עבודה זו נתמכה על ידי מימון הרפואה והבריאות מענק מחקר מן העיר של פריז, צרפת הלאומי מענק ANR-09-JCJC-0118-1, ואת ERC גרנט החל פרויקט RNAvirusPopDivNVax לא. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בחירת קו התא. היעילות של אנלוגים בסיס כמו רנ&quot;א מוטאגנים בקורלציה עם ספיגת היחסי שלהם על ידי תאים מסוגים שונים 11. אם קו התא המשמש בדרך כלל למעבר הנגיף מוכיחה להיות עקשן mutagen ספיגת או רגיש מדי (רעילות לתא גבוה), ייתכן שיהיה צורך להשתמש עוד קו התא עומד בדרישות אלה ועדיין מתירני כדי שכפול נגיפי. לאחר גרסה התנגדות mutagen מבודד, שאר האפיון יכול להתבצע בקו, מקורי התא המועדף. מניסיוננו, תאים הלה בקלות לקחת את mutagen; תאים BHK לדרוש עד 10 פי ריכוזים גבוהים יותר ותאי Vero הם עקשן ספיגת mutagen. בחירת mutagen. בניסיון לבודד גרסאות נאמנות על ידי טיפול mutagen, את סיכויי ההצלחה הוא גדל אם יש יותר מסוג אחד של mutagen משמש. מאגר מוטאגנים אנלוגי של מבנה שונה, כי הם שולבו בטעות לתוך הגנום במהלך שכפול יהיה בעיקר לגרום לגרום משנה מסוים של מוטציות מחזורי שכפול הבאים: טיפול ribavirin טובות GtoA ומוטציות CtoU המעבר 12: 5-azacytidine יש הטיה דומה, עם תוספת של CtoG ו transversions GtoC 13: 5-fluorouracil מעדיפים גורם מעברים AtoG ו UtoC 14. לחלופין, ריכוזים גבוהים יותר של Mg 2 + או Mn 2 + ניתן להוסיף עד בינוני, כדי להגביר את תדירות מוטציה הכולל של וירוסים RNA ללא משוא פנים המתואר לעיל 12. בהתאם קודון רצפים של וירוס, ואת השינויים קודון הנדרש כדי לייצר גרסה נאמנות, חלקם של תנאים אלה תעדיף את הופעתה של גרסה זו על פני אחרים. במשך יותר נאמנות poliovirus G64S ו Coxsackie וירוס A372V, טיפול ribavirin נבחר בקלות ביותר עבור גרסאות כי המעבר AtoG נדרש באתר קודון תאמו את המוטציות שנוצרו בעיקר על ידי זה ribavirin. משרד הפנים לעומת גודל האוכלוסייה. ב וירולוגיה, פרוטוקולים זיהום בתרבית רקמה לשים לב במיוחד ריבוי של זיהום (משרד הפנים), כדי למנוע הצטברות של חלקיקים פגום להתערב (נמוך משרד הפנים), או לקדם רקומבינציה בין וירוסים (גבוה הפנים), עבור דוגמה. כדי לבחור לאירועים הופעתה מעל סדרתי passaging, חשוב גם לשקול את גודל האוכלוסייה וירוס. מאז מוטנטים עמידים בתחילה קיים בתדר נמוך, עדיף להעביר גדולים כמו גודל האוכלוסייה ככל האפשר מעבר אחד למשנהו (10 -10 5 6 וירוסים, למשל) כדי להימנע מאיבוד אלה גרסאות המתעוררים במעבר אחד. דרוג את גודל טוב או בקבוק (מספר תאים נגועים) עשויה לעזור לצמצם את הגידול הפנים אם זה של דאגה. מצד שני, עבור ניסויים שבהם הרגישות של וירוס mutagen נבחנת, זיהום נמוך הפנים מתבצע על מנת להגדיל את מספר מחזורי שכפול המתרחשים הניסוי ולהימנע ההצלה של הגנום mutagenized ידי הגנום כושר גבוה דרך השלמה של שיתוף תאים הנגועים. זה חשוב מכיוון שנוצר על מוטציות בגנום צאצאים במהלך הסיבוב הראשון של שכפול לא יזוהו מיד. רוב אלה RNAs mutagenized עדיין יהיה ארוז לתוך virion. זה בסיבוב הבא של זיהום כי מוטציות קטלניות נוכח הגנומים הללו תגרום מחזור השכפול בוטלה, וצמצום titer וירוס. זה עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר כמה סיבובים של הצטברות מוטציות לפני השפעה משמעותית של mutagenesis קטלני הוא ציין. לבסוף, אם על הסדרה מעבר בנוכחות mutagen, titers וירוס ממשיכים לרדת עד הכחדה, אז החוקר צריך לנסות passaging וירוס בהדרגה כמויות mutagen (החל בריכוז נמוך מאוד). בידוד של הדור המשובט RNA mutagen עמידים מן האוכלוסייה RNA mutagen עמידים. מוטאגנים RNA להציג מוטציות אקראיות מרובים כל הגנום, אבל הבחירה בהתנגדות רק להעשיר (לתקן את רצף קונצנזוס) המוטציה התנגדות. כדי לזהות את המוטציה, אנו רצף האוכלוסייה עמידים mutagen (הקונסנזוס של האוכלוסייה) ולא וירוסים בודדים. לפיכך, יחיד, שנוצר על ידי מוטציות אקראיות mutagen לא מזוהים ברצף, רק מוטציות הגורמות לשינויים קונצנזוס הבאים הבחירה, נמצאים. מניסיוננו אנו מזהים רק אחד או שניים כאלה ברצף שינויים קונצנזוס. ברגע האוכלוסייה עמידים mutagen מתקבל ואת מוטציה ההתנגדות מזוהה, יש צורך ליצור מלאי טהור יותר של גרסה זו. מעל תיארנו תהליך טיהור פלאק. לחילופין, אם וירוס של עניין אינו מייצר לוחות לזיהוי בקלות, הגרסה הרצויה ניתן purified ידי הגבלת דילול. גישה זו היא למעשה 50 TCID בפורמט 96-היטב, שם המניות וירוס הוא מדולל כזה פחות מ -50% בארות נגועים. שימוש דילול, גישה זהה לעיל נלקח, לבודד עד 10 גרסאות הפרט המאשר רצפים שלהם. כאמור, במקרה הטוב, שיבוט cDNA זיהומיות של זן הנגיף זמין. בידוד של גרסה ולכן לא היה צורך. מניסיוננו, גרסאות נאמנות הן תוצאה של החלפות יחיד חומצת אמינו ולכן יכול להיווצר תוך שימוש פשוט, ערכות mutagenesis ממוסחר כמו Quikchange (Agilent). אפשרות משנית היא להשתמש שיבוט cDNA של זן קשורה קשר הדוק. עם זאת, אם זן הקשורות בשימוש, מומלץ מאוד להשתמש גם גישה זו בידוד הנגיף (טיהור פלאק למשל) כי יש לנו גילו כי מוטציה זהה נאמנות שינוי על שני וירוסים קשורה קשר הדוק לא בהכרח יש את אותו אפקט. פידליטי ו. שכפול מבחר גרסאות RNA mutagen עמידים גרמו לבידודה של שתי גרסאות גבוהים או נמוכים יותר נאמנות עם מאפיינים צמיחה דומים עמיתיהם בטבע שלהם סוג 4,12,15. נכון לעכשיו, הקשר בין פעילות שיעורי פולימראז ונאמנות לא מובנת לחלוטין. במבחנה מחקרים ביוכימיים באמצעות RNA פולימראז מטוהר הראו כי גרסאות נאמנות גבוהה יש שיעורי עיבוד איטי יותר, ואילו גרסאות נאמנות נמוכה נוטים להיות עיבוד מהיר יותר 1-3,12. בתרבות רקמות, הבדלים אלה לא ברור כלל, מה שמראה כי הזמינות של משאבים, ולא מהותי בפעילות קינטיקה פולימראז, הוא שיעור הגבלת צעד. אם גרסה נאמנות משכפל עם קינטיקה שאינם שונים באופן משמעותי מן סוג בר, אז השוואה של תדרים המוטציה שלהם יכול להתבצע ישירות. אם שינוי משמעותי מאוד קינטיקה שכפול קיים, אז הנתונים צריך להיות מנורמל להסביר הבדלים קינטית, למשל על ידי השוואת וירוסים שעברו את אותו מספר של מחזורי שכפול. מניסיוננו, אם כי אין הבדלים משמעותיים צעד אחד קינטיקה צמיחה נצפו בין סוג בר גבוה גרסאות נאמנות, אנו ציין כי גרסאות נאמנות גבוהה באופן עקבי כייל גבוה יותר (בתוך יומן 1) לעומת סוג פרוע אבל הם עושים מעט פחות RNA (בתוך באותו סדר גודל), נוסף המצביע על כך הגנום שהם מייצרים מכילים פחות מוטציות הן ובכך, מדבקות ועוד. הכנת המדגם וסדר. במשך כל השלבים פרוטוקולים אלה, קיים הכרח כי באיכות גבוהה, הוכחה קריאה אנזימים משמשים PCR ו - RT-PCR להגביל החדרת מוטציות נוספות מאחר שלא ניתן להבחין בין מוטציות רלוונטי מבחינה ביולוגית. זה קריטי, כי האוכלוסיות וירוס להשוות הוכנו באותם תנאים (היסטוריה המעבר, תרבות בינוני רקמה, טמפרטורה, שיטת השאיבה RNA, RT-PCR פרוטוקולים, וכו &#39;) כמו כן, חשוב להבטיח כי מספיק חומר המוצא היתה המתקבל מיצוי RNA כזה להקה חזק שנוצר על ידי RT-PCR. דילול 1 / 100 של המדגם RNA צריך גם לתת להקה לזיהוי RT-PCR, המציין כי המדגם מכיל מספר מספיק של מולקולות RNA כדי למנוע הטיה בייצוג (הגברה הגנום אותו שוב ושוב). מאז תדירות מוטציה היא ההפצה, ניתן היה לצפות כי ערכים דומים יושג ללא קשר לגודל האוכלוסייה, בתנאי הטיה הנ&quot;ל לא מתרחשת. כמו איור 6 מראה, 10 5 פי דילול של מניות וירוס נותן תדירות מוטציה שאינה שונה באופן משמעותי ממלאי ההורים. עד תנאים אופטימליים TopoTA שיבוט נמצאים, לאשר את קיומו של מוסיף לאחר ההקרנה כחול / לבן, על ידי מושבת PCR לפני ריצוף. כמו שליטה על רעש מוטציוני (מוטציות הציג RT-PCR וסדר), שיבוט מוצר PCR מן הנושא פלסמיד רצף ויראלי אותו ו / או לשכפל ו RT-PCR מוצרים רצף ב RNA במבחנה עיבד המתאים הגנום וירוס (להיות מודע לכך אנזימים שונים במבחנה תעתיק יש שיעור שגיאה שונות לא יכול לתת מידע שימושי כמו טעות הרקע האמיתי בהליך שלך). כמה רצפי הנגיף עלול להיות רעיל חיידקים, ולכן חשוב לוודא זאת לפני שתחליט על האזור של הגנום הנגיפי להיות רצף של תדירות מוטציה. בניתוח רצפים מתקבל על ידי TopoTA, לציין כי שיבוט זה אמור להכיל רק אחד להכניס / רצף. אם שיא כפול הוא ציין, דבר המצביע על אוכלוסייה מעורבת, זה אפשרי, כי שני מושבות חיידקים השכנות נבחרו. אפשר גם, אם כי מאוד לא סביר בהתחשב התדרים מוטציה נמוך שכפול חיידקים, כי המוטציה הוצג במהלך הגברה של פלסמיד בתרבות חיידקי. ב p פלאקurified אוכלוסיות, שיא כפול עשוי לייצג הפלאק חופפים, או וירוס כי היא רוכשת מוטציה חדשה או מביטול מוטציה במהלך התפתחות פלאק. היו עקביים להחליט אם למנות או לא למנות אלו מוטציות. לבסוף, יש לזכור כי את התדרים מוטציה משמש כאן הם ערכים יחסיים. הם תקפים רק בהשוואת אוכלוסיות וירוס גדלו בתנאי זהה, רצף על האזור אותו! הם לא צריכים להיחשב ערכים מוחלטים של שיעור המוטציות, או תדירות מוטציה של הגנום כולו. עם זאת, כאשר תנאי נשלטים, הם מתירים לשחזור, השוואות כמותיות של הבדלים בהתפלגות מוטציה ותדירות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> ribavirin </td><td> סיגמא </td><td> R9644-10 מ&quot;ג </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracil </td><td> סיגמא </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacytidine </td><td> סיגמא </td><td> A2385-100mg </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> M1028-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> סיגמא </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> סיגמא </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA שיבוט ערכת </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> Quikchange mutagenesis ערכת </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> אם שיבוט cDNA זיהומיות זמין </td></tr><tr><td> 96-היטב miniprep ערכת </td><td> Macherey-נגל </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> יישור או תוכנות אחרות </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

וירוסים RNA להשתמש RNA polymerases תלוי רנ&quot;א לשכפל הגנומים שלהם. שיעור גבוה של טעות מהותית של אנזימים אלו הוא תורם גדול לדור של גיוון אוכלוסיה קיצונית המאפשרת הסתגלות ואבולוציה וירוס. הגדלת הראיות עולה כי שיעורי שגיאה מהותית, ועל תדרים מוטציה וכתוצאה מכך, של וירוסים RNA יכול להיות מווסתת על ידי שינויים עדינים חומצת אמינו ל פולימראז נגיפי. למרות מבחני ביוכימי קיימים כמה polymerases נגיפי RNA המאפשרים למדוד כמותית ההתאגדות נאמנות, כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת תדרי מוטציה של וירוסים RNA אשר הוכיחה להיות מדויקת ככל גישות ביוכימיות בזיהוי מוטציות נאמנות שינוי. הגישה משתמשת בטכניקות virological וסדר קונבנציונאלי שניתן לבצע במעבדות לביולוגיה ביותר. בהתבסס על הניסיון שלנו עם מספר רב של וירוסים שונים, זיהינו את הצעדים המפתח חייב להיות מותאם כדי להגדיל את הסיכוי של בידוד גרסאות נאמנות להפקת נתונים של מובהקות סטטיסטית. בידוד ואפיון של מוטציות נאמנות שינוי יכול לספק תובנות חדשות על מבנה ותפקוד פולימראז 1-3. יתר על כן, אלה גרסאות נאמנות יכולה להיות כלי שימושי באפיון מנגנונים של הסתגלות ואבולוציה וירוס 4-7.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency at JoVE.com

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

המאמר הנוכחי מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לבודד ולאפיין RNA פולימראז גרסאות נאמנות RNA של וירוסים וכיצד להשתמש בתדר נתונים מוטציה כדי לאשר את השינויים נאמנות בתרבית רקמה.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

isolation-fidelity-variants-rna-viruses-characterization-virus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.5K Views.  Institut Pasteur. המאמר הנוכחי מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לבודד ולאפיין RNA פולימראז גרסאות נאמנות RNA של וירוסים וכיצד להשתמש בתדר נתונים מוטציה כדי לאשר את השינויים נאמנות בתרבית רקמה.

Video: Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...