Method Article
* These authors contributed equally
מאמר זה מפרט את התכנון, ההרכבה והפרוטוקול של מערכת הזנה אוטומטית יחד עם מכסה חלופי ושינוי כלוב שניתן ליישם בכלובי מכרסמים סטנדרטיים עם שינויים מינימליים לניסויים אופטוגנטיים או פוטומטריית סיבים קשורים. מערכת ההזנה מציעה כלי חסכוני להאכלה מתוזמנת ו/או הגבלת קלוריות.
צום לסירוגין ומחקרים סביב ההשפעה של הגבלת קלוריות מתוזמנת על ויסות משקל הגוף ותוצאות ההזדקנות הם מגמה, הן בחברה והן במעבדה. כדי לחקור האכלה מוגבלת בזמן ו/או הגבלת קלוריות במעבדה, כמויות המזון המוקצות מפוזרות במרווחי זמן קבועים. הטכנולוגיה הנוכחית להאכלה מתוזמנת של מכרסמים כוללת כלובים מיוחדים עם פתחי כניסת מזון מגודרים, קופסאות דיגיטליות נעולות בזמן או משלוח מזון ידני. ציוד מיוחד לניסויים כאלה יכול להיות יקר והאכלה ידנית דורשת לעתים קרובות מהחוקרים להגיע לשעות הלילה המאוחרות / הבוקר המוקדמות, מה שמונע מחקרים ממושכים. מערכת ההזנה האוטומטית המתוארת כאן מספקת כלי חסכוני להאכלה מתוזמנת ו/או הגבלת קלוריות שניתן ליישם בכלובי מכרסמים סטנדרטיים עם שינויים מינימליים. הפרוטוקול משתמש במזין אוטומטי מהמדף המצויד במכסה כלוב מיקרו-מבודד סטנדרטי (מכסי כלוב עכבר, אוגר, חולדה או שרקנים) ויכול לנהל את הקצאות המזון הרצויות במרווחי זמן מתוכנתים בכלוב הביתי של החיה. ניתן לשנות את העיצוב שלנו כדי לקבל מזינים שונים או שינויים קלים במידות הכלוב. אנו מספקים את התכנון, ההרכבה והפרוטוקול של מערכת ההזנה יחד עם שינוי מכסה וכלוב חלופי לניסויים אופטוגנטיים או פוטומטריית סיבים קשורים.
צום לסירוגין הוא תחום חשוב במחקר מטבולי והזדקנות. התאמה נכונה של האכלה ושעון ביולוגי יכולה לשנות את השפעת התזונה על משקל הגוף 1,2,3,4. יתר על כן, צום לסירוגין ממושך קשור לאריכות ימים מוגברת ולשיפור בהפרעות הקשורות לגיל 5,6,7,8. מחקרים המיישמים פרוטוקולי צום ארוכי טווח (>20 יום) דורשים בדרך כלל ציוד מיוחד. אמנם ניתן לספק מזון באופן ידני לפרוטוקולי האכלה מתוזמנים, אך הדבר עשוי לדרוש מהחוקר להיות נוכח בנקודות זמן רבות מחוץ לשעות הפעילות לתקופה ממושכת. לדוגמה, שלושה זמני האכלה בהפרש של 4 שעות ידרשו אספקה ידנית בשעות 20:00, 00:00 ו-4:00 לפנות בוקר; סביר להניח שמדובר באתגר ציות שיימשך יותר מכמה ימים.
חלופות למשלוח מזון ידני למכרסמי מעבדה הן 1) כלובים מיוחדים עם גישה אוטומטית למזון או 2) מערכות הופר דיגיטליות המספקות גישה אוטומטית ומתוכנתת למזון, כגון FED39. מערכות כלובים עם גישה למזון מגודר הן יקרות וחלקן אינן מספקות סביבת כלוב ביתית מתאימה למחקרים ארוכי טווח. לדוגמה, קופסאות מיזוג אופרנטיות מסורתיות מסוגלות לספק מזון אוטומטי אך יש להן רצפה מגוררת חוט שאינה תורמת לדיור לטווח ארוך. מערכת BioDAQ מבית Research Diets מספקת מזון ומים דרך יציאות חיצוניות מגודרות. שערים אוטומטיים הניתנים לתכנות מאפשרים מחקרי האכלה או שתייה מתוכננים לטווח ארוך, עם זאת, המערכת היא השקעה יקרה. מערכות הופר ממוכנות הן כלי נוסף לפרוטוקולי הזנה מתוזמנים אוטומטיים 9,10. שני ההופרים הממוכנים שצוטטו מגיעים עם אזהרה של צמצום שטח המחיה בכלוב הביתי. בעלי חיים רעבים מוגבלים במזון עלולים ללעוס את מכשירי ההאכלה ו/או פסולת כלוב עלולה להפריע למכניקת המיכל למחקרים ארוכי טווח. לבסוף, הופר ממוכן שפותח על ידי קבוצת המחקר Takahashi יחד עם Phenome Technology תוכנן במיוחד למחקרי הזנה מתוכננים לטווח ארוך3. במערכת זו, הופר ממוכן ממוקם מעל מתלה התיל של כלוב סטנדרטי עם מצנח המספק מזון. מערכת הפנום, לעומת זאת, אינה מספקת גמישות לבעלי חיים הקשורים לכבל תיקון (ניסויים אופטוגנטיים/פוטומטריית סיבים), והיא יקרה יחסית למנגנון ההזנה האוטומטי המתואר כאן.
בתגובה לאתגרים הרווחים בפרוטוקולי האכלה מתוזמנים, אנו מציעים תרופה חסכונית. המערכת האוטומטית שלנו מאפשרת משלוח מזון מדויק במרווחי זמן קבועים מראש. עם שילוב של חלקים מודפסים בתלת מימד יחד עם מזין דגים אוטומטי זמין מסחרית, אנו מתכננים מערכת האכלה חיצונית עשה זאת בעצמך (עשה זאת בעצמך) הניתנת להתקנה על כלובי מכרסמים עצמאיים המשתמשים בצמרות מיקרו-מבודדים. ניתן ליישם את מערכת ההזנה והחלקים המתוארים כאן ישירות על כל אחד מכלובי המכרסמים הבאים: עכבר, חולדה, אוגר או שרקן, בתנאי שהכלובים העצמאיים משתמשים בצמרות מיקרו-מבודדות. מכיוון שהכלובים משתנים בגודלם, המיקומים עשויים להשתנות מעט, אך התושבות המודפסות בתלת מימד, מערכת ההזנה ועיצוב בקבוק המים החיצוני ישימים בדרך כלל על פני כלובי מכרסמים עצמאיים עם מכסי מיקרו-מבודדים.
אנו מציגים דוגמה אחת להזנה אוטומטית, אך קיימים מזינים אוטומטיים רבים אחרים מהמדף וניתן להתאים אותם למערכת המודולרית עם שינויים קלים בחלקים המודפסים בתלת מימד. כדי להקל על התאמת המחזיק המודפס בתלת מימד למזינים חלופיים או לשינויים קלים במידות הכלוב, אנו מוכיחים קובץ SolidWorks תלת מימדי הניתן לשינוי עם קובץ STL נלווה.
המיקום החיצוני של המזין האוטומטי מספק מקום מלא בתוך כלוב הבית ומאפשר ניתוק, עיקור וטעינה מחדש או החלפה של המזין ללא הפרעה לבעל החיים. מערכת ההזנה האוטומטית יעילה להקלטות ארוכות טווח, משתלמת וניתנת לפרוטוקולי האכלה ו/או הגבלת קלוריות מוגבלים בזמן. אנו מספקים שרטוטים טכניים מפורטים של מכלולי הכלוב, התכנון והפרוטוקול ליישום מערכת ההזנה, יחד עם נתוני דגימה. שנית, אנו מספקים סט של הוראות לשינוי כלוב סטנדרטי לשימוש במזין האוטומטי עם בעלי חיים הקשורים לכבל תיקון לניסויים אופטוגנטיים או פוטומטריית סיבים.
כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מסצ'וסטס אמהרסט.
1. הרכבת מזין אוטומטי על מכסה כלוב מיקרו-מבודד סטנדרטי (איור 1)
איור 1: שינוי והרכבה של תושבת המזין האוטומטי ומכסה הכלוב. (א) שרטוט טכני של תושבת המזין האוטומטי (ראה SolidWorks/STL files בקובץ משלים 1 לקנה מידה בתלת מימד). (B) משמאל לימין, כלוב עם חור של 20 x 25 מ"מ; תושבת מותקנת על החלק העליון של הכלוב ומותקנת עם מזין אוטומטי של Petbank. (ג) מזין אוטומטי מורכב של Petbank על כלוב עם כדור מזון שנפל על רשת רגילה עם בקבוק מים. מוטות קנה מידה = 25 ס"מ). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
2. תכנות ושימוש בדוגמה למזין אוטומטי מהמדף
3. מערכת כלוב שונה לבעלי חיים קשורים עם המזין האוטומטי
איור 2: הרכבת לוח אקרילי על החלק העליון של הכלוב. (א,ב) שרטוטים טכניים של צלחת אקרילית ותקע יציאת מזין. (C) חלק עליון של כלוב שמאלי סטנדרטי עם תוספת מחוררת ומסנן. מרכז, הסרת התוספת והמסנן המחוררים (יש לחתוך רשת מצולעת לאורך הקווים המצוינים בחץ). נכון, צלחת אקרילית נצמדה למקומה. (ד) מכלול מכסה שלם. פסי קנה מידה = 25 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מכלול תושבת בקבוק מים. (א) שרטוט טכני של תושבת בקבוק מים מודפסת בתלת מימד. (ב) שינויים בכלוב והרכבת תושבת בקבוק מים; (ג) תושבת מותקנת; (ד) מכלול כלוב מלא. פסי קנה מידה = 10 ס"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סיכום של מכלול כלוב שלם עם המזין האוטומטי. (A) כלוב סטנדרטי עם מתלה תיל, (B) כלוב מותאם עבור בעלי חיים קשורים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
מחקר הגבלת קלוריות (21 יום) לגרימת אי פוריות בעכברים נקבות (עיצוב מזין אוטומטי וכלוב, איור 4A)
מחסור כרוני באנרגיה מספיק כדי לעכב פוריות אצל יונקים, תגובה שנשמרת אצל מכרסמים ובני אדם כאחד11,12. במחקר זה, אנו משתמשים בהגבלת קלוריות כדי לגרום לירידה במשקל הגוף לטווח ארוך. נקבות עכברים בוגרות C57BL/6, בגילאי 15-18 שבועות, היו חד-ביתיים ובמחזור אור:חושך של 12:12 שעות, עם כיבוי אורות ב-Zeitgeber Time 12 (ZT12). מתלה התיל שהכיל מזון נשקל מדי יום עבור כל בעל חיים במשך שבוע כדי לקבוע את צריכת המזון הבסיסית, 3.80 ± 0.64 גרם ליום (ממוצע ± SE). לאחר מכן, המזון הוגבל כדי לגרום לירידה במשקל. המזון חולק לשלוש מנות וחולק על ידי המזין האוטומטי על פני שלושה מרווחים: ZT 12, 16 ו-20 (תצורת כלוב, איור 4A). במשך 48 השעות הראשונות, החיות הוגבלו ל-50% מצריכת המזון הבסיסית. לאחר מכן, החיות הוגבלו ל~70% מהמזון הבסיסי במהלך 19 הימים הבאים, עם התאמות קלות במחצית השנייה של ההגבלה כדי לשמור על 80-90% ממשקל הבסיס (איור 5A, למטה).
בין ZT 0 ל-ZT 1, החיות נשקלו והוערכו כדי לשלב את מחזור הביוץ על ידי אפיון היסטולוגי של תאים שנאספו על ידי שטיפת נרתיק עם 0.1 M מלח חוצץ פוספט. אורך המחזור נוטר לפחות 11 ימים לפני ובמהלך ירידה של 80-90% במשקל. ירידה מתמשכת במשקל של יותר מ-10% הספיקה כדי לגרום לאי פוריות בעכברים נקבות, כפי שפורסם בעבר11.
המזינים האוטומטיים נסקרו מדי יום לסיבוב נכון ומשלוח מזון (שלב פרוטוקול 3.1). כל מזון שנשאר על הקרקע או נשאר ברשת הושלך. למזין לדוגמה המוצג כאן יש 16 תאים וניתן להגדיר אותו לספק מזון בשלושה מרווחים (ראה טבלת חומרים). קבענו כי נפח הצ'או המרבי שמתאים לתא הוא 2 גרם, אותו ניתן לחתוך או להזמין לפי גודל. קבענו גם שמשלוחי מזון לוקחים ~10 שניות ברגע שמגיעים לזמן המתוכנן. לוקח 7 שניות עד ששער הרצפה נפתח במלואו ולאחר מכן עוד 3 שניות עד שהתא יעבור מעל הפתח, ויחלק את כדור המזון. ישנם רעשים החופפים לפתיחת השער וכדור המזון נופל לתוך מדף ריק (וידאו 1, עם הקלטת קול).
במהלך 21 ימים, ראינו דיוק מלא של סיבובים ומשלוח מזון באמצעות מזין ספציפי זה מבית Petbank (טבלת חומרים). בזמן הבדיקה, המזינים היו בין 3 ל-6 חודשים מהשימוש הראשוני שלהם והסוללות הנטענות הפנימיות שמרו על אינדיקציות טעינה מלאה במשך כל הניסוי של 21 יום. מכיוון שמדובר במדגם קטן יחסית של מזינים (n = 4), ערכנו מחקר נוסף בן 21 יום עם 10 מזינים אוטומטיים, שנועדו לחלק מזון בקצב תואם. המחקר הבא בוצע 10 חודשים לאחר השימוש הראשוני במזינים. במהלך 21 ימי הניסוי, מזין אחד איבד מוט כוח בודד (~25% אובדן חשמל) ביום ה-15 ואחר איבד מוט בודד ביום ה-17, בעוד של-8 המזינים הנותרים היו אינדיקציות טעינה מלאה במשך כל 21 הימים. רמת ההספק במזין לדוגמה מסומנת כארבעה פסים. הכימות שלנו מניח שכל עמודה מייצגת 25% הספק. כמו בבדיקה הראשונית שלנו, המאכילים במחקר שלאחר מכן ביצעו שוב סיבוב ומשלוח מזון ללא טעויות במשך המחקר.
איור 5: מסלול משקל גוף עם נתוני מחזור אסטרוס בשכבת-על בעכברים נקבות במהלך הגבלת קלוריות באמצעות המזין האוטומטי. (A) מסלול ירידה ממוצע במשקל (למטה) באמצעות המזין האוטומטי כדי לספק 50-70% מצריכת המזון הבסיסית על פני שלוש נקודות זמן (בהפרש של 4 שעות, החל מכיבוי האורות). נתוני מחזור אסטרוס מייצגים מיושרים עם ירידה במשקל (למעלה). הדגשה אפורה מצביעה על ירידה במשקל של יותר מ-10% מהמשקל ההתחלתי. חץ מציין חזרה לגישה למזון אד ליביטום על ידי מילוי מתלה החוט במזון והסרת המזין האוטומטי. (B) רכיבה על אופניים במהלך ירידה במשקל; השוואה בתוך הנבדק של אחוז זמן בדיסטרוס כאשר בעלי חיים הם בין 1% ל-10% (מוט פתוח) ירידה במשקל לעומת ירידה של >10% במשקל (עמודה אפורה; הערה: עצירה בדיסטרוס היא סימן לאי פוריות) n = 4. (C) חלקת מפל של ירידה במשקל לעומת רכיבה על אופניים. עם ירידה של עד 8% במשקל, 100% מבעלי החיים היו פוריים ומחזוריים, בעוד שבירידה של 20% במשקל, 100% מבעלי החיים היו א-מחזוריים ועקרים. קיצורים: P = proestrus; E = אסטרוס; D = דיסטרוס. קווי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
סרטון 1: רעשים המצביעים על פתיחת שער וכדור המזון נופל לתוך רשת ריקה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
קובץ משלים 1: קובץ Zip המכיל את השרטוט הטכני וקבצי SolidWorks + STL עבור תושבת המזין האוטומטי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 2: שרטוט טכני של הלוח האקרילי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 3: קובץ Zip המכיל את השרטוט הטכני וקבצי SolidWorks + STL עבור תקע היציאה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
קובץ משלים 4: קובץ Zip המכיל את השרטוט הטכני, קבצי SolidWorks + STL עבור תושבת בקבוק המים ומחזיק הבקבוקים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, הגבלת קלוריות היא כלי ניסיוני רב עוצמה למניפולציה מדויקת ולחקר חילוף החומרים. לירידה מתמשכת במשקל יש השלכות על השמנת יתר, סוכרת, הזדקנות, פוריות וגיל המעבר (סוג של הזדקנות רבייה), כולם נקודות קצה חשובות לתרגום. עם זאת, פרדיגמות הגבלת קלוריות יכולות להיות קשות לשמירה לאורך זמן. בכתב יד זה, אנו מציעים פתרון חסכוני להשגת הגבלה קלורית לטווח ארוך בסביבה מעבדתית. מסופקות הוראות לחיבור מזין אוטומטי מהמדף לכלוב מכרסמים עם מכסה מיקרו-מבודד סטנדרטי. המזין מורכב בכלוב הביתי של החיה ומתוכנת לספק מזון בזמנים קבועים. משלוח מזון מתוזמן שולט בכמות ובתזמון הגישה למזון ואינו כולל מטפל שנכנס לחדר. יתר על כן, המערכת החסכונית יכולה לפעול לתקופה ממושכת (חודשים), ולשפר את היכולת להשיג הגבלה קלורית לטווח ארוך בסביבת מעבדה.
ההתקדמות האחרונה במדעי המוח מאפשרת לחוקרים לתמרן או להקליט מתאי עצב המקדמים הזנה בבעלי חיים ערים ומתנהגים. באופן ספציפי, הקלטות פוטומטריית סיבים (טכניקת הקלטה in vivo) של הזנת נוירונים בוצעו עם רצף של צום, כדי לקדם פעילות עצבית, ולאחר מכן הזנה מחדש, כדי לחקור שינוי בפעילות העצבית 13,14,15. אמנם עדיף לבצע הקלטות in vivo בכלוב הבית של החיה,אך לעתים קרובות הן מבוצעות בזירה חיצונית כדי לספק ניידות כשהם קשורים לכבל תיקון. יתר על כן, הקלטות in vivo יכולות להיות מושפעות ממטפל שנכנס לחדר ללא אמצעי גישה למזון מגודר. כדי לטפל בשתי הבעיות המבלבלות עבור הקלטות פוטומטריה של נוירונים במעגלי ההזנה, תכננו שינוי בכלוב ביתי כדי לאכלס בעלי חיים קשורים לתקופה ממושכת, המחוברים למזין האוטומטי (סעיפי פרוטוקול 3 ו-4). מגבלה לגישה זו היא שעיצוב הכנסת מכסה הכלוב דורש חותך לייזר. בעוד שניתן להשתמש בכלי סיבובי ובמכשיר ניקוד כדי לחתוך את התוספת האקרילית, סביר להניח שהכלים ייכשלו ביצירת לשוניות קטנות וחריץ דק.
ישנן מגבלות למערכת ההזנה המתוארת כאן. כלומר, ההרכבה דורשת חלקים מודפסים בתלת מימד. יתר על כן, השעון של המזין האוטומטי לדוגמה פועל במחזור של 24 שעות, כך שתזמון אספקת המזון למחקרים צירקדיים חייב להיות מותאם ידנית לתקופת הריצה החופשית של החיה17. לבסוף, המכשיר מוגבל ל -16 תאים ושלושה מרווחי זמן מתוכנתים. המזין מחלק מזון; זה לא עוקב אחר הצריכה. מזון שאינו נצרך במשך זמן מוגדר, ניתן להוציא מרצפת הכלוב או ממתלה הרשת, אך ייתכנו טעויות בחשבונאות ואחזור מזון שלא נאכל.
כדי להדגיש את היתרונות של מזין אוטומטי מסחרי מהמדף המצויד בכלוב מכרסמים סטנדרטי, אנו מראים שהמכשיר ידידותי למשתמש ומספק הקצאות מדויקות של מזון במרווחי זמן ספציפיים. מערכת זו אינה חוסמת את אזור הכלוב הביתי. מכיוון שהמזין ממוקם מחוץ לכלוב של בעל החיים וניתן לנתק אותו בקלות מהמחזיק המודפס בתלת מימד, ניתן לבצע תחזוקה שוטפת, מילוי מזון וניקוי עם הפרעה מינימלית לבעל החיים.
כדוגמה, השתמשנו במזין האוטומטי כדי לגרום להגבלת קלוריות ובסופו של דבר לאי פוריות. אנו מדגימים את השימוש במזין האוטומטי במחקר הגבלת קלוריות של 21 יום (איור 5) ולאחר מכן השתמשנו במזינים לניסויים רבים במעבדה. כפי שמתואר בתוצאות, המזינים היו אמינים והעבירו מזון מדויק. נראה כי הסוללה הפנימית הנטענת פוחתת מעט עם הזמן, אך לאחר כמעט שנה של שימוש במזינים, הם פועלים לפחות 15 יום לפני שהם רושמים אפילו הפסקת חשמל קלה. ההערכה היא על ידי היצרן כי הסוללה יכולה לפעול במשך 60 יום, החל מטעינה מלאה. למחקרים ממושכים (>30 יום), רצוי שיהיו מזינים חלופיים טעונים במלואם כדי להסתובב פנימה כאשר חיי הסוללה של המזין נמוכים מ-50% מהטעינה המרבית.
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
ג'ייסון לי נתמך על ידי תוכנית החינוך המחקרי לאחר הבגרות במימון המכונים הלאומיים לבריאות.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#7 Stopper W/ 3-1/2" curved sipper tube no ball | Labex | 2067 | |
AN75 mouse cage bottom | Ancare | AN75HT | |
Automatic Fish Feeder for Aquarium | Petbank-tek.com | Amazon distribution (#B0BRCWP16K) | |
Rodent Micro-filter Tops | Ancare | N10MBTPLF | |
Rubber Stoppers, One Hole | United Scientific | S24009 | |
standard rodent chow | Prolab IsoPro 3000 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved