עבודה זו נתמכה על ידי חברת ביטוח החיים &quot;AG2R-La-מונדיאל&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), את Agence Nationale de la משוכלל ונדיר &quot;ANR-09-NEUR-004&quot; בתוך המסגרת של נוירון ERA-NET &quot; &quot;תוכנית FP7 על ידי הנציבות האירופית, וקרן פסטר. סבסטיאן וגנר נתמך על ידי קרן Letten.

1. כיול אופטי: Power LED מדידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מערך LED כדי קירור מקורר באופן אקטיבי על ידי מאוורר וגם להדביק זה aparatus / קירור LED על העדשה collimating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלפת מנורה המשמשים brightfield עם תאורה LED / קירור / מאוורר / מנגנון העדשה. מנגנון זה חייב להיות ממוצבת היטב כך קרן LED collimated נוסע בנתיב אופטי ישר לכיוון העדשה הקבל. ודא heatsink / אוהד מעוגנת כהלכה מכנה משותף של המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כונן את מערך LED עם ספק כוח שיכול לתת פולסים מהיר רבועים של הנוכחי. אספקת כוח זה עשוי להיות נשלט על ידי TTL 5V הדופק שמקורם גנרטור הדופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז קרן collimated לאורך השביל אור מוגדר בין הסרעפת שדה העדשה condensor. באופן אידיאלי, קרן LED יהיה מעט תמלא יותר מדי את הסרעפת השדה נפתח במלואו. בדרך כלל, קרן LED collimated חזק יותר שימלא את הצמצם פחות, תפיק מורדואר כוח על חשבון אחידות. ב ההתקנה שלנו הגדלנו אחידות אור על ידי בחירת עדשה collimating כי מוקרן דימוי מורחבת מעט של מערך ה-LED על מטוס המצומד שלה הסרעפת consenser. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג תאורה קולר על ידי התמקדות את הקבל כך את התמונה של הסרעפת שדה (הסרעפת הקרוב ביותר למקור אור) מתמקדת החדר פרוסה (איור 1). רקמה דקה של נייר העדשה יכול לשמש כמסך הקרנה לדמיין את התמונה ממוקדת של הסרעפת בתחום בעומקים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחה סדרה של pinholes בקוטר ידוע חומר אטום. מקום אחד כזה pinholes קטן על החיישן של מד הכוח אופטי. הנח את מד הכוח על הבמה הדגימה במרכז מד הכוח על התמונה ממוקדת של הסרעפת השדה פשוט על ידי הזזת מד הכוח עד שהוא נותן קריאה מקסימלית. לצרף את מד הכוח בעמדה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי לפתוח את כל הפתחים (הסרעפת aperature ובתחום הסרעפת). באופן שיטתי להעביר את פרוסת המצורפת תא / כוח מטר ביחס lightpath האופטי ולחשב את האחידות של כוח אופטי בתוך השטח המואר. בנה את העלילה אחידות עבור המערכת שלך. אם המיקרוסקופ כשורה קולר עם תאורה ממוקדת במוקד של אובייקטיבי, ההספק המרבי צריך להיות ישירות מתחת ליעד, ואזורים מחוץ להתמקד הזה צריך עכשיו לקבל כמות ידועה של כוח על פי העלילה אחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל גודל של חריר, לבנות עקומת תקן של כוח אופטי לעומת פני השטח חריר. על ידי התאמת קלט הנוכחי למערך ה-LED, להפיק את עקומת במספר רמות הספק וממנו לחשב את כל עקומת כוח לכל mm2. אם מערך LED היא לשמש עבור אופטיקה תיקון, הקפד להציג אלמנטים אופטיים הדרוש תיקון (מעבים, pinholes ומסננים) לדעת כמה אור מועבר תחת תאורה תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Flipping את מד הכוחמול המטרה, לחשב את עוצמת התאורה ב 470nm כאשר המנורה כספית מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פרוסה לחיות לחדר, ולבנות מחדש את העיקולים על מנת לקבוע את תקן כוח האור המועבר דרך רקמת המוח פיזור. </li></ol> 2. נוהל לחתוך Electrophysiology חלק א: הכנת Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי (60 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין ו 2mg/kg Xylazine) ו לערוף את העכבר. מנתחים את המוח מלאכותי בנוזל השדרה מוחין (ACSF, במ&quot;מ: 124 NaCl, KCl 3, 1.3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1.25 NaHPO 4, 20 גלוקוז, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7.4 כאשר בועות בתערובת של O2 95% ו 5% CO 2 5,1), נזהרת שלא לפגוע נורות חוש הריח. הפרד את שתי ההמיספרות ומניחים על אגר עם משטח הגחון אפילו עם קצה אחד (סעיפים אופקי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק אגר פני השטח הגבי של האונה כל קליפת המוח כדי vibratome צ&#39;אק, ולאט לאט למלא את האמבט קר כקרח ACSF. פורסים מפני השטח הגחון ב 300 סעיפים מיקרומטר, העברת כל סעיף כדי התחמם (34-36 ° C) ACSF מחומצן, ולאפשר להם להתאושש במשך 30-45 דקות. </li></ol> חלק ב &#39;: מדידה תיקון Loose הסף את ספייק <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהביא את פרוסות לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, בעדינות במקום פרוסת בחדר הקלטה של ​​החדר תחת מיקרוסקופ טפטוף מתמיד של ACSF מחומצן. בסיכון יתר מגרה נוירונים ChR2 נגוע, בנוכחות EYFP-ChR2 ניתן לאשר תחת epifluorescence (איור 2a) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודות זכוכית על חולץ פיפטה (סאטר P-97). מילוי זה אלקטרודה עם ACSF. כאשר הניח באמבטיה ACSF ההתנגדות טיפ צריך להיות בין 70-10 MOhms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תאורה פלורסנט, לאתר הפרוסה תא עצב בריא ChR2-EYFP עם מורפולוגיה בשלה. כמו כן לאתר סומה של נוירון תחת אופטיקה תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם לחץ חיובי קל עבר קצה האלקטרודה, מנמיכים את האלקטרודה תיקון כלפי הנוירון פלורסנט מזוהה. כאשר איש הקשר קרום מורכב, במהירות לשחרר לחץ חיובי וליישם כמות קטנה וקצרה של יניקה דרך קצה. חותם גיגה אוהם צריך להיעשות בין הממברנה פלזמה קירות אלקטרודה את התיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם אם גיגה חותם לא נוצר, אם האלקטרודה הוא מספיק קרוב פעילות הנוירון פלורסנט spiking צריך לייצר פוטנציאל למדידה בשדה המקומי. הפעל ChR2 בנוירון הזה מהבהב על ידי מינונים שונים של אור. בגלל אור במינון היא פונקציה של כוח הן LED ומשך, לחשב כמה הרבה אור יש צורך לעורר פוטנציאל פעולה בכל כוחות מרובים המשכים (איור 2b). כמו כן לצפות כמה spiking מתרחשת תחת אור מנורת כספית. </li></ol> 3. נציג תוצאות: על מיקרוסקופ שלנו (אולימפוס BX51WI), LED שלנו היא iקו n עם 2 פתחים ו עדשה הקבל, ובכך שמירה על lightpath המקורי של המנורה, מפעל מותקנת קשת. על ידי סגירת שני הסרעפת שדה הסרעפת aperature, אנחנו יכולים להשיג ניגודיות brightfield מספיק מהדק הקלטות התיקון (איור 1b). עם דיאפרגמה כל במלואה לפתוח לנו לחשוף את הפרוסה לשלטון האור המרבית channelrhodopsin ההפעלה (איור 1 א). על מיקרוסקופ שלנו, זו תצורה תיקון מייצרת אור כי צפיפות הוא כ שלושה סדרי גודל נמוך יותר צפיפות השדה המקסימלי מלא (4.1 μW / 2 מ&quot;מ לעומת 6.88 mW / מ&quot;מ 2). אנו רואים תיוג החזקה של גרגיר מבוגר יליד נורת חוש הריח ועל נוירונים periglomerular שבועות לאחר ההדבקה lentiviral של נודדות neuroblasts בזרם נודדות מקורי (איור 2a) הקלטה רופף-תיקון מ יחיד מבוגר יליד ChR2-EYFP להביע תא גרגיר מציינת כי 5 ms גירוי על האימרהאממ כוח (6.88 mW / מ&quot;מ 2) מספיקה כדי לעורר spiking (איור 2b). מאז רמת הביטוי משתנה בין התאים, את כמות האור שעוברת את הסף אל ספייק ישתנו וצריך תיאר סטטיסטית לכל סוג תא של עניין. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. LED הגדרת מערך עבור photostimulation מלא שדה תיקון-clamp electrophysiology פרוסה. כדי להפעיל channelrhodopsin (ChR2) אנו פרוייקט קרן collimated בחזרה דרך פתחים פתוחים אופטיקה מעבה (א). תצורה זו ניתן לשנות לתוך ניגודיות גבוהה אופטיקה תיקון מלא על ידי סגירת הסרעפת שדה רוחב ויסות של הסרעפת שדה (ב). קיצורים: א מאוורר, גוף קירור ב, מערך LED ג, ד collimating העדשה, ה ראי, דיאפרגמה ו שדה, הסרעפת ז הצמצם, העדשה הקבל ח, ט saבשלב mple, י אובייקטיבי. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="איור 2" /> באיור 2. מקדימה של פרוסת אופקי 300μm של הנורה חוש הריח של מהדק תיקון כל שדה photostimulation (א). נגוע Lentivirally מבוגר יליד תאים גרגיר להביע ChR2-EYFP ניתן לראות מקרין מליבה של הנורה חוש הריח. האור במינון הנדרש לעורר spiking ניתן למצוא על ידי הגדלת משך הזמן של פלאש LED (ב). סף עבור תא זה היה גרגיר 5ms בעצימות LED מלאה (2.43mW/mm 2). סולם ב (א) = 500μm, היקף (ב) = 50ms.

<ol>
	<li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb.">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li><li>Apicella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+Cells+in+Piriform+Cortex+Receive+Convergent+Input+from+Distinct+Olfactory+Bulb+Glomeruli.">Pyramidal Cells in Piriform Cortex Receive Convergent Input from Distinct Olfactory Bulb Glomeruli.</a> Journal of Neuroscience. 30, 14255-14260 (2010).</li><li>Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature. 8, 1263-1263 (2005).</li><li>Bardy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=where+new+inhibitory+neurons+release+neurotransmitters+in+the+adult+olfactory+bulb.">where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience. 30, 17023-17034 (2010).</li><li>Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+the+first+synapse+in+olfaction:+development+and+adult+neurogenesis.">Functional maturation of the first synapse in olfaction: development and adult neurogenesis.</a> The Journal of neuroscience. 28, 2919-2932 (2008).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit-breakers:+optical+technologies+for+probing+neural+signals+and+systems.">Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and systems.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 577-581 (2007).</li><li>Grossman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+optical+excitation+using+ChR2+and+micro-LED+array.">Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array.</a> Journal of neural engineering. 7, 16004-16004 (2010).</li><li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse.">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li><li>Weick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+control+of+transplantable+human+ESC-derived+neurons+via+optogenetic+targeting.">Functional control of transplantable human ESC-derived neurons via optogenetic targeting.</a> Stem cells. 28, 2008-2016 (2010).</li><li>Toni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+born+in+the+adult+dentate+gyrus+form+functional+synapses+with+target+cells.">Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells.</a> Nature Neuroscience. 11, 901-907 (2008).</li><li>Grubb, M. S., Burrone, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+Localised+to+the+Axon+Initial+Segment.">Channelrhodopsin-2 Localised to the Axon Initial Segment.</a> PLoS ONE. 5, e13761-e13761 .</li><li>Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+circuitry+mediating+reversible+and+bidirectional+control+of+anxiety.">Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety.</a> Nature. 471, 358-362 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בשנים האחרונות אנו עדים התפוצצות הפופולריות של כלים optogenetic עבור מחקר המוח 6. כתוצאה מכך, חשוב יותר ויותר כדי להוריד את מחסום הכניסה עבור מעבדות המעוניינים להתחיל להשתמש בכלים חדשים אלה. כאן אנו מתארים כיצד לנהל retrofitting עלות פשוט נמוך כיול של המתקן תיקון-clamp קונבנציונאלי, כך שניתן לעשות שדה מלא גירוי אופטי של channelrhodopsin-לבטא נוירונים. בפרט, אנו מיישמים את הטכניקה הזאת כדי לחקור את חוש הריח של neurogenesis מבוגר נורה במיוחד כדי לשלוט נוירונים שזה עתה נולד עם אור. אנו מדגימים כיצד לקבוע אם מקור אור LED מייצרת מספיק כוח להפעלת ChR2, ולהדגים כיצד המהירה מהותית on / off מהירות של נוריות יכול בקלות לווסת את המינון של אור שניתן נוירונים. בעוד במעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בטכניקה זו, יש דרכים חלופיות חשיפת נוירונים מינונים מבוקרים של אור בכל wהיתרונות שלו והחסרונות שלו ith. אם הכוח האופטי יותר יש צורך, מנורות כספית רבים יפיק הרבה יותר אור מאשר מערך LED, וקובע אובייקטיבי מסנן של מיקרוסקופ כבר כיום למקד את אורכי הגל הרצוי על המדגם. עם זאת, פתרון זה לא את הכוח ולא את משך החשיפה ניתן לשלוט בקלות. משך החשיפה היה צריך להיות נשלט על ידי תריס חיצוני, ואלה בדרך כלל יקר יותר מאשר מערך LED, והכוח היה צריך להיות נחלש ידי הוספת פילטרים צפיפות נייטרלי נתיב האור - בסיכון של גרימת תנודות כי יפחית שיעור ההצלחה של תיקון-clamp ניסויים. יישום שלנו גם עושה את זה קשה לשלוט על היקף המרחבי של תאורה. אם התאורה במקום רצוי למקד קבוצות ספציפיות של נוירונים ChR2 להביע, פתרון אחד הוא לסרוק כתם לייזר עם מראה galvometer סריקה שוניםמקומות על הפרוסה. בשלב זה, עם זאת, מיקרוסקופ מתחיל להידמות מיקרוסקופ confocal קונבנציונאלי במורכבות והן בעלויות. חלופה שפותחה לאחרונה היא למקד את התמונה של מערך מיקרו הובילה על מדגם 7, או לעצב את שדה אחיד של עירור עם מכשיר micromirror דיגיטלית 8. מערכי LED יש יתרונות ברורים שהופכים אותם מתאימה באופן ייחודי לגירוי channelrhodopsin. מהירות on / off שלהם מתרחשת על לוחות הזמנים שבריר שנייה ולכן זה מהירות יכול לשמש היטב לכוון את משך החשיפה לאור על רקמות ביולוגיות. בנוסף, צבע של נוריות ניתן לבחור כדי להתאים להקות עירור מסוים ללא צורך בסינון. עם כניסתו של האדומים עבר מוטציות channelrhodopsin, זה יהיה פשוט להשתמש בשני נוריות בצבעים שונים בנפרד לרגש שתי אוכלוסיות שונות של נוירונים. לחלופין, מערכי LED לבן - כמו זה המשמש בדוח זה המשלבת כחול (450nm peak) וירוק (550nm שיא) דיודות גליום ניטריד - יש ספקטרום רחב אשר נותן החוקר את החופש היעד מגוון רחב של להקות עירור. לאחר כיול אופטי, כל סוג תא שמבטא channelrhodopsin חייב להיות מאופיין על מנת לקבוע כיצד אור רב נדרש כדי לעורר פוטנציאל פעולה. אנו מתארים אפיון אלקטרו פשוט בשיטת רופף-תיקון, אשר יש את היתרון של הימנעות הדינמיקה המשתנה של התא הפנימי עם פתרון פיפטה. עם זאת, במחקר מלא כל תא הקלטות נחוצים כדי לקבוע כמה אור מייצרת כמות נתונה של שלילת קוטביות, ואת היציבות של אלו הפוטנציאלים עורר לאורך זמן. למרבה הצער, את הרגישות של spiking פעילות למינון האור תלויה במספר פרמטרים מחוץ לשליטת ניסיוני. אלה כוללים את רמת הביטוי ChR2 (פונקציה של מספר עותק לבנות תקנה התפתחותי של הנשף ויראליoter), וכן את המאפיינים biophysical הפנימי של הנוירון 9. עוצמת הניאון של היתוך ChR2-EYFP עשוי להיות אינדיקטור של כמה הרבה אור יש צורך להביא את הנוירון לסף. עם זאת, ישנם nonlinearities בסוג כזה של הערכה הנגרמת על ידי אגרגטים הפנים של הערוץ, ועל ידי הסטת conductances הנגרמת על ידי הפעלת ערוצי דיסטלי לאזור ספייק חניכה. בסופו של דבר, לכל סוג של תא עצב אפיון סטטיסטי של האוכלוסייה תצטרך להתבצע. זה סובל עבור אזהרה כי תאים פלורסנט במעומעם קשה תיקון, וכך בונה ויראלי עשויים להפיק תועלת תווית פלורסנט נוסף מוגבל גופנית 10. זה ברור מיותר תיקון תא עצב נגוע ChR2 אם האור יכול לשמש כדי לשלוט בפעילות spiking שלה. שימוש טוב יותר optogenetics חוץ גופית היא לחקור את הקישוריות הסינפטית של optogeneticallyממוקד לאוכלוסייה עם חברים אחרים של המעגל. בידיים שלנו, יש לנו מצמידים גירוי בשדה מלא ChR2 מבוגר יליד תאים גרגר עם הקלטות מהדק תיקון מתאי מיטרלי למדוד את המאפיינים של הסינפסה החדש שנוצר בין שני סוגי התאים 4. כי ההסתברות של קישוריות בין גרגיר אחד של התא מיטרלי הוא נמוך מאוד, הניסוי שלנו היה אפשרי רק על ידי הפעלה בו זמנית של מאות רבות ChR2 להביע תאים גרגר. גילוי העתיד של סמנים גנטיים חדשים חדש שיטות משלוח ויראלי לתייג אוכלוסיות נוירונים ספציפיים יגביר את השימושיות של חוץ גופית optogenetics במערכות שונות. בפרט, הטכניקה הזו הוא אידיאלי לגלות קשרים דליל אבל חזק בין תת נוירונים צפוי 11,12. ככל מגוון שימושים עבור טכניקה זו גדל, כך יהיה צורך בחומרה פשוטה וזולה כדי לשלוט את האור מועברת על גבי פרוסות חוץ גופית.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Type</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue No.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>Imalg&egrave;ne 1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>2%</td>
			<td>Rompun</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbps;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>S5886</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>P5405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>M1880</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>S5761</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>S5011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>G7021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>C7902</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma </td>
			<td>A9539</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries</td>
			<td>1.5 mm O.D./1.17 mm I.D.</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150T-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED array</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bridgelux</td>
			<td>BXRA-C2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collimating lens</td>
			<td>40 mm beam diameter</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDC1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>2.8 amp</td>
			<td>A1W Electronik</td>
			<td>HKO2800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>PM 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatsink </td>
			<td>Silent Boost K8</td>
			<td>Thermaltake</td>
			<td>A1838</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fan</td>
			<td>Silent Boost K8</td>
			<td>Thermaltake</td>
			<td>A1838</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using affordable led arrays for photo-stimulation of neurons

Electrophysiology פרוסה רגילה אפשרה לחוקרים לחקור רכיבים בודדים של המעגלים העצביים על ידי הקלטה התגובות החשמלית של תאים בודדים בתגובה 1,2 מניפולציות חשמלי או תרופתי. עם המצאת שיטות בקרה אופטית נוירונים ממוקד גנטית (optogenetics), חוקרים כעת יש רמה חסרת תקדים של שליטה על קבוצות ספציפיות של נוירונים בהכנת פרוסה רגילה. בפרט, רגישים channelrhodopsin-2 (ChR2) מאפשר לחוקרים להפעיל נוירונים עם 3,4 אור. על ידי שילוב של כיול מדוקדק של photostimulation מבוססי LED של ChR2 עם electrophysiology פרוסה סטנדרטיים, אנו מסוגלים בדיקה עם בפירוט רב יותר את תפקיד המבוגר יליד interneurons ב הנורה חוש הריח, את ממסר המרכזי הראשון של מערכת חוש הריח. שימוש בביטוי ויראלי של ChR2-YFP במיוחד מבוגר, יליד נוירונים, אנחנו יכולים לשלוט באופן סלקטיבי צעיר מבוגר, יליד הנוירונים בסביבה של מבוגריםד נוירונים בוגרים. שליטה אופטית שלנו משתמשת במערכת LED פשוט וזול, ואנחנו מראים כיצד מערכת זו יכולה להיות מכויל כדי להבין איך הרבה אור היא צריכה לעורר spiking פעילות נוירונים בודדים. לפיכך, הבזקים קצרים של אור כחול יכול לשלוט מרחוק את דפוס ירי ChR2-transduced תאים שזה עתה נולד.

Watch this Scientific Journal Video about Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons at JoVE.com

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

למבוגרים יליד נוירונים להביע ChR2 ניתן לטפל בהכנות פרוסה אלקטרו על מנת לבחון את תרומתם כלפי פונקציה של מעגלים עצביים חוש הריח.

באמצעות מערכי LED משתלמת עבור גירוי-תמונה של נוירונים

Standard slice electrophysiology has allowed researchers to probe individual components of neural circuitry by recording electrical responses of single ...

using-affordable-led-arrays-for-photo-stimulation-of-neurons

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.5K Views.  Institut Pasteur and Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). למבוגרים יליד נוירונים להביע ChR2 ניתן לטפל בהכנות פרוסה אלקטרו על מנת לבחון את תרומתם כלפי פונקציה של מעגלים עצביים חוש הריח.

Video: Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Larval zebrafish are emerging as a model for describing the development and function of simple neural circuits. Due to their external fertilization, rapid development, and translucency, zebrafish are particularly well suited for optogenetic approaches to investigate neural circuit function. In this approach, light-sensitive ion channels are expressed in specific neurons, enabling the experimenter to activate or inhibit them at will and thus assess their contribution to specific behaviors. Applying these methods in larval zebrafish is conceptually simple but requires the optimization of technical details. Here we demonstrate a procedure for expressing a channelrhodopsin variant in larval zebrafish somatosensory neurons, photo-activating single cells, and recording the resulting behaviors. By introducing a few modifications to previously established methods, this approach could be used to elicit behavioral responses from single neurons activated up to at least 4 days post-fertilization (dpf). Specifically, we created a transgene using a somatosensory neuron enhancer, CREST3, to drive the expression of the tagged channelrhodopsin variant, ChEF-tdTomato. Injecting this transgene into 1-cell stage embryos results in mosaic expression in somatosensory neurons, which can be imaged with confocal microscopy. Illuminating identified cells in these animals with light from a 473 nm DPSS laser, guided through a fiber optic cable, elicits behaviors that can be recorded with a high-speed video camera and analyzed quantitatively. This technique could be adapted to study behaviors elicited by activating any zebrafish neuron. Combining this approach with genetic or pharmacological perturbations will be a powerful way to investigate circuit formation and function.

Optogenetic techniques have made it possible to study the contribution of specific neurons to behavior. We describe a method in larval zebrafish for activating single somatosensory neurons expressing a channelrhodopsin variant (ChEF) with a diode-pumped solid state (DPSS) laser and recording the elicited behaviors with a high-speed video camera.

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

הדמיה קוצים הדנדריטים של העכברוש הראשי נוירונים בהיפוקמפוס באמצעות מובנה תאורה מיקרוסקופית

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). Although mouse models of tauopathy have provided a valuable resource for investigating the neurotoxic mechanisms of aggregated tau, it is becoming increasingly apparent that, due to interspecies differences in neurophysiology, the mouse brain is unsuitable for modeling the human condition. Advances in cell culture methods have made human neuronal cultures accessible for experimental use in vitro and have aided in the development of neurotherapeutics. However, despite the adaptation of human neuronal cell cultures, in vitro models of human tauopathy are not yet widely available. This protocol describes a cellular model of tau aggregation in which human neurons are transduced with lentiviral-derived vectors that code for pathogenically mutated tau fused to a yellow fluorescent protein (YFP) reporter. Transduced cultures produce tau aggregates that stain positively for thioflavin and display markers of neurotoxicity, such as decreased axonal length and increased lysosomal volume. This procedure may be a useful and cost-effective model for studying human tauopathies.

This protocol details a procedure in which human neuronal cultures are transduced with lentiviral constructs coding for mutant human tau. Transduced cultures display tau aggregates and associated pathologies.

מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of scientific and clinical development. The use of flexible polymer electrode arrays can support long-lasting recording, but the same mechanical properties that allow for longevity of recording make multiple insertions and integration into a chronic implant a challenge. Here is a methodology by which multiple polymer electrode arrays can be targeted to a relatively spatially unconstrained set of brain areas.
The method utilizes thin-film polymer devices, selected for their biocompatibility and capability to achieve long-term and stable&#160;electrophysiologic recording interfaces. The resultant implant allows accurate and flexible targeting of anatomically distant regions, physical stability for months, and robustness to electrical noise. The methodology supports up to sixteen serially inserted devices across eight different anatomic targets. As previously demonstrated, the methodology is capable of recording from 1024 channels. Of these, the 512 channels in this demonstration used for single neuron recording yielded 375 single units distributed across six recording sites. Importantly, this method also can record single units for at least 160 days.
This implantation strategy, including temporarily bracing each device with a retractable silicon insertion shuttle, involves tethering of devices at their target depths to a skull-adhered plastic base piece that is custom-designed for each set of recording targets, and stabilization/protection of the devices within a silicone-filled, custom-designed plastic case. Also covered is the preparation of devices for implantation, and design principles that should guide adaptation to different combinations of brain areas or array designs.

Described below is a method for implantation of multiple polymer electrode arrays across anatomically distant brain regions for chronic electrophysiological recording in freely moving rats. Preparation and surgical implantation are described in detail, with emphasis on design principles to guide adaptation of these methods for use in other species.

השרשה כרונית של מערכים גמישים אלקטרודה מרובים

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...