הכנת מורסה מיקובקטריום משובצת חרוז אגר לחיסון עכברים בעלי יכולת חיסונית תוך קנה הנשימה

עכברים בדרך כלל עמידים לזיהומים על ידי Mycobacterium abscessus, מה שמסבך את הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה נחוצה מאוד נגד זיהומים ריאתיים. כאן, אנו מתארים שיטה להכנת חיסון וזיהום תוך-קנה שהוכח כגורם לזיהום מתמשך בעכברים בעלי יכולת חיסונית.

יש צורך נואש במודלים עכבריים חזקים של זיהום כרוני ב-Mycobacterium abscessus, פתוגן סביבתי שעדיף להדביק את הריאות. טיפולים רב-תרופתיים לאורך השנה מספקים שיעורי ריפוי נמוכים באופן בלתי מתקבל על הדעת בחולים, בסביבות 50%, ומכאן הצורך בכלים פרה-קליניים לחיזוי כדי לפתח אנטיביוטיקה טובה יותר. עם זאת, עכברים בעלי יכולת חיסונית עמידים בדרך כלל לזיהום ריאתי על ידי M. abscessus. ניסיונות רבים לבסס זיהום מתמשך ב-M. abscessus בעכברים בעלי יכולת חיסונית דווחו בספרות. בין אלה, שיטות המסתמכות על חיידקים משובצים בחרוזי אגר שחוסנו לעכברי C57BL/6 דרך המסלול התוך-קנה הוכחו כמבטיחות ביותר. המגבלה העיקרית של גישה זו היא האתגר הטכני הקשור להכנת חרוזי אגר בגודל הניתן לשחזור ומספרי חיידקים, ואחריהם חיסון תוך קנה הנשימה. כאן, אנו מספקים תחילה תיאור מפורט של פרוטוקול אופטימלי המספק חרוזי אגר טעונים ב-M. abscessus בקוטר אופטימלי ועומס חיידקי הניתן לשחזור. לאחר מכן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של חיסון תוך-קנה הנשימה, המותאם למניעת אובדן חרוזים וחיידקים עקב היצמדות למשטחים של מכשירי החיסון וכדי להשיג שקיעה ריאתית ניתנת לשחזור של M. abscessus משובץ אגר. המטרה היא להבטיח קלות יישום ושחזור מעולה ממעבדה למעבדה.

אפשרויות הטיפול במחלת ריאות Mycobacterium abscessus (Mab) מוגבלות וכוללות משטר רב תרופתי של שנה עם אנטיביוטיקה דרך הפה, פרנטרל ולעיתים בשאיפה, שרובן חסרות פעילות חיידקית אופטימלית וקשורות לרעילות משמעותית 1,2,3,4,5 . יש צורך דחוף בטיפולים קצרים יותר, בטוחים יותר ויעילים יותר. מודלים עכבריים של זיהומים מיקובקטריאליים היו חיוניים בגילוי ואופטימיזציה של תרופות יעילות ומשטרי תרופות ^6,7. עם זאת, ההערכה הפרה-קלינית של אנטיביוטיקה כנגד זיהומי Mab הוכחה כמאתגרת בשל הקושי לבסס זיהומים ריאתיים מתקדמים ומתמשכים בעכברים ^8,9.

הדבקה של זני עכברים בעלי יכולת חיסונית ב-Mab מביאה במידה רבה להתיישבות חולפת ואחריה פינוי מהיר של הפתוגן^10,11. כדי להשיג זיהום כרוני כפי שנצפה קלינית, נעשה שימוש בתרופות משתקות כגון אגרוז או אגר לקידום התמדה ותגובות אימונופתולוגיות לפתוגנים אופורטוניסטיים כגון Pseudomonas aeruginosa או Haemophilus influenza בעכברים בעלי יכולת חיסונית 12,13,14. מודל זה הותאם לאחרונה להשגת זיהום נשימתי כרוני על ידי Mab ATCC 19977 בעכברי C57BL/6N בעלי יכולת חיסונית 15,16,17,18. השיטה גרמה לזיהום מתמשך עד 45 יום לאחר החיסון התוך-קנה עם ~1 × 10⁴ עד 1 × 10⁶ יחידות יוצרות מושבה (CFU), עם שכיחות של זיהום כרוני בקרב עכברים נגועים של 90%-100%¹⁹ והיווצרות גרנולומות מאורגנות סביב חרוז האגר המתפורר¹⁸. נראה כי הטמעת Mab בחרוזים מגנה מפני פינוי מהיר על ידי מערכת החיסון המולדת וכי חרוזים עמוסים בחיידקים מהווים מוקדים לגיוס תאי חיסון המובילים להיווצרות גרנולומות ולהקמת זיהום כרוני¹⁸. חרוזי אגר/אגרוז מהווים חומר ביולוגי אינרטי יחסית הגורם לתגובות דלקתיות מינימליות. בנוסף, החרוזים מתפרקים לאט, ונמנעים מבעיות של תגובות אלרגיות לגוף זר או פיברוזיס מושרה. זיהום תוך-קנה עם או בלי מכשיר מיקרו-ריסוס מבטיח שקיעה יעילה של החיסון לריאות ^8,20,21 ומשחזר חשיפה קלינית וזיהום טוב יותר מאשר חיסון תוך ורידי או תוך-אף.

המודל, אם כן, מציע יתרונות רבים. עם זאת, זה מגיע גם עם כמה אתגרים בעלי אופי טכני, כלומר (i) השגת גודל חרוז הניתן לשחזור, (ii) השגת עומס חיידקי חרוזים הניתן לשחזור, ו-(iii) הבטחת אספקה תוך-קנה עקבית של החיסון. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים להשגת יעדים אלה באופן אמין ולהבטיח שחזור ממעבדה למעבדה.

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ה-NIAID (NIH), בת'סדה, מרילנד. כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. כל המחקרים הכוללים M. abscessus בוצעו במעבדה עם רמת בלימה ביולוגית 2.

1. הכנת חרוז אגר משובץ M. abscessus inoculum

1. הכן תרבית מוקדמת של M. abscessus ATCC 19977 על ידי חיסון 1.5 מ"ל של צפיפות אופטית (OD₆₀₀) 1 (באמצעות ספקטרופוטומטר) לתוך 200 מ"ל של מדיום Middlebrook 7H9 בתוספת 0.05% (v/v) טווין 80, 0.5% (v/v) גליצרול, ו-10% (v/v) העשרת אלבומין-דקסטרוז-קטלאז (ADC).
2. דגרו את התרביות בבקבוק רולר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עד שהגיעו לשלב אמצע העץ (OD₆₀₀ = 0.4-0.6).
3. השעו 1.2 גרם מרק סויה טריפטי (TSB) ב-40 מ"ל מים טהורים במיוחד והוסיפו 0.6 גרם דיפקו אגר לריכוז סופי של 1.5%.
4. מעבירים 60 מ"ל שמן מינרלי כבד לבקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מ"ל ומעקרים גם את השמן המינרלי וגם את אגר הסויה הטריפטי (TSA) ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מאזנים ב-50 מעלות צלזיוס בתנור.
5. דגימת 1 מ"ל של התרבית ומדידת OD₆₀₀.
6. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב -3700 גרם למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש תאים ב-4 מ"ל של 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) כדי להשיג OD₆₀₀ של כ-30.
7. מערבבים 3 מ"ל של תרחיף חיידקים עם 27 מ"ל TSA מותך מאוזן מראש ב-50 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מערבבים במהירות על ידי מערבולת או פיפטינג.
8. יוצקים בזהירות את תערובת החיידקים-אגר (30 מ"ל) לתוך 60 מ"ל שמן מינרלי ומניחים את הבקבוק בכלי משני. מכוונים במהירות את התערובת להסתובב במהירות בינונית (420 סל"ד) על מערבל מגנטי המכוון ל-50 מעלות צלזיוס, באמצעות מוט ערבוב מגנטי. ודא שנוצרת מערבולת גלויה בתערובת השמן-אגר. מערבבים במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
9. מצננים את התערובת על ידי הנחת קרח בכלי המשני וממשיכים לערבב במשך 35 דקות.
10. הפסיקו את הערבוב ותנו לתמיסת חרוזי האגר לנוח במשך 20 דקות (מלאו את הקרח לפי הצורך).
11. העבירו את תערובת התרחיץ לשני צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל ושטפו 10 פעמים בנפח אחד של DPBS כדי להסיר שמן וחיידקים חופשיים (3700 גרם, 6 דקות, 4 מעלות צלזיוס, במשך 5 המחזורים הראשונים).
    1. שלב את מתלי חרוזי האגר לצינור אחד בכביסה השלישית. במהלך 5 מחזורי הכביסה הראשונים, השתמש בצינור סרולוגי כדי להשעות בעדינות את החרוזים.
    2. עבור 5 מחזורי הכביסה הבאים, השתמש בפרמטרי הצנטריפוגה הבאים: 2000 גרם למשך 5 דקות, ואחריו 1000 גרם למשך 4, 3, 2 ו -2 דקות, בהתאמה.
12. השעו מחדש את חרוזי האגר ב-DPBS לנפח סופי של 40 מ"ל, העבירו לבקבוק סטרילי של 125 מ"ל ודללו פי 4 על ידי הוספת 120 מ"ל DPBS.
13. העבירו את המתלה דרך מסננת תאים של 200 מיקרומטר.
    1. חבר את המסננת לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל. לאחר מכן, הוסף חומר לדוגמה על המסננת וסנן את מתלה החרוזים.
    2. כדי להקל על תהליך הסינון, שלב מסננת תאים, משפך, טבעת מחבר וצינור של 50 מ"ל ליחידה. הרכיבו את החלקים לפי סדר המשפך, מסננת התאים, טבעת המחבר וצינור 50 מ"ל, ומשכו לאט את הבוכנה של מזרק 30 מ"ל המחובר לטבעת המחבר.
14. במידת הצורך, שטפו את המסננת מהצד הנגדי עם DPBS כדי לשטוף את כל החרוזים הגדולים יותר שנשארו. רכז את התרחיף המדולל על ידי סיבוב ב-1000 גרם למשך 2 דקות או לאפשר לחרוזים להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר הקטיף, אחסן את חרוזי האגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע. הכנה טרייה מומלצת לכל אצווה של ניסויים.
15. פיפטה 5 מיקרוליטר של מתלה החרוזים על מגלשת זכוכית, כסה אותה בהחלקת כיסוי וצלם תמונות בכמה מיקומים אקראיים באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי עם עדשת אובייקטיבית של 10×. שמור את התמונות ומדוד את קוטר החרוז עם ImageJ (טווח הגדלים הרצוי: 200 ± 50 מיקרומטר).

2. טיטרציה של חרוז אגר משובץ M. abscessus inoculum

1. הוסף 1 מ"ל של תרחיף החרוזים לתוך צינור M והפוך להומוגניזציה אספטית כדי לשחרר חיידקים המוטבעים בחרוזים באמצעות דיסוציאטור המוגדר מראש לתוכנית RNA.02.01 המוגדרת מראש.
2. קח 100 מיקרוליטר מההומוגנט ודלל באופן סדרתי 1:10 עד 1 × ^10-5 דילול. יש לפזר דילולים על אגר 7H10 בתוספת 10% חומצה אולאית-אלבומין-דקסטרוז-קטלאז (OADC) ו-2% גליצרול. יש לספור CFU לאחר 3 עד 5 ימי דגירה.
3. התאימו את טיטר החיסון לפי הצורך. לדוגמה, אם כל עכבר מקבל 100 מיקרוליטר של תרחיף חרוזים המכיל 1 × 10⁵ CFU עד 10 עכברים, מכינים בסך הכל תרחיף של 2 מ"ל המכיל 1 × 10⁶ CFU/מ"ל בתוספת ~25% כדי להסביר הפסדים במזרקים.

3. בדיקת חלוקת חרוזים דרך המזרק והמחט

הערה: השלבים הבאים נכללו כדי להבטיח שהחרוזים לא יידבקו למשטחי המזרק או המחט. נמצא כי חשוב להשתמש במזרק זכוכית ובמחט הזנה ממתכת 24 גרם כדי למנוע אובדן חרוזים עקב היצמדות למשטחי פלסטיק.

1. הכן PBST על ידי הוספת 1.25 מ"ל של Tween סטרילי 80 עד 500 מ"ל של PBS סטרילי.
2. הוסף 900 מיקרוליטר של PBST לחמישה צינורות M לבדיקת חרוזי האגר העוברים דרך מחט ההזנה, כמו גם 900 מיקרוליטר של PBST לצינורות סטריליים של 2 מ"ל כדי להכין -2 עד -6 דילולים של כל דגימת דחיפה.
3. מערבבים את חרוז האגר המוטבע M. abscessus שהוכן קודם לכן באמצעות פיפטה P1000 כדי להבטיח שכל החרוזים מפוזרים באופן שווה.
4. חבר מחט הזנה ממתכת 24 גרם למזרק הזכוכית ושאף את מתלה חרוזי האגר, הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר.
5. לאחר שהמזרק מלא ללא בועות אוויר, הניחו קליפסים או פקקים מניילון על הבוכנה של המזרק, ללא רווח בין הקלפסים. המעצורים מאפשרים חלוקה מדויקת של 50-100 מיקרוליטר. אפשר להתאים עד 6 קליפסים לאורך הבוכנה.
6. הוצא 100 מיקרוליטר של חרוזים ("דחיפה") לתוך צינורות M בסדר שלהם.
7. לאחר שנאספו 5 דחיפות דרך, הומוגניזציה של החרוזים באמצעות דיסוציאטור הרקמה המותאם להגדרת RNA.02.01, מתאים להכנת RNA מאיברים קפואים ואשר נמצא כמשחרר ביעילות את M. abscessus מהחרוזים מבלי להשפיע על כדאיות התא.
8. בצע דילול סדרתי עבור ההומוגנטים בטווח של -1 עד -6. צלחו את הדילולים על צלחות אגר 7H11 בתוספת OADC. ספור CFU לאחר 5 ימים.

4. חיסון תוך קנה הנשימה של עכברים

1. הכן עכברי CD-1 בני 6 עד 8 שבועות.
2. להרגיע את העכברים באמצעות מערכת חשיפה לתרסיס איזופלורן, בקצב זרימה של 1-5%, כמתואר קודם לכן¹.
3. רסנו את העכברים באמצעות מעמד מוטה מודפס בתלת מימד (תלת מימד) (מעוצב ומיוצר בהתאמה אישית). למוט במרכז המעמד יש חוט תפר המחזיק את העכבר אנכית על ידי החותכות שלו, ומציב את העכבר במצב שכיבה גחוני עם ראשו מורם.
4. חבר מחט מתכת להאכלת בעלי חיים 24 גרם למזרק זכוכית מלא בחרוז אגר משובץ M. abscessus. הניחו קליפסים או פקקים מניילון על הבוכנה של המזרק כדי להדביק כל עכבר ב-50 מיקרוליטר של חיסון.
5. לאחר שהעכבר המורדם מרוסן על עקיצת התפר, העבר את הלשון לצד הפה באמצעות מוליך צמר גפן.
6. דמיין את החלק האחורי של פיו של העכבר כדי לזהות בבירור את החלק הלבן בחלק האחורי של הפה ולמקד את קנה הנשימה של העכבר.
7. זווית את מחט המתכת אנכית מעל העכבר והכנס אותה בחלק העליון של קנה הנשימה. תיתכן התנגדות קלה בעת מעבר דרך האפיגלוטיס.
8. החלק את מחט הגוואג' כלפי מטה לתוך קנה הנשימה, הסר את קליפ הניילון או הפקק והוציאו 50 מיקרוליטר של חרוז אגר משובץ M. abscessus.
9. תן לעכבר לנוח במשך 5 דקות וחזור על שלבים 4.2-4.8 בפעם השנייה. מטרת הליך החיסון הדו-שלבי היא להבטיח שקיעה עמוקה וניתנת לשחזור של החיסון המלא בריאה.
10. תנו לזיהום להתקדם במשך 24 שעות, ולאחר מכן העכבר מורדם כדי לספור שקיעת חיידקים בריאות.

גודל ועומס חרוזים
כדי לדמיין חרוזי אגר ועומס החיידקים שלהם, החלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry התבטא תחת מקדם Hsp60 המכונן בזן מסוג Mab ATCC 19977 והטמיע זן זה בחרוזי אגר כמתואר לעיל. איור 1A מציג את טווח גודל החרוזים (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). איור 1B מציג את הנטל של 6 תכשירי חרוזים עצמאיים, המדגים את יכולת השחזור של ההליך כמתואר.

ציפוי דחיפה של מזרק והשתלת חיידקים לאחר חיסון תוך קנה הנשימה
החיסון התוך-קנה עבר אופטימיזציה בשני שלבים. CFU/mL נמנו בחיסון לפני ואחרי המעבר דרך מזרק הזכוכית כדי להבטיח שלא נגרמו הפסדי חרוזים או חיידקים כאשר החרוזים עברו דרך המזרק והצינור המחובר. טבלה 1 מציגה את טיטר החיידקים הראשוני של שני תכשירי חרוזים עצמאיים (ניסויים 1 ו-2) ואת מספר ה-CFU ששוחזר לכל 100 מ"ל של דגימות 'נדחפות' מעומס מזרק יחיד. כדי למנוע אובדן חרוזים וחיידקים, נדרש מזרק זכוכית המחובר לצינור מתכת. חרוזי אגר נוטים להיצמד למשטחי פלסטיק.

ספירת CFU לאורך זמן בהכנת החרוזים הראתה כי העומס החיידקי של החרוזים נשאר יציב ב-4 מעלות צלזיוס למשך שבוע אחד, עם אובדן של ~פי 2 של עומס חיידקי לשבועיים, ושקיעת ריאות ללא פגע. לאחר מכן, קבוצות של 5 עד 8 עכברים נדבקו בשלושה תכשירי חרוזים עצמאיים כדי לבחון את יכולת השחזור של הליך החיסון התוך-קנה הנשימה. טבלה 2 מציגה את מספר ה-CFU של הריאות לעכבר, שנספר 24 שעות לאחר ההדבקה כמתואר.

לבסוף, יכולת השחזור של ההדבקה הוערכה על ידי הדבקה של שלוש קבוצות של 10 עכברי CD-1, כל אחת מבוצעת על ידי מפעיל אחר. CFUs ריאתיים שנמנו 24 שעות לאחר ההדבקה מוצגים באיור 2.

איור 1: ניסוי פיילוט להערכת גודל החרוז, הדמיה וכימות של עומס חיידקי M. abscessus . (A) חרוזי אגר המכילים את הזן M. abscessus ATCC 19977, שתוכננו לבטא את החלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry תחת מקדם hsp60 המכונן. חמישה מיקרוליטר של תרחיף חרוזים נפרסו על מגלשת זכוכית וצולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה (אובייקטיבית פי 10). כל נקודה אדומה היא תא חיידקי פלואורסצנטי, הסגור בתוך חרוזי אגר בקוטר הנע בין ~70-250 מיקרומטר. (B) עומס חיידקים, ב-CFU/mL, של 6 תכשירי חרוזים בודדים המראים את יכולת השחזור של השיטה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: שחזור זיהום בין מפעילים. קבוצות של 10 עכברים נקבות CD-1 נדבקו תוך קנה הנשימה על ידי שלושה מפעילים עצמאיים כמתואר, תוך שימוש באותו הכנת חרוזים. מוצגים CFUs ריאתיים שנמנו 24 שעות לאחר ההדבקה. O1, O2, O3: אופרטורים 1, 2 ו-3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: יחידות יוצרות מושבה (CFU) לכל דגימה של 100 מיקרוליטר לאחר מעבר דרך מזרק הזכוכית ומחט הזנת המתכת.

טבלה 2: השתלת חרוז אגר משובץ M. abscessus בריאות עכבר 24 שעות לאחר החיסון

כדי להבטיח פיזור אחיד של חיידקים בחרוזי האגר, חשוב להשעות באופן אחיד את תערובת חיידקי האגר המותכים לפני הוספתה לשלב השמן. יחס נפח השמן לאגר-חיידקים הוא קריטי בשליטה על גודל החרוזים. יחס שמן לאגר גבוה יותר מוביל להיווצרות חרוזי אגר קטנים יותר. כאשר מערבבים את תרחיף האגר-חיידקים עם שלב השמן, בקרת הטמפרטורה היא קריטית. תערובת השמן-אגר חייבת להיות חמה מספיק כדי לאפשר תחליב והיווצרות טיפות, אך קרירה מספיק כדי לא לפגוע בחיידקים. ערבוב מתמשך תוך כדי קירור התערובת לטמפרטורת החדר ומטה מאפשר לטיפות אגר להיווצר ולהתמצק.

כיול נכון של צלחת הערבוב, גודל מוט הערבוב וצורת וגודל הבקבוק הם גורמים חשובים למערבולת אחידה. מוט ערבוב הממוקם במרכז הבקבוק יוצר מערבולת סימטרית, המבטיחה ערבוב אחיד. מוט ערבוב מחוץ למרכז יכול להוביל למערבולת לא יציבה, וכתוצאה מכך חרוזים בעלי צורה לא סדירה והכנסת בועות אוויר לחרוזים. מומלץ לבצע ניטור והתאמה בזמן אמת של מיקום מוט הערבוב. נפח הבקבוק צריך להיות פרופורציונלי לנפח תערובת השמן-אגר. בקבוק של 500 מ"ל אידיאלי לסובב תערובת שמן-אגר של 90 מ"ל, ויוצר מערבולת גלויה. בעת שימוש בצלוחיות גדולות יותר, חשוב להתאים את נפח תערובת השמן-אגר, את גודל המערבל ואת מהירות המערבולת כדי להשיג איזון בין ערבוב יעיל למערבולת יציבה. שמירה על מהירות מערבולת עקבית במהלך התהליך ובכל הכנת החרוזים היא קריטית לשחזור אצווה לאצווה.

תהליך הכנת חרוזי האגר, במיוחד מהירות המערבולת ויחס השמן-אגר, מותאמים^מ-16,22, עם שינויים קלים. כוחות גזירה בתוך המערבולת המסתובבת מייצרים מטבעם חרוזים בגדלים שונים. כדי למזער את שונות הגודל הזו, שלב קצירת החרוזים שונה על ידי הכנסת מספר שלבי כביסה, תוך שימוש בשיפוע של ירידה במהירות ובזמן הצנטריפוגה כדי להבטיח הסרת חרוזים בגודל קטן (וחיידקים חופשיים). מסנן מיקרו-רשת שימש להעשרת חרוזים בגודל הרצוי, וסינון יעיל של חרוזים גדולים יותר וכאלה שאולי נוצרו באמצעות התלכדות אקראית. כדי למנוע אובדן חרוזים או חיידקים כאשר תמיסת החרוזים עוברת דרך המזרק והצינור המחובר לחיסון תוך-קנה הנשימה של העכבר, קריטי להשתמש במזרק זכוכית, מחטי הזנה ממתכת 24 גרם וצינור המחובר למתכת.

המגבלה העיקרית של השיטה היא המורכבות הטכנית של הכנת החרוזים והחיסון התוך-קנה להשגת עומס חרוזים הניתן לשחזור והשתלת ריאות. נדרשת תשומת לב לפרטים ויכולת פתרון בעיות. בנוסף, המודל לא אומת במלואו על ידי בדיקת היעילות של אנטיביוטיקה סטנדרטית ושילובי אנטיביוטיקה נפוצים ביותר הניתנים לחולי Mab.

נכון לעכשיו, אף מודל עכברי של זיהום Mab כרוני לא אומת במידה שניתן לחזות באופן סביר את היעילות של חומרים בודדים ושילובי תרופות בחולים על ידי מודל⁹. מערכת העכברים C57BL/6 המשובצת בחרוזי אגר נוצלה לבדיקת היעילות של טיפולים אנטי-מיקרוביאליים 15,19,23. האלטרנטיבה הקרובה ביותר למערכת העכברים C57BL/6 המשובצת בחרוזי אגר היא מודל העכבר C3HeB/FeJ, המסתמך על דיכוי חיסוני של דקסמתזון כדי להשיג זיהום כרוני מתמשך^24,25. היתרונות של הפרוטוקול המתואר כאן הם (i) ניתן להשתמש בעכברי C57BL/6 בעלי יכולת חיסונית מלאה ובמחיר סביר ביותר, (ii) ניתן להשיג זיהום פרודוקטיבי וכרוני עם זן מסוג ATCC 19977 המאופיין היטב, ו-(iii) אין דרישה לדיכוי חיסוני המושרה כימית, העוקף את הצורך בזריקות דקסמתזון יומיות, ובכך נמנע אינטראקציות פוטנציאליות בין תרופות והשפעה על אימונופתולוגיה של הריאות.

בהתחשב בהיעדר מודלים עכבריים מאומתים של זיהום Mab כרוני להערכת מועמדים לתרופות חדשות ומשטרי תרופות ^8,9, לטכניקה המתוארת כאן יש פוטנציאל להניע את התחום קדימה, לשפר את ערך החיזוי של נתוני יעילות פרה-קלינית, לעזור לתעדף משטרי תרופות עם הפוטנציאל הגבוה ביותר לספק ריפוי עמיד ולהאיץ באופן כללי את הגילוי והפיתוח של תרופות למחלת ריאות Mab. ניתן ליישם את השיטה על פתוגנים ריאתיים אחרים ויש לה רקורד מבוסס של P. aeruginosa או Haemophilus influenza. המטרה העיקרית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק מספיק פרטים והמלצות כדי להבטיח קלות יישום ושחזור מעולה ממעבדה למעבדה.

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים

עבודה זו מומנה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס, פרס DICK24XX0, ל-TD ו-VD, ו-R01-AI132374 מ-NIH-NIAID ל-TD ו-VD.