מחקר רב-מודאלי של שיפוץ לב וכלי דם בעכברים: אולטרסאונד ארבע-ממדי והדמיית ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בהדמיית אולטרסאונד ארבע-ממדית in vivo והדמיית ספקטרומטריית מסה ex vivo כדי להעריך שינויים ביומכניים וביו-מולקולריים במערכת הלב וכלי הדם של העכברים. טכניקה זו מיושמת לניתוח שיפוץ לב באוטם שריר הלב המושרה בניתוח ושינויים בכלי הדם בבעלי חיים מזדקנים.

מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בארצות הברית. נזק במערכת הלב וכלי הדם יכול לנבוע מחשיפה סביבתית, טראומה, רעילות לתרופות או גורמים רבים אחרים. כתוצאה מכך, רקמת הלב וכלי הדם עוברים שינויים מבניים ומציגים תפקוד מופחת. ניתן לזהות ולכמת את הנזק ואת העיצוב מחדש שנוצר באמצעות הדמיית אולטרסאונד (US) ברמת האיבר והדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) ברמה המולקולרית. כתב יד זה מתאר מתודולוגיה חדשנית לחקר פתופיזיולוגיה של לב עכברים, צימוד הדמיה וניתוח אולטרסאונד ארבע-ממדי (4D) עם ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצת ex vivo (MADLI) MSI של הלב. אולטרסאונד 4D יכול לספק מדידות נפח דינמיות, כולל תזוזה רדיאלית, מתח שטח פנים ומתח אורכי לאורך מחזור לב שלם. בכלי הדם, MSI ואולטרסאונד משמשים להערכת קומפוזיציות דופן כלי הדם, המודינמיקה ודינמיקה של דופן כלי הדם. ניתן להתאים את המתודולוגיה לחקר מספר עצום של מחלות לב וכלי דם על ידי התאמת מדדים תפקודיים מעניינים ו/או שינוי פרוטוקול MALDI MSI כדי להתמקד במולקולות ספציפיות. ניתן להשתמש ב-MALDI MSI לחקר שומנים, מטבוליטים קטנים, פפטידים וגליקנים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-MALDI MSI לניתוח ליפידומי לא ממוקד ושימוש בהדמיית אולטרסאונד להמודינמיקה וביומכניקה קרדיווסקולרית.

מחלות לב וכלי דם (CVD) הן גורם מוביל לתמותה ברחבי העולם¹. מניעה וטיפול במחלות לב וכלי דם דורשים הבנה מעמיקה של התאמות מולקולריות לכוחות ביומכניים והשינויים הנובעים מכך בתכונות המכניות. בכל מערכת הלב וכלי הדם, כוחות ביומכניים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד ובמבנה הרקמה². התכונות המכניות של רקמת לב וכלי דם (CV) מושפעות מכוחות אלה, מה שהופך אותם לאינדיקטורים לבריאות ומחלות 3,4,5,6. כדי למנוע, לאבחן ולטפל במחלות לב וכלי דם, חיוני לפתח שיטות להבנה והתבוננות בתהליכי התחלת המחלה והתקדמותה. הדמיה ביו-רפואית הייתה המפתח ביצירת תובנות פיזיולוגיות ומכניסטיות, וטכנולוגיות הדמיה וטכניקות ניתוח חדשות מפותחות כל הזמן. פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיה לשילוב שתי טכניקות הדמיה וניתוח קרדיווסקולריות כדי לאמת את הפוטנציאל של שיטות הדמיה אלה במחלת לב איסכמית והזדקנות כלי הדם.

חוקרים בתחום הביומכני ניגשים לעתים קרובות לחקר הביומכניקה באמצעות שילוב של שיטות in vivo, ex vivo ו-in silico . מחקרים קודמים בביומכניקה מולקולרית התמקדו בעיקר בחלבונים⁷ (במיוחד חלבוני מטריצה חוץ-תאיים קולגן ואלסטין בגלל השפעתם על תכונות ביומכניות), והעבודה לשילוב ביומכניקה של הדמיה in vivo עם מחקרים מולקולריים הוגבלה להיסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. למרות שגישות אלה יכולות להניב אינדיקטורים מולקולריים רבים והניבו מנגנונים מוצעים לעיצוב מחדש של ECM ותאים, הם בדרך כלל מוגבלים לכתמים או לנוגדנים הזמינים כיום, בהתאמה. תחום מחקר זה חסר סוגים גדולים של מולקולות, למשל שומנים. בעוד שמחלקות מולקולריות אלה עשויות להיות מעורבות מכנית או לא, חשוב להבין את ההתאמות המולקולריות המתקבלות מכיוון שמולקולות אלו יכולות להיות מטרות פוטנציאליות הן לסמני אבחון והן לטיפולים. ניתן ליישם טכניקות כימיה אנליטית, כגון כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS); עם זאת, ההתמצאות המרחבית של המולקולות בטכניקות אלה הולכת לאיבוד. עם הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI), ההתפלגות המרחבית של מולקולות נשארת שלמה, וניתן לדמות סוגי אנליטים מרובים (מחלקות של מולקולות) עם חתכים סדרתיים. MSI הוא כלי אנליטי רב עוצמה לחקירת ההתפלגות המרחבית של כמעט כל סוגי המולקולות ברקמה ביולוגית, כולל מטבוליטים, שומנים, גליקנים, פפטידים ותרופות במשקל מולקולרי קטן⁸. ספיגה/יינון לייזר בעזרת מטריצה (MALDI) MSI הוא סוג של MSI המתאים היטב לניתוח מבוסס גילוי של משקלים מולקולריים בטווח של 50-8000 Da. MALDI-MSI היא טכניקת יינון המיישמת מטריצה סופגת אנרגיה בלייזר על הדגימה כדי לסייע ביינון האנליטים המעניינים. גישה זו מונעת הגבלה למטרה מולקולרית אחת ויכולה להשתמש בכלים ביואינפורמטיים כדי לקבוע לאילו מולקולות יש השפעה על תכונות ביומכניות ועיצוב מחדש.

אולטרסאונד ארבע-ממדי (4DUS) היא שיטה לא פולשנית in vivo שימושית לאפיון זמני ומרחבי של הלב. 4DUS משתמש בסדרה של לולאות קולנוע בקצב פריימים גבוה ממישורים שונים, ומרכיב אותן למערך נתונים תלת-ממדי הכולל מידע זמני. זה מאפשר הדמיה וכימות ישירים של שינויי הצורה התלת-ממדיים המורכבים של חדרי הלב לאורך מחזור הלב מבלי להסתמך על הנחות גיאומטריות כנדרש עבור אקו לב דו-ממדי מסורתי. 4DUS מאפשר לחשב מדדים פונקציונליים in vivo מהצורה והתנועה המורכבים של הלב ^9,10, ו-MALDI MSI מאפשר מחקר מרחבי של מולקולות ביולוגיות בתוך רקמת הלב ex vivo¹¹. כדי להבין באופן מלא שינויים בלב עם מחלות לב וכלי דם, יש לחקור מנגנונים מכניים ומולקולריים כאחד. לפיכך מוצעת מתודולוגיה משולבת לחקר פתופיזיולוגיה של לב עכברים, צימוד הדמיה וניתוח 4DUS עם MALDI MSI של שומנים בלב. מתודולוגיה זו מודגמת במודל עכברי של אוטם שריר הלב.

ביומכניקה של כלי הדם ממלאת גם תפקיד קריטי בוויסות תפקוד הלב וכלי הדם². התקשות כלי הדם, הקשורה להזדקנות, היא גורם סיכון למחלות לב וכלי דם¹². ניתן לדמות את השינויים הביומכניים וההמודינמיים בכלי הדם באמצעות אולטרסאונד. ההרכבים המולקולריים של דפנות כלי הדם הם מרכיבים חשובים בביומכניקה והם גם רגישים להפליא לכוחות המודינמיים. לדוגמה, מתח גזירה של דופן תנודתית היה מעורב בהתפתחות רובד טרשת עורקים³. הנתונים הראשוניים של מכניקת כלי הדם וההמודינמיקה בבעלי חיים מבוגרים יוצגו בהמשך.

הצוות מתעניין בקשר בין ביומכניקה והרכב מולקולרי במצבי מחלה שונים. הדמיית אולטרסאונד פרה-קלינית ו-MSI משמשות לקביעת ההתפלגות המרחבית של שינויים מולקולריים ברקמה והשינויים הביומכניים הנלווים המתרחשים במהלך התקדמות המחלה. דוח זה מתאר את המתודולוגיות הללו בפירוט ומציג נתונים ראשוניים על הלב וכלי הדם של הראש/הצוואר.

הניסויים המתוארים בבעלי חיים מבוצעים באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טנסי, נוקסוויל.

1. הדמיית אולטרסאונד¹³

1. התקנה והכנת בעלי חיים
   1. לפני תחילת הניסוי, בדוק את רמת ההרדמה של איזופלורן ומלא מחדש במידת הצורך. בדוק את מפלס מיכל החמצן לפני הפעלת הגז. שקלו את הפחם ורשמו אותו על המיכל.
   2. הגדר את מרחב ההדמיה על-ידי הצבת חומרים מתכלים ליד פלטפורמת ההדמיה. האספקה כוללת סרט חתוך מראש, קרם אפילציה, גזה, צמר גפן, מים חיטוי, חומר סיכה לקרנית, ג'ל סיכה, בדיקת טמפרטורת פי הטבעת, מוליכי אלקטרודות, ג'ל אולטרסאונד, ג'ל אלקטרודות (אם ישים) ומנורת חום (איור 1A).
   3. הפעל את מכשיר האולטרסאונד ואתחל את המנוע (המערכת מסוגלת גם לאסוף נתוני תמונה של 4DUS). הגדר ניסוי חדש במערכת האולטרסאונד: בחר מחקר חדש או סדרה חדשה ומלא מידע על העכבר. הפעל את הטאבלט לניטור פיזיולוגי.
   4. בדוק את תא העצירה כדי לוודא שהזרימה פתוחה לתיבת האינדוקציה וסגורה לקונוס האף. מלאו מראש את קופסת האינדוקציה להרדמה על ידי הפעלת חמצן ל-1 ליטר לדקה במכשיר האידוי וסיבוב החוגה ל-3%-5%.
   5. הסר את העכבר מכלוב הדיור.
   6. הנח את העכבר בתיבת האינדוקציה עד שהחיה מורדמת לחלוטין עם איזופלורן בין 3%-5%.
   7. החלף את תא העצירה כדי לשנות את הזרימה לחרוט האף על לוחית הדמיית האולטרסאונד. סובב את חוגת האיזופלורן בין 1%-2%.
   8. הסר את העכבר מקופסת האינדוקציה ושקול את החיה. רשום את משקל החיה.
   9. הנח את העכבר במצב שכיבה על לוחית ההדמיה.
   10. מרחו חומר סיכה לקרנית על עיני החיה.
   11. אם קיימת פרווה, הסר את הפרווה מאזור ההדמיה באמצעות קרם אפילציה זמין מסחרית וצמר גפן. נגבו את הקרם מהעור במים על ספוגים כדי להסיר עודפי קרם אפילציה מהעור ולמנוע כוויות.
   12. הכנס את מובילי האלקטרוקרדיוגרפיה (ECG) תת עורית משני צידי החזה והגפה האחורית, בהתאם למיקום החיה.
       1. לאחר ההכנסה, החזק את מובילי האק"ג במקומם באמצעות סרט. אם לא נעשה שימוש במובילי א.ק.ג (כלומר, לא מוכנסים מובילי א.ק.ג), עקוב אחר א.ק.ג דרך לוחית ההדמיה של בעלי החיים.
       2. להולכה חשמלית מעור לצלחת, אתר את הג'ל המוליך על הצלחת והחזק את גפיים של בעלי חיים במקומן.
   13. החזיקו את הגפיים של החיות במקומם באמצעות סרט או רצועה אלסטית שמונחת סביב הצלחת ומעל הגפיים (איור 1B).
   14. השתמש בג'ל סיכה כדי להכניס את בדיקת הטמפרטורה של פי הטבעת ולאבטח את הגשושית בעזרת סרט.
   15. בדוק את אותות האק"ג, הנשימה והטמפרטורה בטאבלט. ודא שהדופק הוא ~350-600 פעימות לדקה, נשימה ~50-100 נשימות לדקה וטמפרטורת פי הטבעת בין 35-37 מעלות צלזיוס. התאם את רמות האיזופלורן לפי הצורך.
   16. במידת הצורך, הפעל חום lamp (למשל, נורת חימום אינפרא אדום 250 W)¹⁴ והתאם את הגובה כדי לשמור על טמפרטורת הליבה (איור 1C).
       1. מקם את מנורת החום לא יותר מ -12 סנטימטרים מהחיה. למחקרים ראשוניים לקביעת המרחק האופטימלי בין הנורה לבעל החיים, התאם את הגובה ורשום את טמפרטורת העור באמצעות מדחום אינפרא אדום, שלא יעלה על 42 מעלות צלזיוס¹⁵.
2. אולטרסאונד 4D לב
   1. הנח את המתמר במחזיק במצב נעול למחצה.
   2. כוון את הנקודה המוגבהת על המתמר עם הנקודה הכחולה על המסך. המוסכמה היא למקם את הנקודה לכיוון הצד הימני של החיה.
   3. סובב את המתמר כך שהוא מכוון לאורך המישור הסגיטלי של העכבר עם חריץ מוגבה המצביע לכיוון הזנב.
   4. השתמש בידית בבסיס לוחית האולטרסאונד כדי להטות את החיה. השתמש בידית בבסיס המתמר כדי לכוונן את זווית המתמר.
   5. מרחו כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד על פני הגחון של חלל בית החזה לצימוד אקוסטי בין פני העור למתמר. ודא שלא נותרה פרווה לפני הצימוד.
   6. הורד את המתמר כדי ליצור מגע עם ג'ל האולטרסאונד.
   7. בצע התאמות מיקרו עם כפתורי X/Y בבסיס הצלחת, או הזז את הצלחת כולה להתאמות גדולות.
   8. ודא שתצוגת ציר ארוך פראסטרנלית כוללת את הקודקוד, דרכי היציאה של החדר השמאלי ואבי העורקים מיושרים אופקית על המסך לקבלת תמונה מדויקת יותר של ציר קצר (איור 2A, B).
   9. בחר Name Image בפינה התחתונה כדי לשמור את התמונה בסדרה הנוכחית.
   10. סובב את המתמר 90° בכיוון השעון כדי לעבור לציר קצר parasternal view (איור 2C).
       הערה: לקבלת איכות התמונה הטובה ביותר ב-4D, על המשתמשים לנסות ליישר את מנוע הצעד לאורך הציר הארוך של החדר שלא תמיד מקביל ישירות לעצם החזה. הלב/LV יושב לעתים קרובות בזווית שמאלית כלפי מטה.
   11. ודא שהחדר השמאלי גלוי בצד ימין של המסך והחדר הימני נמצא בצד שמאל של המסך (איור 2D).
   12. אם לעכבר יש קצב נשימה יציב, לחץ על תיבת האק"ג בפינה השמאלית העליונה של התמונה כדי להפעיל את שער הנשימה עבור התמונה הרביעית. אם לא יציב, השלם שלב זה במהלך העיבוד שלאחר העיבוד.
   13. בחר את הקוביה בפינה השמאלית העליונה של המסך כדי להגדיר תמונה 4D.
   14. אפס את המתמר לפני התאמת מיקומי ההתחלה והעצירה של המתמר.
   15. התאם את מיקום התחלה ממש מתחת לקודקוד ואת מצב העצירה לקשת אבי העורקים.
   16. הגדר את גודל הצעד ל-0.08-0.13 מ"מ ואת קצב הפריימים ל-200-300 הרץ.
       הערה: גדלי צעדים קטנים יותר עשויים לספק רזולוציית תמונה טובה יותר לניתוח, אך יגדילו את זמן הרכישה. גדלי מדרגות גדולים יותר מקובלים אם הנתונים נאספים עם יישור כמעט מושלם של החדר השמאלי ויש צורך בכיוון מינימלי / ללא כיוון מחדש במהלך הניתוח. שקול להגדיל את קצב הפריימים בעת עבודה עם בעלי חיים עם קצב לב גבוה יותר (>450 פעימות לדקה).
   17. ודא שהסימנים החיוניים ואות ה-EKG יציבים באופן עקבי (>350 סל"ד ונשימה מעל 50 סיבובים לדקה) לפני הלחיצה על הסריקה.
   18. לאחר השלמת הסריקה והעיבוד, הפעל את שמירת נתוני EKV/4D לעיבוד שלאחר ושער הנשימה.
   19. בחר שם תמונה בפינה השמאלית התחתונה וכלול את מזהה העכבר בשם.
   20. כדי לבדוק את איכות התמונה, לחץ על פקדים נוספים ובחר טען ל-4D.
   21. סקור כל מישור של הלב, וודא שמרכז הלב אינו נע לאורך מחזור הלב. תנועת המרכז מצביעה על שונות ב-EKG ו/או בשער הנשימה ובכך מסבכת את תהליך הניתוח. כוונן מחדש את הצגים וחזור על הסריקה במידת הצורך.
3. ניתוח אולטרסאונד 4D לב
   1. נווט אל דפדפן הלימוד. ייצא את כל התמונות הדו-ממדיות של B-Mode ל-Vevo Lab וייצא נתוני 4D כסוג קובץ אחר, תוך בחירת פורמט נתונים ".raw" לכונן קשיח.
      הערה: ארגז הכלים של ממשק המשתמש הגרפי 4D המשמש בעבודה זו אינו זמין כרגע לציבור. לבקשת גישה והנחיות מפורטות, פנה לד"ר קרייג גורגן, אוניברסיטת פרדו.
   2. בצע ניתוח חלופי של נתוני 4D באמצעות תוכנת VevoLab. כדי להשתמש במסגרת זו, ייצא נתוני 4D מהמכשיר לקבצי Vevo Lab.
4. הדמיית כלי דם
   1. לתמונות במצב B של עורקי הצוואר, מקם את מתמר האולטרסאונד במקביל לעורקי הצוואר, ליד קו האמצע.
   2. לאחר שעורק הצוואר גלוי, הזז את המתמר העליון כדי למצוא את התפצלות הצוואר.
   3. כאשר נמצאה תמונה ברורה של התפצלות הצוואר, התאם את הגדרת הרווח ל-35 dB וצלם את תמונת מצב B.
      1. זווית המתמר שמאלה או ימינה עשויה לשפר את התמונה. התאם את זווית המתמר או השלב כך שהכלי המעניין לא יהיה מקביל ישירות למתמר. זה מאפשר לזווית הדופלר להישאר מתחת ל-60°. אחרת, ייתכן שיהיה צורך בהזזה של +/- 15°.
   4. עבור למצב דופלר גל דופק כדי לקבל את מדידות המהירות.
   5. הנח את נפח הדגימה במרכז הכלי. כוונן את זווית הסמן כך שתהיה מקבילה לעורק הצוואר. לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי להתחיל את מדידות המהירות ושמור כדי להקליט אותן.
   6. לתמונת מצב B של ורידי הצוואר, מקם את מתמר האולטרסאונד במקביל לוורידי הצוואר. ורידי הצוואר קדמיים ורוחביים לעורקי הצוואר.
   7. לאחר איתור וריד הצוואר, העבר את המתמר למקום בו מתמזגים הצוואר הפנימי והחיצוני. כאשר נמצאה תמונה ברורה, כוונן את הגדרת הרווח ל-35 dB וצלם את התמונה במצב B.
   8. עבור למצב דופלר גל דופק כדי לקבל את מדידות המהירות.
   9. הנח את נפח הדגימה במרכז הכלי. כוונן את זווית הסמן כך שתהיה מקבילה לווריד הצוואר. לאחר מכן, לחץ על הפעל כדי להתחיל את מדידות המהירות ושמור כדי להקליט אותן.
5. ניתוח אולטרסאונד כלי דם
   1. לאחר איסוף תמונות מצב B ומדידות דופלר גל דופק, מדוד את הקטרים והמהירויות באמצעות התוכנה.
   2. לאחר טעינת התמונות לתוכנה, בחר חבילת כלי דם.
   3. בחר כל צד של הכלי כדי לקבל את הקוטר המלא.
   4. עבור עורק הצוואר, בצע מדידות קוטר בסיסטולה ודיאסטולה באמצעות אפשרות הקוטר באריזת כלי הדם.
   5. בצע מדידות מהירות באמצעות אפשרות המהירות בחבילת כלי הדם.
   6. עבור עורק הצוואר, בחר את השיא הגבוה ביותר למדידת המהירות בסיסטולה ואת השיא הנמוך ביותר למדידת מהירות בדיאסטולה.
   7. השתמש בערכי הקוטרים כדי לחשב את הרכיב ההיקפי של טנזור המתח הירוק לגראנז' באמצעות המשוואה הבאה,
      (1)
      כאשר D_s מייצג את הקוטר במהלך הסיסטולה ו-D_d מייצג את הקוטר במהלך הדיאסטולה.
   8. עבור וריד הצוואר, בחר נקודות כלשהן לאורך המחזור כדי לקבל את מדידת המהירות.

2. המתת חסד וקצירת רקמות

1. הכן סירות רדיד אלומיניום עבור רקמות הקפאת הבזק (איור 3).
2. בסוף המחקר, המתת חסד של החיה על ידי מנת יתר של איזופלורן בריכוז של 5% ופנאומוטורקס דו-צדדי או פריקת צוואר הרחם (מחקר לב בלבד).
3. בעזרת מלקחיים לאוהל העור, חותכים את עור האוהל עם מספריים מעל הצוואר לכלי דם או ממש מתחת לעצם החזה ללב.
4. חותכים את שכבות העור והשרירים כדי לחשוף את כלי הדם או חותכים את העצם כדי לחשוף את הלב.
5. בעזרת דיסקציה קהה עם צמר גפן, בודד את הלב או כלי הדם מהרקמות שמסביב, כולל שומן. הקפד להפריד את כלי הצוואר מהעצב. הסר את הלב וכלי הדם באמצעות כלים כירורגיים.
   הערה: ניתן להשתמש בתפרים להסרת כלי הדם על ידי תפירה פרוקסימלית ודיסטלית לפני הסרת הכלים.
6. הניחו רקמה על סירת רדיד אלומיניום מסומנת מראש והניחו את הסירה בחנקן נוזלי (איור 3).
7. יש לאחסן טישו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לזמן ההקפאה. הובלת רקמות עם קרח יבש לשמירה על הטמפרטורה.

3. הדמיית ספקטרומטריית מסה

1. הרכבה בהקפאה וטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) על שקופיות זכוכית
   1. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל-25 מעלות צלזיוס והכנס את הלהב.
   2. הכן צ'אק מתכת על ידי מריחת OCT ואפשר לו לקפוא בקריוסטט.
   3. קבע את בסיס הלב לתושבת המתכת המוכנה באמצעות OCT (איור 4A). אל תאפשר ל-OCT לגעת באזור הדגימה המעניין מכיוון ש-OCT יזהם את ספקטרום המסה (זיהום פוליאתילן גליקול [PEG]) וידכא אותות שומנים מעניינים.
      הערה: אפשרות לבצע הרכבה במים כדי למנוע זיהום דגימה. עיין בפרוטוקול הנוסף שלהלן לקבלת הוראות.
   4. בהתבסס על החשיבות של יישור מרחבי במתודולוגיה זו, השתמש בעיבוד הדיגיטלי המוגדל של הלב שניתן על ידי ממשק המשתמש הגרפי של MATLAB כדי להנחות את החתך (איור 4B).
   5. ספרו כל סיבוב (10 מיקרומטר) בזמן החיתוך ושימו לב לעומק במילימטרים עבור כל פרוסה שתורכב על השקופית.
      הערה: יש צורך לעקוב אחר מיקומים ספציפיים בלב או בכלי הדם להתאמה מדויקת לעיבוד הדיגיטלי של נתוני האולטרסאונד המסופקים על ידי MATLAB.
   6. הפשירו קטעי רקמה (בעובי 10 מיקרומטר) על שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: סוג השקופיות יהיה תלוי בספקטרומטר המסה בו נעשה שימוש. כל שקופית כוללת קטע אחד מכל אזור בלב. נדרשות לפחות שלוש שקופיות (מצב יון חיובי, מצב יונים שלילי, תוספת).
   7. עבור n = 1/קבוצה, חתכו את הלב דרך הציר הארוך כדי לדמיין שינויים מולקולריים מהקודקוד לבסיס.
   8. לכלי דם, הטמיעו את הרקמה בג'לטין והקפיא בזק לפני חתך¹¹.
   9. אחסן את השקופיות בדוורי שקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניסויי הדמיה של ספקטרומטריית מסה.
   10. אם מבצעים כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) כדי לזהות ולכמת עוד יותר שומנים או מטבוליטים, חתכו קטעי רקמה סדרתיים של ~60-100 מיקרומטר ואספו אותם לצינורות של 0.5-2 מ"ל לפני ההקפאה.
2. רקמת הקפאה והרכבה במים על מגלשות זכוכית
   1. מלאו במי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלי ביצועים גבוהים והניחו בצד עם מזרקים של 5 מ"ל ו-1 מ"ל.
   2. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל-25 מעלות צלזיוס והכנס את הלהב.
   3. הנח זוג מלקחיים לתוך הקריוסטט להתקרר לפני ההרכבה.
   4. שאבו 5 מ"ל מי HPLC במזרק והניחו אותם בקריוסטט.
   5. רגע לפני שהמזרק קפוא במלואו, רוקנו מים על צ'אק המתכת והניחו לו לקפוא במלואו.
   6. שאבו 1 מ"ל של מי HPLC והניחו את המזרק בקריוסטט.
   7. לאחר כ-30-60 שניות, הנח נקודה קטנה של מים מוצקים חלקית על מרכז הצ'אק. תפסו מיד את הלב בעזרת מלקחיים והניחו אותו בנקודה לפני שהוא קופא לחלוטין. החזק את הלב במקומו עד שהמים שמסביב קפאו לחלוטין.
      הערה: הלב עשוי להיות מותקן על ידי קודקוד או בסיס, בהתאם לאזור העניין. עבור מחקר זה, הבסיס יותקן כשהקודקוד פונה כלפי חוץ.
   8. בצע את שאר השלבים עבור שיטה זו כמתואר בשלב 3.1.
3. יישום מטריקס
   1. מוציאים את השקופית מהמקפיא ומניחים אותה במייבש עד שהמגלשה יבשה.
   2. הפעל את מרסס HTX M3+, פתח את אפליקציית HTX במחשב הנייד ובחר שיטה באמצע המסך. ניתן למצוא ריכוזי מטריצה סטנדרטיים בשיטות המאוחסנות (שיטות בצד שמאל של המסך > מטריצת OI_usermethods >).
      1. עבור עבודה זו, הגדר את טמפרטורת הזרבובית ל-75 מעלות צלזיוס, את קצב הזרימה ל-100 מיקרוליטר לדקה ואת הלחץ ל-10 psi.
   3. רשום את שם הדגימה, הקוטביות, המטריצה, הממס והריכוז במחברת המעבדה. חשב את כמות המטריצה הדרושה לריכוז (למשל, 5 מ"ל ב-10 מ"ג/מ"ל = 50 מ"ג מטריצה).
   4. הכינו ממס (למשל, 70% MeOH).
      1. לעבודה זו, הכינו תמיסת מטריצה של 40 מ"ג/מ"ל 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB) למצב חיובי ותמיסת מטריצה של 10 מ"ג/מ"ל 9-אמינואקרידין (9AA) למצב שלילי. הכינו את שתי המטריצות עם ממס MeOH של 70%. למטריצות נפוצות אחרות ופרמטרי ריסוס, בצע את השלבים 3.3.2.
   5. שקלו את המטריצה והוסיפו את המטריצה לצינור חרוטי של 15 מ"ל. ודא שהסכום קרוב לסכום הנדרש המחושב בשלב 3.3.3 אך אינו חייב להיות מדויק. חשב את כמות הממס על סמך המסה הנמדדת.
   6. הוסף ממס לצינור החרוטי באמצעות פיפטה.
      הערה: הנפח מבוסס על המסה שנמדדה בשלב 3.3.5.
   7. סוניקציה של התערובת למשך 10 דקות. בזמן שהמטריצה עוברת סוניקציה, הסר את השקופית מהמייבשת.
   8. פתח את מגש המרסס, הנח את המגלשה בפינה השמאלית התחתונה והדביק את הקצוות.
      הערה: קפלו קצה אחד של הסרט להסרה קלה.
   9. בחר אזור ריסוס לדוגמה . סגור את המגש.
   10. השתמש במזרק ובפילטר ושפך את המטריצה לתוך המזרק ואז סנן את המטריצה דרך המזרק לתוך הבקבוקון עם המכסה השחור בצד שמאל של המרסס.
   11. הנח את הבקבוקון בחזרה למקומו על המרסס והכנס את צינור קו ה-D לתוך הבקבוקון.
       הערה: ודא שהצינור אינו נוגע בתחתית הבקבוקון, והוא שקוע במלואו בנוזל.
   12. הפעל את הגז האינרטי וודא שהמד על המרסס קורא 10 psi. לחץ על התחל. לאחר שהמרסס נמצא בטמפרטורה הרצויה, בחר את ההתחלה המהבהבת.
   13. לאחר השלמת הריסוס, פתח את המגש, הסר את הדגימה והנח אותה במחזיק השקופיות של MALDI או בחזרה במייבש (איור 4C).
   14. סרוק את מחזיק השקופיות של MALDI והחלק על הסורק, או צלם תמונה עם טלפון. שמור את התמונה בכונן הבזק לשימוש עם MSI.
   15. בחר את הכביסה המתאימה או את התרסיס הבא על המרסס. העבר את קו ה-D מבקבוקון המטריצה לכוס הפסולת אם שוטפים.
   16. ריססו מתנול על המגש ונגבו לניקוי. כבה חנקן.
4. מאלדי MSI
   1. במחשב, נווט אל Synapt, בדוק שהקוטביות השתנתה למצב הדרוש והחלף אם לא.
   2. טען את השקופית במכשיר במקור MALDI ולחץ על כפתור הטעינה במחשב באמצעות התוכנה.
   3. העבר את התמונה (שלב 1.2.17) לתיקיית התמונות בתיקיית הפרויקט .
   4. נווט אל הדמיית HD ופתח את הפרויקט הקודם (כזה שמשתמש באותה מטריצה).
   5. במחברת מעבדה, רשום טווח מסה, לכידה והעברת אנרגיית התנגשות, אנרגיית לייזר, מצב neg/pos.
   6. בהדמיית HD, נווט אל סמל הדף הלבן. לאחר מכן לחץ על החץ הנפתח ובחר לוחית חדשה.
   7. דפדף כדי למצוא את התמונה בתיקיית Project > בתיקיית התמונות ופתח אותה.
   8. שנה את סוג הלוח ל-MALDI Standard והגדר את קצוות הצלחת (בחר 4 פינות המוצגות להלן עם סימני פלוס אדומים).
      הערה: התיבה השמאלית העליונה מיועדת לניווט לכל פינה. התיבה השמאלית העליונה מיועדת לבחירת הפינות. התיבה התחתונה מיועדת רק להמחשה חזותית של השקופית כולה.
   9. נווט אל לשונית התבנית הקטנה בפינה השמאלית העליונה ולחץ על עיפרון או אפשרויות מלבן או עיגול אחרות כדי לשרטט רקמות. מתאר רקמות באמצעות לחיצות שמאליות ולחיצה ימנית לסיום.
   10. ברירת המחדל של גודל הפיקסלים היא 50 מיקרומטר. החלף במידת הצורך.
   11. לחץ על שמירה בשם ונווט אל Project Imaging AcqFolder ותווית כשם שקופית (תבנית YYYYMMDD). לאחר מכן, שמור.
   12. לחץ על כפתור Mass Lynx באמצע העליון כדי לייצא ל-Mass Lynx.
   13. נווט אל תוכנת Mass Lynx.
   14. לחץ על קובץ > לפתוח את תיקיית הפרויקט. עריכת שם הקובץ ושם הטקסט בשקופית (תבנית YYYYMMDD).
   15. לחץ לחיצה ימנית על קובץ MS, דפדף ובחר את השקופית הנוכחית.
   16. לחץ לחיצה ימנית שוב על קובץ MS ולחץ על ערוך. לחץ פעמיים לחיצה ימנית על התיבה הכחולה.
   17. נווט אל תנאי הסריקה. מצא את הגדרות המקור ושנה למוגדר על-ידי המשתמש. לאחר מכן נווט לתיקיית הפרויקט הנכונה > התיקיה שנרכשה > השקופית הנוכחית > בסדר.
   18. שמור על ידי לחיצה על שמור בשם וכלול את שם השקופית.
   19. כייל את המכשיר באמצעות תרכובת ייחוס (למשל, זרחן אדום)
       1. נווט אל Synapt (כיול). לחץ על כפתור ההפעלה כדי להתחיל להשיג נתונים. תווית כ-YYYYMMDD_cal1 (לדוגמה: 20230614_cal1).
       2. ודא שיש לו את אותו טווח מסה 50 - 2000. אנרגיית הלייזר יכולה להיות בערך 175.
       3. לחץ על הפעל לייזר אש ולאחר מכן לחץ על הכפתור הבא . תן לזה לרוץ בערך 15 או 20. לחץ על נקודה אדומה.
       4. נווט אל קונסולת W.
       5. צור כיול ולחץ על התחל. תחת עורך פרופיל כיול, לחץ על קובץ > חדש. הקלד YYYYMMDD_cal1.
       6. ערוך את טווח המסה לטווח המסה הרצוי עבור הפרויקט (למשל, 50-2000).
       7. בחר כיול ידני. בחר מצב רזולוציה ולחץ על ערוך. בחר זרחן אדום כתרכובת ייחוס.
       8. לחץ על קובץ הנתונים הגולמיים וגלול לתחתית (זה אמור להיות מה שנרכש זה עתה).
       9. עבור להיסטוריה בתחתית, בחר Acc mass > בסדר > בסדר.
       10. המשך ללחוץ על הבא ובסדר עד שנראה כפתור ההתחלה, ולחץ על התחל.
       11. נווט לסימון ירוק ובדוק אילו פסגות לא נמצאו.
   20. נווט אל Mass Lynx (התחל את הריצה בפועל עבור דגימות ניסיוניות).
   21. לחץ על כפתור ההפעלה ובדוק שמספר הדגימות נכון
   22. נווט אל הדמיית HD.
   23. ודא שגודל הפיקסלים הוא עדיין מה שהוגדר במקור
   24. נווט אל Synapt כדי לבדוק את הקוטביות.
   25. לחץ על כפתור המצלמה כדי לוודא שהוא נע ויורה את הלייזר.
   26. בדוק וודא שהוא אוסף נתונים. יש להציג את ספקטרום המסה הנרכש בדף Synapt.
5. ניתוח טרשת נפוצה
   1. השתמש בתוכנת הדמיית HD וב-Mass Lynx לניתוח.
   2. עבד נתוני הדמיה באמצעות הכרטיסייה תהליך בהדמיית HD.
   3. דמיין תמונות יונים מולקולריות, הנקראות גם תמונות MS, בהדמיית HD בכרטיסייה ניתוח . מפת חום של תמונת יונים מולקולרית מתארת את העוצמה של אותו יון m/z על פני אזור (איור 5). השתמשו בשכבות-על של תמונות טרשת נפוצה כדי להראות את ההתפלגות המרחבית של מולקולות (איור 6 ואיור 7).
   4. נרמל נתונים באמצעות TIC או נורמליזציה מתאימה להדמיה.
   5. זהה פסגות m/z המתואמות מרחבית עם אזורי עניין. הפעל מתאם מרחבי (R > 0.65) בהדמיית HD כדי לזהות שיאים משותפים.
   6. חפש זיהוי שומנים משוער של פסגות אלה עם LipidMaps¹⁶ ו-METASPACE¹⁷.
   7. אשר הערות שומנים עם נתוני LC-MS הבאים. השתמש ב-Metaboanalyst לניתוח סטטיסטי של נתוני LC-MS.

פרוטוקולי ההדמיה שתוארו לעיל שימשו לשני מחקרים ראשוניים: עיצוב מחדש של אוטם שריר הלב (MI) והזדקנות כלי הדם. לצורך ניסויי הלב בוצע ניתוח קבוע לקשירת עורקים כליליים על מנת לגרום לאוטם שריר הלב^{החריף 18,19}. אולטרסאונד 4D ו-MALDI MSI בוצעו בהדרגה על אותה רקמה, וחשפו שינויים פיזיולוגיים ומולקולריים. תמונות יונים מולקולריות מייצגות בלב אוטם מוצגות באיור 5. ה-m/z 577.52 הוקצה כביכול כ-Cohibin C או D. למרות שיידרש ניתוח נוסף לזיהוי אנליטים (LC-MS או טנדם MS), קוהיבין נמצא בלבבות בקר²⁰ ויכול להעיד גם על שיפוץ ^21,22. שינויים במבנה החדר ובתפקודו יכולים להיות קשורים גם לוויסות למעלה ולמטה של שומני המטרה באזור המתאים (איור 6). בתמונת 4DUS, הקצה הירוק-צהוב של ספקטרום הצבעים מייצג רקמה עם גודל מתח שטח פנים של פחות מ-20%, התואם לרקמה אוטם²³. הקצה הצהוב של הספקטרום מייצג גם אזורים עם אוטם בתמונת הטרשת הנפוצה, המקבילים לשומנים הידועים כמווסתים ברקמה אוטמת²⁴. עם זאת, המיקום המדויק לא נרשם במשותף בין תמונת הלב בארה"ב לבין הרקמה החתוכה. כדי להשוות נתוני in vivo ו-ex vivo, על המשתמש לספור את מספר סיבובי הקריוסקציה כדי לחתוך לעומק מסוים מהקודקוד, כמתואר לעיל. כדי לחבר את המדידות הביומכניות מ-US ל-MSI, חיוני שהדה-לוקליזציה של האנליטים תמוזער ב-MSI²⁵. דוגמה לדה-לוקליזציה של שומנים במבט ארוך ציר של הלב מוצגת באיור 7.

עבור הזדקנות כלי הדם, נחקרו שתי קבוצות גיל של עכברי C57BL/6: צעירים (10-12 שבועות) ומבוגרים (12 חודשים) לזכרים ולנקבות. בוצע מבחן פוסט-הוק חד-כיווני של ANOVA ו-Tukey's Honest Significance Difference (HSD) להשוואת מין וגיל. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± סטיית תקן. מהירות וקוטר כלי הדם נמדדו בעורק הצוואר ובווריד הצוואר. ערכי המתח ההיקפי חושבו באמצעות משוואה 1. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 8. ערכי הזן בין זכרים צעירים (n = 5) וזכרים מבוגרים (n = 5) לא היו מובהקים סטטיסטית, ולכן שולבו כקבוצה אחת (n = 10) כדי להשוות לנקבות צעירות (n = 10) ולנקבות מבוגרות (n = 10) (איור 8A). לא היה הבדל סטטיסטי בין הקבוצות עבור מתח מחזורי היקפי (CCS). עבור המהירות הסיסטולית של הצוואר, לנקבות צעירות היו מהירויות גבוהות יותר בהשוואה לנקבות מבוגרות (p = 0.02) ולזכרים (p = 0.01, איור 8B). איור 8C מראה ייצוג מרחבי של שלוש מולקולות שונות הקיימות בקרוטיד העכבר הצעיר C57BL/6 NHsd (Envigo). הקצאות משוערות למולקולות אלה הן הם עם m/z 616.18, PC(36:2) עם m/z 808.58, וליסו PC(18:0) עם m/z 546.35. שומנים אלה הם אינדיקטורים חשובים לבריאות CV, במיוחד עבור טרשת עורקים: PC(36:2) מוגבר בעכברים טרשת עורקים²⁶וליזופוספטידילכולינים הם מרכיב פוספוליפידים של ליפופרוטאינים אטרוגניים²⁷.

איור 1: מערך ניסוי. (A) מערך אולטרסאונד עם אספקה נחוצה לפני תחילת הניסויים. (ב) בעלי חיים ואלקטרודות/בדיקה רקטלית מאובטחים במקומם באמצעות סרט. (C) מנורת חום המשמשת לשמירה על טמפרטורת הליבה של הגוף. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מערך מייצג של בעלי חיים. (א,ב) הגדרת PSLAX ותמונת PSLAX ארה"ב המתאימה, ו-(C,D) הגדרת ארה"ב ותמונת ארה"ב עבור הציר הקצר. המיקום והכיוון של הלב יכולים להשתנות בין בעלי חיים, ולכן ייתכן שיהיה צורך לבצע התאמות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שחרור הבזק באמצעות סירות רדיד אלומיניום. (א) סירות נייר אלומיניום (Al). (ב) סירות אל עם לב המונח בתוך הסירה. (C) סירות Al צפות על חנקן נוזלי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הקפאה והכנת רקמות עבור MALDI. (A) לב עכבר מורכב על צ'אק קריוסטט עם OCT. Apex מוטבע ב-OCT, אך רקמות אחרות נשארות נקיות מזיהום OCT. (B) עיבוד תלת מימד דיגיטלי בקנה מידה של החדר השמאלי המתקבל באמצעות ממשק המשתמש הגרפי 4D US MATLAB משמש להנחיית חתך. קנה המידה הוא במ"מ. (C) מגלשת זכוכית עם רקמת לב המותקנת בהפשרה, מרוססת במטריצה ומונחת במחזיק שקופיות MALDI. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונת יון מולקולה (m/z 577.52) עבור שלושה מקטעי ציר קצר של לב MI במצב יונים חיובי עם מטריצת DHB. מפת החום מציגה את העוצמה היחסית (כלומר, שפע) על פני דגימת הרקמה. עבור הקצאה משוערת זו (קוהיבין C או D), לאנליט יש שפע גבוה יותר בדופן החדר השמאלי (פיקסלים צהובים ואדומים) בהשוואה לאזורים אחרים בלב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונת החדר משמאל היא מאותו לב שמתואר בתמונת היונים המולקולרית מ-MSI שמוצגת מימין. שימו לב שהתמונה ה-4D US מתארת רק את ה-LV, ותמונות MS מציגות חתך רוחב של הלב כולו. אזורים המצולמים עם MALDI MSI מסומנים A-F. כאן היו מיוצגים אזורים B, C ו-D. מפות חום שכבות מתארות שומנים מווסתים למעלה ולמטה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: שכבת-על של ארבע תמונות m/z של לב עכבר (מטריצה, heme, PC(38:6) ו-PC(40:6)). החצים הוורודים מצביעים על דה-לוקליזציה של heme ו-PC (38:6) מכיוון שהאנליטים הללו חופפים לשיא המטריצה מחוץ לאזור הלב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: תוצאות מייצגות. (A) מתח היקפי של עורק הצוואר בין שלוש קבוצות ללא הבדל סטטיסטי בין האמצעים. (B) מהירות הצוואר הסיסטולי הייתה גבוהה יותר אצל נקבות צעירות בהשוואה לנקבות מבוגרות (p = 0.02) וזכרים (p=0.01). (C) כיסוי מולקולרי של שלוש מולקולות שונות בעורק הצוואר. אדום מייצג הם עם m/z 616.18, לבן מייצג מולקולה עם m/z 808.58, וסגול מייצג מולקולה עם m/z 546.35. תמונה זו מציגה לוקליזציה של שומנים בעלי עוצמת אות גבוהה ברקמת הצוואר הנקבית הצעירה C57BL/6. M: זכרים (משולבים צעירים ומבוגרים), YF: נקבה צעירה, AF: נקבה מבוגרת. N=30 אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: בעיות נפוצות ושלבי פתרון בעיות עבור דוגמאות להקפאה.

הדמיה בארה"ב יכולה להיות תלויה במפעיל, אך השימוש בציוני דרך אנטומיים והכשרה מתאימה יכולים להגביל את הטיית המשתמש. אולטרסאונד דו-ממדי רגיש במיוחד לשונות בין משתמשים מכיוון שהנופים תלויים בזווית, בעוד ש-4DUS פחות רגיש מכיוון שהרכישה מקיפה את כל הנפח ואינה תלויה בזווית. כמו כן, נקבע כי קל יותר להשיג שחזור תמונה בגלל פלטפורמת בעלי החיים המתכווננת ומחזיק המתמר. איסוף נתונים בארה"ב צריך להתבצע באופן אידיאלי על ידי אותו חוקר לאורך כל המחקר כדי למנוע שינויים בנתונים שמקורם בטכניקה.

שמירה על טמפרטורת הליבה של הגוף חשובה מכיוון ששינויים בטמפרטורה יכולים לשנות את ההמודינמיקה הקרדיווסקולרית ואת המדידות הביומכניות 28,29,30,3 1. בנוסף לצלחת המחוממת להדמיה, מומלץ להשתמש גם בתנור חימום חיצוני, כגון מנורת חום, כפי שמוצג באיור 1. מנורת חום זו מותאמת על ידי המשתמש לשמירה על טמפרטורת פי הטבעת של 37 מעלות צלזיוס.

עבור הדמיית אולטרסאונד, שמות מחקר/סדרות חשובים עבור מערכי נתונים גדולים. עבור תמונות 4D, מוסכמת השמות צריכה להיות עקבית, ויש לכלול את מזהה העכבר בעת מתן שם לתמונה 4D לפני השמירה. בשל סוגי הקבצים השונים, התמונה התלת-ממדית לא תישמר באופן אוטומטי עם התמונות האחרות במחקר. לכן, אם מזהה העכבר אינו כלול בשם התמונה ה-4D, יהיה קשה להבדיל איזו תמונה מתאימה לחיה המנותחת. לצורך ניתוח תמונה, כדי למזער הטיות, החוקר יכול להיות עיוור לקבוצות בעלי חיים.

משאבים נוספים להדמיה וניתוח אולטרסאונד ניתן למצוא במרכז הלמידה של VisualSonics: https://www.visualsonics.com/learning-hub-online-video-training-our-users
להדמיה עם גרסה קודמת של מערכת האולטרסאונד Vevo, עיין במאמר שפורסם בעבר¹³.

לצורך קצירת רקמות והקפאתן, הרקמה עלולה להיסדק אם סירות נייר האלומיניום שוקעות. הקפד לטפל בדגימות קפואות בעדינות מכיוון שהדגימות הקפואות שבירות מאוד. אל תכריח את הרקמה הקפואה לתוך צינורות קטנים. אנו ממליצים על צינורות חרוטיים של 50 מ"ל להובלה ואחסון. עבור חיתוך הרקמה, טבלה 1 כוללת שינויים שנמצאו כנקודות התחלה מועילות לפתרון בעיות. הקפד לא לאפשר ל-OCT לזהם את החלק המותקן בהפשרה. OCT מכיל PEG, שהוא מזהם בספקטרומטריית מסה. כאשר מתבוננים בספקטרום, חזרה שכיחה של 44 Da מעידה על זיהום PEG. PEG נמצא גם בחומרי ניקוי רבים, ולכן אין לנקות כלי זכוכית עם חומרי ניקוי ובמקום זאת לנקות אותם עם אתנול לפני החיטוי. אמנם מייגע יותר, אך הרכבה במים מבטלת את המגבלה של זיהום דגימת OCT.

עבור MALDI MSI, יישום המטריצה חיוני לספיגת לייזר נאותה ולמזעור דה-לוקליזציה אנליטית²⁵. אם רוצים פרוטוקולי מטריצה חדשים, יש לבדוק אותם לפני היישום על רקמת הניסוי. בנוסף, ניתן לצבוע רקמות על השקופיות לצורך היסטולוגיה לאחר רכישת נתוני MSI¹¹ או שניתן לרכוש תמונת מולטיפלקס עם הדמיה חוזרת³².

מגבלה של פרוטוקול זה היא היעדר רישום משותף של מערכי הנתונים שהוא המוקד של עבודתנו העתידית. עם זאת, על ידי ספירת הסיבובים בחיתוך, המשתמש יכול לקבוע איזה מיקום פרוסה מתאים לאזורים הפונקציונליים שנותחו מה-4DUS, מה שמאפשר למשתמש להשוות ספקטרומטריית מסה ומדדי אולטרסאונד במיקומים ספציפיים בלב. עבור פרוטוקול זה, המטרה היא לקבוע את ההרכב המולקולרי (MSI) במיקומים של הלב התואמים לשינויים במדדים התפקודיים בנתוני הזן התלת-ממדי (US). פרוטוקול זה אינו רושם נתוני פיקסלים בין נתוני ex vivo ו-in vivo מכיוון שה-4D US מספק נתונים ביומכניים פונקציונליים. עם זאת, חוקרים אחרים החלו לפתח טכניקות חישוביות לרישום משותף של הדמיה ex vivo עם שיטות in vivo המספקות מידע מולקולרי רב יותר בפיקסלים/ווקסלים כגון הדמיה פוטו-אקוסטית³³, הדמיית תהודה מגנטית (MRI)³⁴, MRI עם אולטרסאונד³⁵, או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים (PET-CT)^36,37.

פרוטוקול זה יכול לתרום לזיהוי סמנים ביולוגיים מולקולריים של מחלה ולשייך אותם לתופעות פיזיולוגיות המביאות לשינויים ביומכניים תפקודיים של החדר השמאלי. ניתן להתאים את המתודולוגיה שנקבעה כאן לחקר מספר עצום של תופעות פיזיקליות על ידי התאמת מדדים פונקציונליים מעניינים ו/או שינוי פרוטוקול MALDI MSI כדי להתמקד במולקולות ספציפיות. למרות ששומנים נחקרו בפיתוח פרוטוקול זה, ניתן להשתמש באותה מסגרת לגישה מולטיומית, חקר חלבונים, גליקנים, מטבוליטים וכו' ביחס לשינויים הפיזיולוגיים והתפקודיים המזוהים עם הדמיה וניתוח 4D US.

לסיכום, פותח פרוטוקול הדמיה רב-מודאלי להערכת תפקוד הלב וכלי הדם והמבנה המולקולרי. טכניקה זו עשויה לאפשר לחוקרים להשתמש בהדמיה לא פולשנית in vivo ובהדמיה מולקולרית ex vivo כדי לזהות סמנים ביולוגיים חדשים להדמיה ולהעריך טיפולים חדשים.

קרייג ג'יי גרגן הוא יועץ בתשלום של FUJIFILM VisualSonics.

אליסון ג'ונס נתמכת על ידי מלגת בוגר המחלקה להנדסה מכנית, אווירונאוטיקה וחלל וביו-רפואית של אוניברסיטת טנסי. המחקר שדווח בפרסום זה (קונר ארל) נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות F30HL162452. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.