold+improves+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).</li></ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים. הבהרה חוות הדעת או וטיעונים הכלולות במסמך זה הן את הדעות הפרטיות של הכותבים ואינם להתפרש הרשמי או משקף את הדעות של משרד הביטחון או ממשלת ארה&quot;ב. הכותבים הם עובדי ממשלת ארה&quot;ב, ואת העבודה הזאת הוכנה במסגרת תפקידיהם הרשמיים. כל עבודה נתמך על ידי הצבא האמריקני למחקר רפואי ו פיקוד אמצעי. המחקר נערך תחת פרוטוקול נבדקה ואושרה על ידי הצבא האמריקני למחקר רפואי ו פיקוד אמצעי ביקורת מוסדי עמוד, ועל פי פרוטוקול שאושר.

המכשול העיקרי בטיפול בתאי גזע מבוסס מפתחת שיטות יעילות עבור משלוח של תאים לאזורים המפורטים לתיקון. בשל השתנות החולה המטופל, סוג הרקמה, גודל ועומק הפציעה, המתודולוגיה של בתאי גזע אספקת צריכה להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו. למרות הטבעה בתאי גזע בתוך מטריקס ושולחים אותם לאתר את הפצע נראה הגישה ההגיוני הבא של הנדסת רקמות, כמה מכשולים טכניים להישאר. זה כולל את היכולת של התאים משובצים לצרף מטריקס ולספק ביולוגית המקיף שבו התאים יכולים לצרף, להתרבות מחדש microenvironment מתאים לפני anoikis 9-10. תהליך זה דורש התאים upregulate שיפוץ מטריקס שלהם מכונות, תהליך שיכול לקחת ימים כדי לבצע לפני תהליכי התא הרצוי ההגירה התפשטות, התמיינות בתאי גזע. כדי לעקוף בעיות אלה, אנו ששד &#39;פיתח שיטה בתאי גזע preload גבי chitosan microspheres לפני הטבעה אותם לתוך המטריצה ​​המתאים לתקן של הרקמה הפגועה. באמצעות cross-linking יונית הייחודית שלנו שיטות להכין microspheres, הפרוטוקול הוא מסוגל להכין&gt; 90% microspheres להיות בתוך 175-225 מיקרומטר קוטר, ובכך לייצר הספק מעולה מיקרו בגודל של תאים. יתרה מכך, לאחר cross-linking, microspheres להישאר חיובי, וזה תורם מאוד עבור קובץ מצורף התא. מאפיינים אלה מאפשרים לתאי גזע microsphere לצרף במהירות על CSM. מצורף פעם, אלה בתאי גזע טעון microspheres יציבים ומסוגלים להשיג סידורים מרחביים בתוך הפיגום, כגון קולגן, הידרוג לחקות את הרקמות הפגועות. לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה כדי לטעון ASC על CSM ומדגים כי תאים על microspheres יכולים להעביר תוך שמירה על תא גזע שלהם פנוטיפ. CSM נקבובי המתואר לספקmicroenvironment מצוין ASC מצורף ועדיין לאפשר התאים נודדים לתוך מטריקס שמסביב. תקציר: שלבים קריטיים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש microspheres בגודל אחיד מאז וריאציה בקוטר משפיע ישירות על שטח זמין עבור הקובץ המצורף תא מיליגרם של microspheres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיטה אחיד של microspheres תוך הוספה תרבות מצורף אחידה אופטימלי של התאים CSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את נפח התקשורת הוסיף גם החיצוני של הוספת תרבית תאים גבוהה יותר של המניסקוס הפנימי גם כן. בדרך כלל, פנימי: יחס חיצוני בנפח של 1:02 מתאים, שכן הדבר מאפשר היצמדות תאים microspheres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את התא טעון microspheres באופן שווה בתוך הפיגום. אם חלוקת ASC-CSM הוא צפוף מדי, התאים לא לעבור מ microspheres שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכמות הרצויה של CSM ו distriצפיפות bution תלויה יישומים בתחום הרקמות הפגועות. </li></ul> מגבלות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה זו מוגבלת שטח הפנים הכולל הזמין microspheres. אם מספר תאים גבוה יותר הוא הרצוי, microspheres יותר נדרשים להגדיל את שטח הפנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התהליך מאפשר לתאים להיות זרע על microspheres preformed ולא נועד למטרות אנקפסולציה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microspheres chitosan התפתח תהליך זה יכול לתמוך מעגן תלויי תאים אבל לא סוגי תאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז chitosan microspheres מפותחים בעזרת הפתרון 0.5m חומצה אצטית, לתחליב בתערובת שמן (שמן סויה: N-octanol) והחלים באמצעות ממס אורגני זה אינו מאפשר moieties טיפוליים פעילים פגיעה בתנאי הנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CSM נועדו בעיקר לספק תאים / סמים משך זמן קצר יותר (5-10 ימים) עקב הידרדרות שלה מהר יותרקצב, שלא כמו אלה המיועדים זמינות למשך זמן רב. </li></ul> שינויים אפשריים צדדיות (איור 5) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל microsphere ניתן לשנות לשנות את שטח הפנים הכולל. כך, למשל, גודל microsphere עשוי לרדת להגדיל את שטח הפנים / מ&quot;ג של CSM, אשר בתורו יגדיל את שטח הפנים הכולל את מספר התאים שיכולים לצרף microspheres, וכתוצאה מכך העומס התא מוגברת לכל microsphere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chitosan microspheres יכול לשמש כנשא לטעון סוגי תאים אחרים (לתאי אנדותל, פיברובלסטים pericytes, וכו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא טעון כדורים (או סוגים יחיד או מספר תאים) יכול להיות מוטבע בתוך מיקומים ספציפיים של הפיגומים. אסטרטגיה זו תסייע בבניית רקמות מהונדסות תאיים פיגומים לשחזור רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף משלוח התא, microspheres יכול גם לשמש כדי לספק תרופות טיפוליות (כלומר, גורמי גדילה, inducers התמיינות, ו / או אנטיביוטיקה). התרופה טעונים אלה microspheres עשוי לשמש גם בשילוב עם התא טעון microspheres בתוך פיגום כדי לשפר את תהליכי ריפוי והתחדשות. </li></ul> פתרון בעיות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הכנת CSM, אם שונות רבה בגודל מתרחשת, ואז מספר הפריטים ניתן להתאים להניב בגודל הרצוי CSM 11. <ul type="circle" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמיגות של פתרון chitosan. מלאי מוכן טרי עדיף לשמור את הפתרון מתחת צמיגות משתנה מיום הכנת המנה אל אצווה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הקול של פעילי שטח (אורך 80) משמש כדי להכין את התחליב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח את מהירות stirrer תקורה נשארת קבועה לאורך כל התהליך (מהירות עשוי להשתנות עם תנודות חשמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ערבוב אוויר אטמוספרי הקניית עלול לגרום תסיסה וגודל השונות (זה יכול להימנע על ידי קהEP אדווה נוזלי, המהווה במהלך ערבוב, רק על הלהבים של stirrer תקורה. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח טוען תא אופטימלי של microspheres, assay MTT calorimetric ניתן לבצע. זה ייתן אומדן מספר התאים קיימא טעון מיליגרם של microspheres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע clumping של התא טעון microspheres ידי השעיית אותם בנפח קטן של התקשורת תרבית תאים לפני ערבוב אותם בתוך הפיגום כגון הידרוג קולגן. </li></ul>

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> הנקס BalancedSalt פתרון (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14175 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> Collagenase Type II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6685 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> 70 מיקרומטר רשת ניילון המסנן </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> 100 מיקרומטר רשת ניילון המסנן </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> בינוני MesenPRO צמיחה מערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> T75 בתרבית רקמה Flask </td><td> BD Biosciences </td><td> 137787 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> Chitosan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448869 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320099 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> N-Octanol </td><td> Acros Organics </td><td> 150630025 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> Sorbitan-Mono-oleate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6760 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> אשלגן הידרוקסיד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1767 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> אצטון </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> L-4859 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270741 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> Trinitro Benzenesulfonic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2297 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> מימן כלורי </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320331 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> אתיל Ether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472-484 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> 8-מיקרומטר בתרבית רקמה הוספת פלייט </td><td> BD Biosciences </td><td> 353097 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> 1.5-מ&quot;ל Microcentrifuge צינורות </td><td> דיג </td><td> 05-408-129 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> MTT מגיב </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> דימתיל Sulfoxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8779 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> תא Qtracker סימון Kit (ש גשש 655) </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td> Q2502PMP </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> הקלד 1 קולגן </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> 12 ובכן בתרבית רקמה צלחות </td><td> BD Biosciences </td><td> 353043 </td><td> מתכלים </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> Orbital שאכר </td><td> ניו ברונסוויק Scienctific </td><td> C24 </td><td> ציוד </tד&gt; </tr><tr><td> החממה Humidified עם האוויר CO-5% 2 </td><td> Thermo Scientific </td><td> דגם 370 </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> תקורה stirrer </td><td> איקא </td><td> Visc6000 </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מגנטית stirrer </td><td> קורנינג </td><td> PC-210 </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> אבק תא ייבוש </td><td> - </td><td> - </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> גודל החלקיקים Analyzer </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מי האמבט </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> Isotemp210 </td><td> ציוד </TD&gt; </tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> Beckman </td><td> Beckman Coulter DU800UV/Visible ספקטרופוטומטר </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מערבולת </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> Microplate Reader </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> SpectraMax M2 </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> אור / מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> אולימפוס </td><td> IX71 </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> FV-500 סריקת לייזר מיקרוסקופ Confocal </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> Carl Zeiss מיקרופוןroImaging </td><td> ליאו 435 סמנכ&quot;ל </td><td> ציוד </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> ציוד </td></tr></tbody></table>

constructing a collagen hydrogel for the delivery of stem cell-loaded chitosan microspheres

בתאי גזע multipotent הוכחו להיות שימושי ביותר בתחום הרפואה משובי 1-3. עם זאת, כדי להשתמש ביעילות את התאים האלה לשחזור רקמות, מספר משתנים יש לקחת בחשבון. משתנים אלה כוללים: הנפח הכולל ושטח הפנים של אתר ההשתלה, תכונות מכניות של רקמות ואת microenvironment רקמות, הכוללת את כמות כלי הדם ועל מרכיבי מטריקס תאיים. לכן, חומרים בשימוש, כדי לספק את התאים האלה חייבים להיות ביולוגית עם הרכב כימי מוגדר, תוך שמירה על חוזק מכני המחקה רקמת המארח. חומרים אלה חייבים להיות גם החדיר את חמצן וחומרים מזינים לספק microenvironment חיובית על תאים לצרף מתרבים. Chitosan, פוליסכריד קטיוני עם biocompatibility מעולה, ניתן לשנות בקלות כימית ויש לו זיקה גבוהה להיקשר עם in vivo Macromolecules 4-5. Chitosan מחקה חלק glycosaminoglycan של מטריקס תאית, מה שמאפשר לו לתפקד כמו המצע של הגירה הידבקות, תאים ו ההפצה. במחקר זה אנו מנצלים chitosan בצורה של microspheres כדי לספק שומן שמקורם בתאי גזע (ASC) על בסיס קולגן תלת ממדי הפיגום 6. היחס האידיאלי התא אל microsphere נקבע ביחס לזמן הדגירה ואת צפיפות התאים כדי להשיג המספר המרבי של התאים ניתן לטעון. לאחר ASC הם זרע על microspheres chitosan (CSM), הם מוטבעים פיגום קולגן יכול להישמר בתרבות לתקופות ממושכות. לסיכום, מחקר זה מספק שיטה בדיוק לספק בתאי גזע בתוך 3 מימדי ביולוגי הפיגום.

Watch this Scientific Journal Video about Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres at JoVE.com

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

constructing-collagen-hydrogel-for-delivery-stem-cell-loaded-chitosan

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K Views.  United States Army Institute of Surgical Research. המכשול העיקרי בתא טיפולים שוטפים גזע הוא לקבוע את השיטה היעילה ביותר, כדי לספק תאים אלה לרקמות המארחות. כאן אנו מתארים שיטה chitosan מבוסס משלוח יעיל ופשוט של הגישה, תוך מתן אפשרות השומן שמקורם בתאי גזע כדי לשמור על multipotency שלהם.

Video: Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

הנדסת Hydrogel Bilayered לשלוט בידול ASC

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

סינתזה של חלבון מלאכותי בתיווך intein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

פיתוח של Hydrogel Amelogenin-chitosan עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; אמייל לצמיחה מחודשת עם ממשק צפוף

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant exogenous molecular probes into cells. This work reports a microfluidic electroporation platform capable of performing multiple molecule delivery to mammalian cells with precise and molecular-dependent parameter control. The system&#8217;s ability to isolate cells with uniform size distribution allows for less variation in electroporation efficiency per given electric field strength; hence enhanced sample viability. Moreover, its process visualization feature allows for observation of the fluorescent molecular uptake process in real-time, which permits prompt molecular delivery parameter adjustments in situ for efficiency enhancement. To show the vast capabilities of the reported platform, macromolecules with different sizes and electrical charges (e.g., Dextran with MW of 3,000 and 70,000 Da) were delivered to metastatic breast cancer cells with high delivery efficiencies (&#62;70%) for all tested molecules. The developed platform has proven its potential for use in the expansion of research fields where on-chip electroporation techniques can be beneficial.

A microfluidic vortex assisted electroporation platform was developed for sequential delivery of multiple molecules into identical cell populations with precise and independent dosage control. The system&#8217;s size based target cell purification step preceding electroporation aided to enhance molecular delivery efficiency and processed cell viability.

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

מולקולריים Hydrogel זריקות וטעוני תרופות להזרקה מקומית צנתר לתוך לב החזיר

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...