琼脂珠包 埋脓肿分枝 杆菌的制备，用于气管内接种免疫功能正常的小鼠

小鼠通常对 脓肿分枝杆菌感染具有抵抗力，这使得发现和开发急需的针对肺部感染的抗生素变得复杂。在这里，我们描述了一种接种物制备和气管内感染的方法，该方法被证明可以在免疫功能正常的小鼠中提供持续感染。

迫切需要脓 肿分枝杆菌慢性感染的稳健小鼠模型，脓肿分枝杆菌是一种最好感染肺部的环境病原体。长达一年的多药疗法对患者的治愈率低得令人无法接受，约为 50%，因此需要预测性临床前工具来开发更好的抗生素。然而，免疫功能正常的小鼠通常对 脓肿分枝杆菌的肺部感染具有抵抗力。文献中已经报道了大量尝试在免疫功能正常的小鼠中建立脓 肿分枝杆菌 的持续感染。其中，依赖于琼脂珠包埋的细菌通过气管内途径接种到 C57BL/6 小鼠中的方法已被证明是最有前途的。这种方法的主要局限性是与制备可重复大小和细菌数量的琼脂珠子，然后进行气管内接种相关的技术挑战。在这里，我们首先提供了优化方案的详细描述，该方案提供了最佳直径和可重复细菌负荷的脓 肿分枝杆菌负载琼脂珠。接下来，我们提供了详细的气管内接种方案，经过优化以避免由于粘附在接种装置表面而导致珠子和细菌的损失，并实现琼脂包埋 的脓肿分枝杆菌的可重复肺沉积。目标是确保易于实施和出色的实验室间重现性。

脓肿分枝杆菌 （Mab） 肺病的治疗选择有限，涉及为期一年的多药治疗方案，包括口服、肠外和偶尔吸入的抗生素，其中大多数缺乏最佳杀菌活性，并且与显着毒性相关 1,2,3,4,5 .迫切需要更短、更安全、更有效的疗法。分枝杆菌感染的小鼠模型有助于发现和优化有效的药物和药物治疗方案 ^6,7。然而，由于难以在小鼠中建立进行性和持续的肺部感染，因此对抗生素针对 Mab 感染的临床前评估已被证明具有挑战性 ^8,9。

免疫功能正常的小鼠菌株用 Mab 感染主要导致瞬时定植，然后快速清除病原体^10,11。为了实现临床观察到的慢性感染，琼脂糖或琼脂等固定剂已被用于促进免疫功能正常小鼠中机会性病原体（如铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌）的持续存在和免疫病理学反应 12,13,14。该模型最近被 Mab ATCC 19977 用于免疫功能正常的 C57BL/6N 小鼠的慢性呼吸道感染^{15、16、17、18}。该方法在气管内接种 ~1 ×^{10 4} 至 1 × 10⁶ 集落形成单位 （CFU） 后诱导长达 45 天的持续感染，感染小鼠慢性感染的发生率为 90%-100%¹⁹ 并在崩解的琼脂珠周围形成组织性肉芽肿¹⁸。将 Mab 包埋在微珠中似乎可以防止先天免疫系统快速清除，并且载有细菌的微珠构成了免疫细胞募集的病灶，导致肉芽肿的形成和慢性感染的建立¹⁸。琼脂/琼脂糖珠子是一种相对惰性的生物材料，可诱导最小的炎症反应。此外，磁珠分解缓慢，避免了异物过敏反应或诱导纤维化的问题。有或没有微喷装置的气管内感染可确保接种物有效沉积到肺部 ^8,20,21 并且比静脉内或鼻内接种更好地再现临床暴露和感染。

因此，该模型具有许多优点。然而，它也带来了一些技术性质的挑战，即 （i） 实现可重复的珠子大小，（ii） 获得可重复的珠子细菌负荷，以及 （iii） 确保接种物的气管内一致输送。在这里，我们提供了详细的方案，以可靠地实现这些目标并确保实验室间的可重复性。

所有动物研究均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并获得了马里兰州贝塞斯达 NIAID （NIH） 机构动物护理和使用委员会的批准。所有程序均已获得机构动物护理和使用委员会的批准。所有涉及 脓肿分枝杆菌 的研究均在生物安全隔离级别为 2 的实验室中进行。

1. 琼脂珠包埋的脓 肿分枝杆菌 接种物的制备

1. 通过将 1.5 mL 光密度 （OD₆₀₀） 1（使用分光光度计）培养物接种到 200 mL 补充有 0.05% （v/v） 吐温 80、0.5% （v/v） 甘油和 10% （v/v） Middlebrook 白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶富集 （ADC） 的 Middlebrook 7H9 培养基中，制备脓肿分枝杆菌 ATCC 19977 的预培养物。
2. 将培养物在滚瓶中于 37 °C 孵育 24 小时，直至达到对数中期 （OD₆₀₀ = 0.4-0.6）。
3. 将 1.2 g 胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 悬浮在 40 mL 超纯水中，并加入 0.6 g Difco 琼脂至终浓度为 1.5%。
4. 将 60 mL 重矿物油转移到 500 mL 锥形瓶中，并在 121 °C 下对矿物油和胰蛋白酶大豆琼脂 （TSA） 消毒 15 分钟，然后在 50 °C 下在烘箱中平衡。
5. 对 1 mL 培养物进行采样并测量 OD₆₀₀。
6. 通过在 4 °C 下以 3700 g 离心 15 分钟来收获细胞。 将细胞重悬于 4 mL 的 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中，以达到约 30 的 OD₆₀₀ 。
7. 在 50 mL 离心管中将 3 mL 细菌悬浮液与 27 mL 在 50 °C 下预平衡的熔融 TSA 混合。通过涡旋或移液快速混合。
8. 小心地将细菌-琼脂混合物 （30 mL） 倒入 60 mL 矿物油中，并将培养瓶放入辅助容器中。使用磁力搅拌棒，在设置为 50 °C 的磁力搅拌器上快速将混合物设置为以中速 （420 rpm） 旋转。确保在油-琼脂混合物中形成可见的涡旋。在室温 （RT） 下搅拌 6 分钟。
9. 将冰块放入辅助容器中冷却混合物，并继续搅拌 35 分钟。
10. 停止搅拌，让琼脂珠浆静置 20 分钟（根据需要补充冰块）。
11. 将浆液混合物转移到两个 50 mL 离心管中，用一种体积的 DPBS 洗涤 10 次，以去除油和游离细菌（3700 g，6 分钟，4 °C，前 5 个循环）。
    1. 在第三次洗涤时将琼脂珠悬浮液合并成一个管。在前 5 个洗涤周期中，使用血清移液管轻轻重悬珠子。
    2. 对于随后的 5 个洗涤周期，使用以下离心参数：2000 g 5 分钟，然后分别 1000 g 4、3、2 和 2 分钟。
12. 将琼脂珠重悬于 DPBS 中至终体积为 40 mL，转移至 125 mL 无菌瓶中，并加入 120 mL DPBS 稀释 4 倍。
13. 将悬浮液穿过 200 μm 细胞过滤器。
    1. 将过滤器连接到无菌 50 mL 离心管上。然后，将样品材料添加到过滤器上并过滤珠子悬浮液。
    2. 为了促进过滤过程，将细胞过滤器、漏斗、连接环和 50 mL 试管组合成一个单元。按照漏斗、细胞过滤器、连接环和 50 mL 管的顺序组装部件，然后缓慢拉动连接到连接环的 30 mL 注射器的活塞。
14. 如果需要，用 DPBS 从另一侧冲洗过滤器，以洗掉任何残留的较大珠子。通过在 1000 g 下旋转 2 分钟或让珠子在重力下沉降来浓缩稀释的悬浮液。收获后，将琼脂珠在 4 °C 下储存长达 1 周。建议每批实验都使用新鲜的制剂。
15. 将 5 μL 微珠悬浮液移液到载玻片上，用盖玻片盖住，然后使用带有 10× 物镜的光学或荧光显微镜在几个随机位置拍摄图像。保存图像并使用 ImageJ 测量珠子直径（所需尺寸范围：200 ± 50 μm）。

2. 滴定包埋的脓 肿分枝杆菌 接种物

1. 将 1 mL 微珠悬浮液加入 M 管中，并使用设置为预定义程序 RNA.02.01 的解离剂进行无菌匀浆，以释放包埋在微珠中的细菌。
2. 取 100 μL 匀浆，以 1：10 至 1 × ^10-5 稀释度连续稀释。将稀释液涂抹在补充有 10% 油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶 （OADC） 和 2% 甘油的 7H10 琼脂上。孵育 3 至 5 天后计数 CFU。
3. 根据需要调整接种滴度。例如，如果每只小鼠向 10 只小鼠接收 100 μL 含有 1 ×^{10 5} CFU 的微珠悬浮液，则制备总共含有 1 ×^{10 6} CFU/mL 的 2 mL 悬浮液加上 ~25%，以考虑注射器中的损失。

3. 测试通过注射器和针头的微珠分配

注：包括以下步骤，以确保珠子不会粘附在注射器或针头的表面。研究发现，使用玻璃注射器和 24 G 金属进料针头以防止由于粘附在塑料表面而导致珠子丢失非常重要。

1. 通过添加 1.25 mL 无菌 Tween 80 至 500 mL 无菌 PBS 制备 PBST。
2. 将 900 μL PBST 加入 5 个 M 管中，用于检测通过进料针的琼脂珠，并将 900 μL PBST 加入 2 mL 无菌管中，以制备每个推入式样品的 -2 至 -6 稀释液。
3. 使用 P1000 移液器混合先前制备的琼脂珠包 埋的脓肿分枝杆菌 ，以确保所有珠子均匀分散。
4. 将 24 G 金属进料针连接到玻璃注射器上并吸出琼脂珠悬浮液，确保避免形成气泡。
5. 一旦注射器装满且没有气泡，将尼龙夹或塞子放在注射器的柱塞上，夹子之间不要有空隙。带塞可准确分配 50-100 μL。沿柱塞最多可安装 6 个夹子。
6. 按各自的顺序将 100 μL 珠子（“推入”）分配到 M 管中。
7. 收集 5 个推入后，使用调整到 RNA.02.01 设置的组织解离器对珠子进行匀浆，这足以从冷冻器官制备 RNA，并且发现它可以有效地从珠子中释放 脓肿分枝杆菌 ，而不会影响细胞活力。
8. 对 -1 至 -6 范围内的匀浆进行连续稀释。将稀释液接种在补充有 OADC 的 7H11 琼脂平板上。5 天后计数 CFU。

4. 小鼠气管内接种

1. 准备 6 至 8 周龄的 CD-1 小鼠。
2. 如前所述，使用异氟醚气溶胶暴露系统以 1-5% 的流速镇静小鼠¹。
3. 使用 3D （3-D） 打印的倾斜支架（定制设计和生产）约束小鼠。支架中央的杆有一根缝合线，通过门牙将鼠标垂直支撑起来，将鼠标置于腹侧斜躺位置，头部抬起。
4. 将金属 24 G 动物饲喂针连接到装满琼脂珠嵌入 脓肿分枝杆菌的玻璃注射器上。将尼龙夹或塞子放在注射器的柱塞上，用 50 μL 接种物感染每只小鼠。
5. 一旦镇静的小鼠被缝合线蜇伤束缚，使用棉签涂抹器将舌头移至口腔一侧。
6. 可视化小鼠的嘴巴后部，以清楚地识别口腔后部的白色部分，并瞄准小鼠的气管。
7. 将金属管饲针垂直置于鼠标上方，并将其插入气管顶部。通过会厌时可能会有轻微的阻力。
8. 将管饲针向下滑入气管，取下尼龙夹或塞子，然后分配 50 μL 琼脂珠包埋的脓 肿分枝杆菌。
9. 让鼠标静置 5 分钟，然后再次重复步骤 4.2-4.8。两步接种程序的目的是确保完整接种物在肺部的可重复和深层沉积。
10. 让感染进行 24 小时，然后对小鼠实施安乐死以计数肺部的细菌沉积。

微珠大小和负载
为了可视化琼脂珠及其细菌负荷，在 Mab 型菌株 ATCC 19977 的组成型 Hsp60 启动子下表达 mCherry 红荧光蛋白，并如上所述将该菌株包埋在琼脂珠中。 图 1A 显示了微珠尺寸的范围（比例尺 = 200 μm）。 图 1B 显示了 6 种独立珠子制备的负担，证明了所述程序的可重复性。

气管内接种后注射器推入式电镀和细菌植入
气管内接种分两步优化。在通过玻璃注射器之前和之后，在接种物中计数 CFU/mL，以确保当珠子通过注射器和连接管时不会发生珠子或细菌损失。 表 1 显示了两种独立微珠制备物（试验 1 和 2）的初始细菌滴度以及从单个注射器负载中每 100 mL “推入”样品回收的 CFU 数量。为避免珠子和细菌损失，需要将玻璃注射器连接到金属管上。琼脂珠往往会粘附在塑料表面。

珠子制备中随时间推移的 CFU 计数表明，珠子的细菌负荷在 4 °C 下保持稳定 1 周，每 2 周细菌负荷减少 ~2 倍，肺沉积未受损。接下来，用三种独立的珠子制剂感染 5 至 8 只小鼠组，以测试气管内接种程序的可重复性。 表 2 显示了每只小鼠的肺 CFU 数量，如前所述在感染后 24 小时列举。

最后，通过感染三组 10 只 CD-1 小鼠来评估感染的作员间可重复性，每组由不同的作员进行。感染后 24 小时列举的肺 CFU 如图 2 所示。

图 1：评估珠子大小、可视化和量化 脓肿分枝 杆菌细菌载量的试点实验。 （A） 含有 脓肿分枝杆菌 ATCC 19977 菌株的琼脂珠，经工程改造可在组成型 hsp60 启动子下表达 mCherry 红荧光蛋白。将 5 μl 微珠悬浮液涂在载玻片上，并用配备相机（10 倍物镜）的荧光显微镜成像。每个红点都是一个荧光细菌细胞，封装在直径范围为 ~70-250 μm 的琼脂珠中。（B） 6 种单独微珠制备的细菌负荷量，以 CFU/mL 为单位，显示了该方法的可重复性。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：感染的作员间可重复性。 10 只 CD-1 雌性小鼠组由三名独立的作员如所述，使用相同的珠子制备物进行气管内感染。显示了感染后 24 小时列举的肺 CFU。O1、O2、O3：运算符 1、2 和 3。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：每 100 μL 样品通过玻璃注射器和金属进料针头后的菌落形成单位 （CFU）。

表 2：接种后 24 小时将琼脂珠包埋的脓 肿分枝杆菌 植入小鼠肺

为了确保细菌在琼脂珠中均匀分布，重要的是在将其添加到油相中之前均匀悬浮熔融琼脂-细菌混合物。油与细菌的体积比对于控制微珠大小至关重要。较高的油与琼脂比率会导致形成更小的琼脂珠。将琼脂-细菌悬浮液与油相混合时，温度控制至关重要。油-琼脂混合物必须足够温暖以允许乳化和液滴形成，但又足够凉爽以不伤害细菌。在将混合物冷却至室温或更低温度的同时持续搅拌，可使琼脂液滴形成并凝固。

搅拌板的正确校准、搅拌棒的尺寸以及烧瓶的形状和尺寸是均匀涡旋的重要决定因素。位于培养瓶中央的搅拌棒可产生对称的涡旋，确保均匀混合。偏心的搅拌棒会导致不稳定的涡旋，导致形状不规则的微珠和气泡进入微珠。建议实时监控和调整搅拌棒的位置。烧瓶的体积需要与油-琼脂混合物的体积成正比。500 mL 培养瓶非常适合离心 90 mL 油-琼脂混合物，产生可见涡旋。当使用较大的培养瓶时，重要的是要调整油-琼脂混合物的体积、搅拌器的大小和涡旋速度，以实现有效混合和稳定涡旋之间的平衡。在工艺过程中和整个微珠制备过程中保持一致的涡旋速度对于批次间的重现性至关重要。

琼脂珠制备过程，特别是涡旋速度和油琼脂比，改编自^16,22，并稍作修改。旋转涡流内的剪切力本身会产生不同大小的珠子。为了最大限度地减少这种大小变化，通过引入几个洗涤步骤来修改磁珠收获步骤，采用降低离心速度和时间的梯度，以确保去除小尺寸磁珠（和游离细菌）。采用微网过滤器来富集所需大小的微珠，有效过滤掉较大的微珠和可能通过随机聚结形成的微珠。为避免珠浆通过注射器和连接管进行小鼠气管内接种时出现珠子或细菌损失，使用玻璃注射器、24 G 金属饲喂针和金属连接管至关重要。

该方法的主要局限性是磁珠制备和气管内接种的技术复杂性，以实现可重复的磁珠负荷和肺植入。需要注意细节和故障排除能力。此外，该模型尚未通过测试标准护理抗生素和对 Mab 患者最常见的抗生素组合的疗效得到充分验证。

目前，尚无慢性 Mab 感染的小鼠模型得到验证，以至于模型⁹ 可以合理预测单一药物和药物组合对患者的疗效。琼脂珠包埋的 C57BL/6 小鼠系统已被用于测试抗菌治疗的疗效 15,19,23。最接近琼脂珠包埋的 C57BL/6 小鼠系统的替代品是 C3HeB/FeJ 小鼠模型，该模型依靠地塞米松免疫抑制来实现持久的慢性感染^24,25。此处描述的方案的优点是 （i） 可以使用完全免疫功能正常且最实惠的 C57BL/6 小鼠，（ii） 可以使用特征明确的菌株 ATCC 19977 获得生产性和慢性感染，以及 （iii） 没有化学诱导的免疫抑制要求，避免了每天注射地塞米松的需要，从而避免了潜在的药物相互作用和对肺免疫病理学的影响。

鉴于缺乏经过验证的慢性 mAb 感染小鼠模型来评估新的候选药物和药物方案 ^8,9，^此处描述的技术有可能推动该领域向前发展，提高临床前疗效数据的预测价值，帮助优先考虑最有可能提供持久治愈的药物方案，并全面加速 Mab 肺病的药物发现和开发。该方法可应用于其他肺部病原体，并具有铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌的既定记录。此处描述的方案的主要目标是提供足够的细节和建议，以确保易于实施和出色的实验室间重现性。

作者声明没有利益冲突

这项工作由囊性纤维化基金会资助，授予 DICK24XX0 和 VD，以及 NIH-NIAID 授予 TD 和 VD 的 R01-AI132374。