הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

Vasiliki Pantazi; Ivett Berzsenyi; Barbara N. Borsos; Tibor Pankotai

doi:10.3791/62175

Summary

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

Abstract

תאים נחשפים ללא הרף לחומרי DNA שונים הפוגעים בדנ"א, מה שמעורר תגובות תאיות שונות. יישום גישות ביוכימיות וגנטיות חיוני בחשיפת אירועים תאיים הקשורים לגיוס והרכבה של מתחמי תיקון DNA באתר של נזקי DNA. בשנים האחרונות פותחו מספר כלים רבי עוצמה כדי לגרום לנזק דנ"א ספציפי לאתר. יתר על כן, טכניקות שמיות חדשניות מאפשרות לנו ללמוד תהליכים אלה ברמת הרזולוציה של תא אחד באמצעות תאים קבועים וחיים כאחד. למרות שטכניקות אלה שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים שונים, בזאת אנו מציגים את הפרוטוקולים הנפוצים ביותר בתחום תיקון ה- DNA, חיסון פלואורסצנטי (IF) ו- Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), אשר בשילוב עם נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז מאפשר לדמיין ולכומת את התפוסה הגנומית של גורמי תיקון DNA בצורה מכוונת ומוסדרת, בהתאמה. טכניקות אלה מספקות כלים רבי עוצמה לחוקרים לזהות חלבונים חדשניים הקשורים ללוק הגנומי הפגוע, כמו גם את השינויים שלאחר התרגום הדרושים לוויסות הכוונון שלהם במהלך תיקון ה- DNA.

Introduction

הגנום שלנו מאותגר כל הזמן על ידי סוכני DNA שונים המזיקים. תקיפות אלה יכולות לנבוע ממקורות סביבתיים, כגון אור UV או הקרנה, כמו גם ממקורות אנדוגניים, כגון תוצרי לוואי מטבוליים הנגרמים על ידי עקה חמצונית או שגיאות^{שכפול 1}^,². נגעים אלה יכולים להשפיע על השלמות של גדיל DNA אחד או שניהם, ואם השגיאות שנוצרו להיות מתמשך, זה מוביל לעתים קרובות translocations וחוסר יציבות גנום, אשר עלול לגרום tumorigenesis³^,⁴. כדי לשמור על שלמות הגנום, פותחו מערכות תיקון מרובות במהלך האבולוציה. על פי התכונות הכימיות והפיזיות של סוגים מסוימים של נזק DNA, מנגנוני תיקון מרובים ניתן להפעיל. אי-התאמות, אתרים אבסיים, הפסקות גדיל יחיד ו-8-אוקסוגאנין (8-אוקסוג'י) ניתנים להסרה על ידי תיקון אי התאמה או מסלול תיקון כריתת בסיס^5,⁶. נגעים הנגרמים על ידי יצרנים פוטו הנגרמים על ידי UV ותוספים מגושם ניתן לתקן או על ידי תיקון נוקלאוטיד כריתה (NER) או DNA כפול גדיל לשבור^{תיקון תהליך}(DSBR) 7^,⁸. NER מורכב משני מסלולי משנה עיקריים: NER מצמיד תמלול (TC-NER) ו- NER גנומי גלובלי (GG-NER). לגבי שלב מחזור התא, בעקבות אינדוקציה של שבירת גדיל כפול DNA, ניתן להפעיל שני נתיבי משנה: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) ושילוב הומולוגי (HR)¹^,⁹. NHEJ, שהוא המסלול הדומיננטי בתאי מנוחה, ניתן להפעיל בכל שלבי מחזור התא, המייצג מסלול מהיר יותר אך נוטה לשגיאה¹⁰. מצד שני, HR הוא מסלול ללא שגיאות, שבו DSBs מתוקנים בהתבסס על חיפוש רצף-הומולוגיה של הכרומטידים האחות, ולכן הוא קיים בעיקר בשלבי מחזור תא S ו- G2¹¹. יתר על כן, הצטרפות קצה בתיווך מיקרוהומולוגיה (MMEJ) הוא מנגנון תיקון DSB נוסף, נבדל מאלה הנ"ל, המבוסס על KU70/80- ו RAD51-עצמאי דרך של קשירה מחדש של רצפים מיקרוהומולוגיים שנקטפו בעבר לאגף את קצות ה- DNA השבורים. לכן, MMEJ נחשב נוטה שגיאה מוטגני מאוד¹². במהלך תיקון DNA, DSBs יכול לגרום לתגובת נזק לדנ"א (DDR), אשר גורמת להפעלה של קינאזות נקודת ביקורת שעוצמות את מחזור התא במהלך^{תיקון 13}^,¹⁴^,¹⁵. DDR מופעל כתגובה לגיוס והתפשטות נרחבת של שחקני מפתח יוזמים של תהליך התיקון סביב הנגעים, התורם להיווצרות של מיקוד תיקון. במפל איתות מוקדם זה, הכספומט (אטקסיה Telangiectasia Mutated) קינאז ממלא תפקיד מרכזי על ידי זירוז הזרחן של וריאנט הייסטון H2AX ב Ser139 (המכונה γH2AX) סביב הנגע¹⁶. אירוע מוקדם זה אחראי לגיוס גורמי תיקון נוספים ולייזום תהליכי תיקון במורד הזרם. למרות הפונקציה המדויקת של החלבונים המגויסים במוקד התיקון עדיין לא התאפיינה במלואה, היווצרות ודינמיקה של מוקדי תיקון נחקרו על ידי מספר מעבדות. סמנים אלה משמשים בהרחבה כדי לעקוב אחר קינטיקה תיקון, אבל התפקיד המדויק שלהם במהלך תהליך התיקון נשאר חמקמק. בשל החשיבות הרבה אך הבנה לקויה של תהליכים תאיים הקשורים לתיקון DNA, פותחו עד כה מספר שיטות כדי לגרום ולדמיין את ה- DDR.

הוקמו שיטות ומערכות שונות כדי לגרום לסוג הרצוי של נזק לדנ"א. לדוגמה, סוכנים מסוימים [כגון neocarzinostatin (NCS), phleomycin, bleomycin, γ-הקרנה, UV] יכולים לגרום למספרים גדולים של הפסקות DNA אקראיות בתנוחות גנומיות לא חזויות, בעוד שאחרים (אנדונוקלאז, כגון AsiSI, I-PpoI או I-SceI, כמו גם פס לייזר) יכולים לגרום לשברים DNA ב loci גנומי ידוע¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. כאן, אנו מתמקדים בטכניקות מבוססות אנדונוקלאז המשמשות כיום לחקר ה- DDR בתאי יונקים ושמרים. מלבד הדגשת העקרונות של טכניקות אלה, אנו מדגישים הן את היתרונות והן את החסרונות שלהם.

Protocol

1. חיסונים של חלבונים ספציפיים

הכנת תרבית תאים והגדרה ניסיונית
1. שמור על תאי U2OS בשכבות מונו-שכבתיות במדיום תרבית DMEM בתוספת סרום עגל עוברי 10%, גלוטמין 2 mM, ו 1% פתרון אנטי-אנטי-ממיקוטי.
  הערה: עבור אינדוקציה נזק DNA מבוסס אנדונוקלאז, להשתמש פחם מטופל או בינוני ללא סטרואידים כדי למנוע דליפה במערכת.
2. לגדל תאים בסביבת 5% CO₂ לח ב 37 °C (77 °F) עד 80% מפגש, חידוש בינוני כל 2-3 ימים.
3. לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם 1x PBS. נתק תאים באמצעות פתרון טריפסין-EDTA. כאשר התאים מתנתקים, הפסק את פעילות טריפסין על-ידי הוספת מדיום תרבית לתאים, הניבה השעיית תאים.
4. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים. צלחת 2 x 10⁴ תאים / מ"ל / גם על צלחת 24 טוב, עם כיסויים עגולים סטריליים 12 מ"מ בכל באר.
5. דגירה תאים עבור 24 שעות ב 37 °C (5 °F) באטמוספירה לחה 5% CO₂ כדי לאפשר התקשרות על כיסויים.
6. לטפל בתאים עם 10 ננוגרם / מ"ל של neocarzinostatin (NCS) על ידי ישירות pipetting הסוכן מזיק למדיום תרבית. לדגור על התאים עם המדיום המכיל NCS במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם 1x PBS ולהוסיף טרי, תוספת מדיום לתאים. אחרת, השתמש בסוכן מתאים (כלומר, 4-OHT) כדי לגרום ל- DSBs באמצעות מערכות מבוססות אנדונוקלאז מבלי לרענן את ה-²²הבינוני .
  הערה: לחלופין, השתמש בהקרנה כדי לגרום נזק לדנ"א, החל מ 30 דקות עד 8 שעות של זמן ההחלמה באמצעות שטף נויטרונים בין 2-20 Gy²³.
7. תאי דגירה עבור 1-8 שעות ב 37 °C באטמוספירה לחות 5% CO₂ כדי לעקוב אחר הקינטיקה של תיקון DNA.
קיבוע תאים
הערה: 300-500 μL של פתרונות / באר יש להשתמש בשלבים הבאים (שלבים 1.2-1.5) כדי לכסות את כל התאים כראוי. כל שלב דגירה ושטיפה (למעט דגירה נוגדן) צריך להתבצע על שייקר מסלולית עם עצבנות עדינה.
1. לאחר אינדוקציה DSB ודגורה של תאים, להסיר את המדיום מן התאים המצורפים לשטוף את התאים פעם אחת עם 1x PBS.
2. לתקן תאים עם 4% פורמלדהיד-PBS פתרון במשך 20 דקות ב 25 °C (70 °F).
פרמזביליזציה של תאים
1. הסר את פתרון התיקון לשטוף תאים שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
2. הסר את ה-PBS והוסף 0.2% טריטון X-100 מומס ב-PBS. לדגור על הדגימות במשך 20 דקות.
חסימה של אתרי איגוד לא ספציפיים
1. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS 1x.
2. חסום אתרי כריכה לא ספציפיים עם 5% BSA (אלבומין שבר V של סרום בקר) מדולל ב- PBST (1x PBS בתוספת 0.1% Tween-20), ודגר את הדגימות החלחלות למשך 20 דקות לפחות.
כתמי אימונופלואורסצנטיות
1. הוסף את הכמות הנכונה של נוגדן ראשוני (כלומר, אנטי γH2AX, אנטי-DNA-PKcs) מדולל בפתרון 1% BSA-PBST. מניחים כל כיסוי הפוך על סרט פרפין מעל טיפה של 10 μL של נוגדן נגד γH2AX מדולל.
  הערה: במקרה של חיסון משותף לדלל כראוי את שני הנוגדנים באותו פתרון 1% BSA-PBST.
2. לדגור על הדגימות בתא לחות במשך 1.5 שעות ב 4 °C (70 °F).
  הערה: דגירה יכולה להתבצע גם בשעה 4 °C (70 °F) במהלך הלילה.
3. מניחים את כיסויי הגב להיות בצד למעלה לתוך צלחת 24-well לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1x PBS.
4. הוסף את הכמות הנכונה של נוגדן משני מדולל ב- 1% BSA-PBST. מניחים כל כיסוי הפוך על סרט פרפין מעל טיפה של 10 μL של הנוגדן מדולל.
5. לדגור על הדגימות בתא לחות ב 4 °C (5 °F) במשך 1 שעות.
6. מניחים את כיסויי הגב להיות בצד למעלה לתוך צלחת 24-well לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 1x PBS.
7. לפני הסרת פתרון הכביסה האחרון PBS, בעדינות להוציא את כיסויים באמצעות פינצטה ומחט ולאחר מכן למקם אותם הפוך על שקופיות זכוכית עם טיפות של בינוני הרכבה (בתוספת DAPI).
  הערה: הימנע היווצרות של בועות אוויר. כאשר המדיום הרכבה מתייבש, מומלץ לאטום את הקצוות של כיסויים עם לק כדי למנוע צטמקות של הדגימות.

2. אימונופרציפיטציה של כרומטין

איסוף תאים, קישור צולב, תמה לתאים ולגרעין ופיצול דנ"א
1. תרבית כ 5 x 10⁶ תאים / מ"ל בצלחת 150 מ"מ עבור כל מדגם.
2. הסר את המדיום התרבותי לשטוף את התאים פעמיים עם קרח קר 1x PBS.
3. תקן את התאים עם תמיסת פורמלדהיד-PBS של 1%, הנח את הלוחות על שייקר מסלולית והתסיס בעדינות במשך 20 דקות.
  הערה: פורמלדהיד הוא הפכפך; תמיד להכין פתרון עבודה טרי. במקרים מסוימים, הפתרון פורמלדהיד מכיל מתנול כדי לייצב אותו, אבל עדיף להשתמש בפתרון ללא מתנול כדי למנוע הפרעה עם תגובות במורד הזרם.
4. עצרו את הקיבעון עם גליצין של 125 מ"מ ודגרו על שייקר מסלולית עם עצבנות עדינה למשך 5 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
5. מניחים את הצלחות על קרח ושטפו פעמיים עם PBS קר כקרח.
6. לגרד את התאים בקרח קר 1x PBS ולהעביר אותם לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל.
7. צנטריפוגות התאים ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
8. שאפו בזהירות את supernatant ו resuspend הכדור ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה התא [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC (קוקטייל מעכב פרוטאז)] ודגרה על קרח במשך 10 דקות.
9. צנטריפוגה השעיית התא ב 2,500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
10. בזהירות להשליך את supernatant ו resuspend הכדור ב 500-1,500 μL של חוצץ תמוגה גרעינית (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.8% SDS, 1x PIC) ודגרה על קרח במשך 30-60 דקות. מעבירים את הלסאט לצינור חרוט פוליסטירן המתאים לסוניקציה.
  הערה: מכיוון שמאגר תמן גרעיני מכיל SDS, הוא יזרום על קרח, והפתרון יהפוך ללבן. הפתרון צריך להפוך שקוף בעקבות sonication.
11. Sonicate ליסאט כדי לגנות DNA לגודל שבר ממוצע של 300-1,000 bp.
  הערה: יש להגדיר את מחזורי sonication המתאים ואת התנאים על פי סוג התא ואת ציוד sonication. שברים הקטנים מ-200 bp אינם מתאימים ל-ChIP, מכיוון שניתן לשבש את האינטראקציות בין הנוקלאוזום לדנ"א.
היפוך של קישור צולב, קביעה של גדלי שבר sonicated
1. להוציא 100 μL של המדגם sonicated כדי לאמת את גודל שבר של כרומטין sonicated. הכרומטין הנותר צריך להיות מאוחסן ב -80 °C (80 °F).
2. הוסף 0.5 מ"ג / מ"ל RNase A לכל 100 μL של המדגם ולדגירה אותם ב 37 °C (7 °F) במשך 20 דקות כדי להפעיל את RNase.
3. לדגור את הדגימות ב 65 °C (65 °F) לילה.
4. למחרת, להוסיף 500 מיקרוגרם / מ"ל של Proteinase K ו 0.5% SDS, ולדגירה את הדגימות ב 50 °C (50 °F) במשך 3 שעות.
5. הוסף 0.5 נפח של פנול 0.5 נפח כלורופורם-איזואמיל תערובת אלכוהול (24:1) לכל מדגם.
6. מערבולת למשך דקה אחת.
7. צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.
8. העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.
9. הוסף תערובת אלכוהול כלורופורם-איזואמיל בנפח אחד (24:1) לכל דגימה.
10. מערבולת למשך דקה אחת.
11. צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.
12. העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.
13. הוסף 2.5 כרכים של 96% אתנול ונפח 0.1 של 3 M Na-Acetate pH 5.2.
14. דגירה במשך 20 דקות לפחות ב-80 מעלות צלזיוס.
15. צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
16. הסר את האתנול לשטוף את הכדור עם 400 μL של 70% אתנול.
17. צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
18. הסר את האתנול ואוויר יבש את הכדור.
19. resuspend הכדור ב 10 μL של TE.
20. תריץ את הדגימות על ג'ל אגרוז 0.8%. גודל הכרומטין sonicated צריך להיות סביב 500 bp.
  הערה: השתמש במאגר טעינה ללא כחול ברומופנול מכיוון שגודל צבע זה הוא כ- 500 bp, מה שעלול להפריע לגילוי הנכון של שברי כרומטין. במקום זאת, מומלץ להשתמש במאגר טעינה בתוספת קסילן-ציאנול, שהוא כ 3,000 bp.
21. אם גודל הכרומטין מקובל, לדלל את דגימות הכרומטין הקפואות בשלב 2.1. ב 3 כרכים של מאגר דילול (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 מ"מ EGTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) ולערבב את הדגימות באמצעות סיבוב במשך 10 דקות ב 4 °C (5 °F).
  הערה: שלב זה נחוץ כדי לדלל את SDS הנוכחי במאגר תמיסת גרעין כדי למנוע הפרעה עם תגובות במורד הזרם, כולל מדידת ריכוז הכרומטין.
22. למדוד את ריכוז ה- DNA של דגימות הכרומטין ב 260/280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
הכנת חרוזים, לפני פינוי, ו immunoprecipitation
1. הכן חרוזים (כבשים נגד ארנב או עכבר IgG) עבור שלבי ניקוי מראש immunoprecipitation. לשטוף חרוזים פעמיים במשך 10 דקות ב 4 °C עם חיץ RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl ו- 1X PIC).
2. תגדיל מחדש את החרוזים באותו אמצעי אחסון של מאגר RIPA כמו בשלב 2.3.1.
3. ברור מראש 25-30 מיקרוגרם כרומטין של כל מדגם עם 4 μL של החרוזים באמצעות סיבוב עבור 1-2 שעות ב 4 °C (70 °F).
  הערה: הוסף מאגר RIPA לכל דגימת כרומטין עד 500 μL של אמצעי אחסון סופי כדי לאפשר את הדגימות לערבב כראוי תחת סיבוב. אל תשכח להוציא כרומטין עבור NAC (ללא בקרת נוגדנים) ו- TIC (בקרת קלט כוללת) במקרה של כל ערכת דגימה. TICs דורשים נפח סופי של עד 200 μL בלבד.
4. לזרז את החרוזים עם מגנט ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.
5. הוסף את הכמות המתאימה של נוגדן לכל דגימת כרומטין (למעט NAC ו- TIC) וסובב לילה ב 4 °C (70 °F).
6. למחרת, להוסיף 40 μL של חרוזים שטופים לכל מדגם (למעט TIC) ולדגירה אותם לילה, מסתובב ב 4 °C (70 °F).
כביסה
1. לשטוף פעם אחת עם 300 μL של חוצץ מלח נמוך (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) במשך 10 דקות באמצעות סיבוב ב 4 °C (70 °F).
2. לשטוף פעם אחת עם 300 μL של חוצץ מלח גבוה (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA pH 8.0, 1% טריטון X-100, 0.1% SDS, 1x PIC) במשך 10 דקות באמצעות סיבוב ב 4 °C (C).
3. לשטוף פעם אחת עם 300 μL של חיץ LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) למשך 10 דקות באמצעות סיבוב ב 4 °C (55 °F).
4. לשטוף פעמיים עם 300 μL של TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) במשך 10 דקות באמצעות סיבוב, עבור לשטוף הראשון ב 4 °C (5 °F), ואת לשטוף השני ב 25 °C (70 °F).
אלוטיון
1. הוסף 200 μL של מאגר elution (1% SDS ו 100 mM NaHCO₃) לחרוזים ודגרה ב 65 °C (65 °C) בתרמו-שייקר במשך 15 דקות עם רועד מתמשך (כ. 400 סל"ד). העבר את supernatant לצינור חדש חרוזים elute שוב 200 μL של חוצץ Elution. שלב eluates (נפח סופי 400 μL).
2. הוסף NaCl לריכוז סופי של 200 mM בכל מדגם. להשלים את דגימות TIC עם 200 μL של חוצץ Elution ולהוסיף NaCl גם כן.
  הערה: בשלב זה, יש לטפל ב- TIC באותם תנאים כמו הדגימות האחרות.
3. לדגור על הדגימות ב 65 °C (ללא רועד) לפחות 6 שעות.
4. הוסף 1 מ"ל של אתנול קר 100% לכל דגימה, לסובב את הצינורות פעמיים לערבב, ולזרז DNA לילה ב -80 מעלות צלזיוס.
5. למחרת, צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 13,000 x g ב 4 °C (70 °F).
6. להשליך את supernatant ולשטוף את הכדור עם 70% EtOH.
7. צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
8. השליכו את הסופר-טבעי וייבשו את הכדורים.
9. resuspend הכדורים ב 100 μL של TE ולהוסיף 0.5 מ"ג / מ"ל של RNase A לכל מדגם. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 20 דקות כדי להפעיל את RNase.
היפוך של קישור צולב
1. הוסף 500 מיקרוגרם /mL של Proteinase K ו 0.5% SDS ולאחר מכן לדגור על הדגימות ב 50 °C (50 °F) במשך 2 שעות.
  הערה: אם ממשיכים ChIP-seq, להימנע מיצוי פנול-כלורופורם, כפי שהוא מעכב את תהליך NGS במורד הזרם. במקום זאת, מומלץ להשתמש בערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
2. הוסף 0.5 נפח של פנול ו 0.5 נפח של תערובת אלכוהול כלורופורם-איזומיל (24:1) לכל מדגם.
3. מערבולת למשך דקה אחת.
4. צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.
5. העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.
6. הוסף נפח אחד של תערובת אלכוהול כלורופורם-איזומיל (24:1) לכל דגימה.
7. מערבולת למשך דקה אחת.
8. צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות.
9. העבר את השלב מימי העליון לצינור microcentrifuge חדש.
הפקת דנ"א
1. הוסף 2.5 כרכים של 96% אתנול ונפח 0.1 של 3 M Na-Acetate pH 5.2.
2. דגירה במשך 20 דקות לפחות ב-80 מעלות צלזיוס.
3. צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
4. הסר את האתנול לשטוף את הכדור עם 400 μL של 70% אתנול.
5. צנטריפוגה הדגימות ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).
6. הסר את האתנול ואוויר יבש את הכדור.
7. resuspend הכדור ב 50 μL של TE.

תוצאות

ניתן להשיג לימוד תהליכי תיקון המושרים על-ידי DSB בתאים באמצעות זיהום יציב או ארעי. עם זאת, יש לציין כי transfection יציב מבטיח אוכלוסיית תאים הומוגניים, אשר נותן תגובה תאית מאוחדת ולכן אמין יותר. במקרה של ארעיות, רק חלק קטן מאוכלוסיית התאים תופס ומתחזק את הפלסמיד, אשר מכניס גיוון לניסוי. הקמת מערכות תאים מבוססות אנדונוקלאז ER-I-PpoI או ER-AsiSI דורשת 50% מאוכלוסיית תאים משתלבים, אשר מועברת בצורה יעילה יותר עם פלסמידים המקודדים את האנדונקולאז. עבור transfection, ריאגנטים transfection זמין מסחרית או שיטות מבוססות זיהום ויראלי יכול לשמש גם. אם יש ליישם טכניקת הדמיה מיקרוסקופית ונדרשת הארכה ארעית, ניתן לגרום ל- DSBs המכוון על ידי תוספת 4-OHT 24 שעות לאחר ההדבקה, הנקשרת לאנדונוקלאזים המותכים ב- ER ומאפשרת את ההקצאה הגרעינית ואת האינדוקציה DSB. כדי לקבוע את נקודות הזמן המתאימות ביותר, מיקרוסקופיה מבוססת אימונופלואורסצנטיות וזיהוי כתם מערבי של γH2AX בנקודות זמן שונות לאחר טיפול 4-OHT ניתן לבצע. בתנאים פיזיולוגיים, ניתן לזהות מקסימום של 10-15 מוקדי γH2AX לתא, ויצירת מוקדי תיקון חזקים יכולה להיות מופעלת על ידי אנדונוקלאזים (או טכניקות שונות אחרות שלא נדונו כאן למשל, מיקרו-קרדיציה בלייזר). אנדונוקלאז I-PpoI טיפוסי מוביל להיווצרות של אותות γH2AX מוגבהים סביב הגרעין על ידי גרימת DSBs ב- DNA ריבוזומלי (rDNA). אם ההפסקות מתוקנות על-ידי NHEJ או HR, מספר מוקדי התיקון פוחת עם הזמן. מסיבה זו, נקודות זמן מייצגות ב 0 שעות, 30 דקות, 1, 2, 4, ו 8 שעות לאחר טיפולים 4-OHT מומלץ. כדי לעקוב אחר תהליכי תיקון DNA, קו התא הנפוץ ביותר הוא U2OS, כמו כל מסלולי התיקון הידועים מתפקדים באופן מלא בתאים אלה. כאשר חוקרים מספר חלבונים באותם תאים, ניתן לחקור לוקליזציה משותפת על ידי שילוב נוגדנים הצמודים עם פלואורופורים שונים עם אורכי גל פליטה שונים שגדלו במינים שונים של בעלי חיים כפי שמוצג באיור 1. שם, אינדוקציה של DSBs באמצעות קו תא יציב לא ניתן לתכנות מיוצג אשר מבוסס על אנדונוקלאז הגבלת ER-AsiSI התמזגה עם תג hemagglutinin (HA). Doxycycline יכול לגרום לביטוי ולהפרדה של HA-ER-AsiSI בציטופלסמה שניתן לעקוב אחר באמצעות נוגדן נגד HA (איור 1.עמודה שלישית, גלם שני). דגירה למשך 4 שעות עם 4-OHT, 24 שעות לאחר הוספת דוקסיציקלין, יכולה לגרום למספר גבוה של DSBs מאז שהאנדונוקלאז הועבר לגרעין (איור 1.עמודה שלישית, עמודה גולמית שלישית ועמודה שנייה, שלישית גולמית וגולמית שלישית). ניתן לדמיין DSBs באמצעות נוגדן המזהה את γH2AX.

figure-results-2386
איור 1: מיקרוסקופיה חיסונית משמשת לזיהוי γH2AX בתאים בתרבית המבטאים את HA-ER-AsiSI. תוספת DOX (דוקסיציקלין) מפעילה את הביטוי הציטופלסמי של HA-ER-AsiSI ו- 4-OHT (4-hydroxytamoxifen) (4 שעות) גורם לטרנסלוקציה הגרעינית של חלבון ההיתוך, מה שמוביל לגיוס של DSBs בתנוחות גנומיות ידועות. הכתמת HA (hemagglutinin) (נוגדן אנטי-HA) מייצגת את חלבון ההיתוך HA-ER-AsiSI בירוק, ואת אינדוקציה של הפסקות מאומת על ידי כתמי γH2AX (נוגדן אנטי γH2AX) באדום. סרגלי קנה מידה מייצגים 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לוקליזציה משותפת של חלבוני תיקון באתר הנזק מצביעה על כך שהם מגויסים לאותו אתר נגע DNA, אבל הם לא בהכרח אינטראקציה אחד עם השני. הרזולוציה של מיקרוסקופיה קונפוקלית היא כ 300 ננומטר; כדי לקבוע את דפוס הכריכה של חלבוני תיקון ספציפיים באתר ההפסקה, מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר (STORM) מומלצת במקום ^{זאת 24}. עם זאת, שיטה זו דורשת ציוד מיקרוסקופי יקר וחוקר מומחה. לחלופין, דפוס הכריכה של חלבוני התיקון ניתן לבחון על ידי אימונופרציפיטציה של כרומטין באמצעות קווי תאים יציבים DIvA או U2OS-pEP15, אשר יכולים לבטא אנדונקולאזים AsiSI ו- I-PpoI בצורה מוסדרת, בהתאמה¹⁷^,²¹. עם תוספת 4-OHT, שני אנדונוקלאזים יכולים לחתוך את ה- DNA באופן ספציפי רצף אשר מספק לנו את ההזדמנות לעצב פריימרים ספציפיים לוקוס לאתרי הפסקה צפויים ואזורים גנומיים שמסביבם. על ידי החלת נוגדן γH2AX בחלק האימונופרציפיטציה של ChIP, אנו יכולים לעקוב באופן זמני אחר הקינטיקה של תיקון ה- DNA בתנאים שונים (כגון השתקה או עיכוב של גורמי תיקון מסוימים של עניין, כלומר, DNA-PKcs). תוצאה ניסיונית טיפוסית המתקבלת באמצעות ChIP-qPCR מיוצגת באיור 2. שם, העשרה זמנית של γH2AX מוצגת כתגובה לנזק DNA הנגרמת על ידי I-PpoI. בחלק הימני של התמונה, האות γH2AX שזוהה בזמן מוצג באתר ההפסקה בעוד שבחלק ימין, התפלגות γH2AX מיוצגת באזור גן בקרה שבו DSBs לא הושרו.

figure-results-4529
איור 2: העשרה זמנית של γH2AX כפי שנקבע על ידי אימונופרציפיטציה של הכרומטין בתגובה לנזק DNA הנגרמת על-ידי I-PpoI. משמאל, אות γH2AX באתר ההפסקה; נכון, γH2AX הפצה באזור בקרה שבו DSBs לא הושרו (נוגדן נגד γH2AX). התוצאות המיוצגות נגזרות מניסוי ביולוגי אחד, ופסי שגיאה מציינים את הווריאציות של המשכפלים המתאימים לדגימה. N = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

למרות שתיקון DNA הוא תחום מחקר חדש יחסית, הידע שלנו מתרחב במהירות בעזרת שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות שונות. שימור מידע גנטי חיוני לתאים שכן מוטציות המתרחשות בגנים המעורבים בתהליכי תיקון הן בין הגורמים המובילים לגידול ולכן מבעירה את השלבים העיקריים של מסלולי תיקון DNA היא חיונית.

טכניקות ביוכימיות (כלומר, כתם מערבי, אימונופרציפיטציה, ספקטרומטריית מסה וכו ') דורשות מספר רב של תאים ותהליכי התיקון הנחקרים מייצגים תמונת מצב של אוכלוסיית התאים הרצויה. ביצוע ניסויי ChIP הוא עבודה, בעייתי ושיקולים רבים יש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסוי ספציפי כדי ללמוד את התהליך של תיקון DSB. השלבים הבאים הם כמה דוגמאות: (I) תאים צריכים להיות lysed כראוי; מומלץ מאוד ליישם שיטת ליסציה דו-שלבית באמצעות מאגר תמה נפרד של תאים וגרעין כדי להבטיח נגישות גבוהה יותר לכרומטין שבר הכרומטין (II) לא צריך להיות over- או undersonicated; התנאים המתאימים של sonication צריך להיות ממוטב לכל סוג תא מראש (III) את הכמות המתאימה של נוגדן מטוהר צריך להיקבע מאז נוגדנים נגד אותו חלבון מחברות שונות להפגין מאפיינים לא זהים (IV) עבור immunoprecipitation יעיל, 25-30 UG כרומטין ראשוני יש להשתמש בכל תנאי (V) הזמן המתאים של קיבוע צריך להיות ממוטב, כמו overfixation יכול לגרום לתוצאות חיוביות שווא על ידי הצלבת מתחמי חלבון רחוקים underfixation יכול למנוע את הצלבה נכונה בין DNA לבין החלבון הרצוי (VI) מבוסס על הנוגדן המיושם, סוג החרוזים (חלבון A או G) צריך להיקבע בקפידה (VII) במהלך שלבי כביסה, הסדר של מאגרי הכביסה צריך להישמר ביסודיות כדי למנוע את שחרור הנוגדן מן החרוזים (VIII) במהלך מיצוי DNA, עקבות פנול צריך להיות מסולק כראוי כדי למנוע הפחתת היעילות של תגובות במורד הזרם. מכיוון ששיטה זו מפחיתה את התשואה של DNA התאושש, העצה האישית שלנו היא במקום להשתמש בערכת טיהור DNA ספציפית. כאשר כל הנקודות הקריטיות טופלו כראוי, ChIP יכולה לספק נתונים יקרי ערך לתפוסת החלבון הרצוי ב loci גנומי שונים והוא יכול לפענח צעדים קריטיים בתהליכי תיקון DNA.

עם זאת, ChIP בשילוב עם qPCR היא גישה עקיפה לחקור את התפלגות החלבון באזורים גנומיים נבחרים ואינה מאפשרת לזהות באופן ספציפי את אתר כריכת ה- DNA או לבחון ישירות את תפקוד החלבון. נוגדנים חד-שבטיים או פוליקלונליים המשמשים ללכידת מתחמי החלבון-DNA יכולים גם להצליב עם חלבונים אחרים המובילים לנתונים חיוביים כוזבים ולכן, הנוגדנים המשמשים בטכניקה זו צריכים להיות באיכות ChIP וספציפית מאוד נגד חלבון העניין. עם זאת, ChIP היא טכניקה בשימוש נרחב וגישות נוספות המבוססות על זה פותחו, כגון ChIP-on-chip ו ChIP-seq. הראשון מסתמך על הכלאה של שברי הדנ"א האימונופרציפטיים והמטוהרים על מיקרו-array עם מגוון גדול של רצפי דנ"א אקראיים קטנים אשר מגבירים עוד יותר את רצפי החישול ומספקים מידע רב ערך על אתרי כריכת חלבונים. עם זאת, ChIP-seq התפתחה כגישה חלופית אטרקטיבית שכן היא מספקת מיפוי כלל גנומי של מתחמי חלבון-DNA ברזולוציה גבוהה יותר מאשר ChIP-על-שבב ורצף גנום בעל תפוקה גבוהה. ChIP-seq חוללה מהפכה בתחום תיקון הדנ"א על ידי חשיפת אתרי כריכת DNA של גורמי שעתוק שונים המספקים תובנות על ויסות הגנים ופענוח נופי הכרומטין בקנה מידה גנומי²⁵. על פי זה, התחום של תיקון DNA הרוויח מאוד ChIP-seq מאז נתונים אלה לשחק תפקיד מכריע במחלות שונות מסלולים ביולוגיים, כגון התקדמות הסרטן. עם זאת, שינויים שונים של שיטת ChIP פותחו כגון HaloChIP, אשר אינו דורש נוגדן ספציפי נגד חלבון עניין אלא משתמש רצפים קידוד חלבונים מחייב DNA התמזגו עם HaloTag, אשר מועברים לתאים ולאחר מכן crosslinking, מתחמי חלבון-DNA הרצוי ניתן ללכוד באמצעות שרף HaloLink. עם זאת, טכניקה זו מסתמכת על ביטוי יתר ולא על הרמה האנדוגנית של החלבונים הרצויים אשר יכול לגרום נתונים לפרש לא נכון²⁶.

יתר על כן, טכניקות מיקרוסקופיות מספקות מידע רב ערך על המעקב ה spatiotemporal של תיקון נזק DNA, אפילו ברמה של תא אחד. השיפור המהיר של נוגדנים שהועלו נגד חלבוני תיקון ספציפיים הוביל להבנה עמוקה יותר של המנגנון של מסלולי המשנה של NER ו- DSBR, כמו גם הרגולציה הפוסט-תרגומית שלהם. השדה המיקרוסקופי עבר מהפכה על ידי טכניקות ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה ברזולוציית-על, המאפשרת הדמיה של תהליכים תאיים הנגרמים מנזקי DNA ברמה הנוקלאוזמית, כמו גם להבטיח מיפוי מדויק של לוקליזציה משותפת של חלבון²⁴. עם זאת, יש לציין כי השונות בשושלת התאים חייבת להיחשב במהלך הניסוי כמו קצב התיקון יכול לסטות, אשר יכול להפוך את התוצאות קשות לפרש. בהתחשב בהתפתחות המהירה של מתודולוגיית הדמיית הפלואורסצנטיות והתכנון המכוון של ההתקנה הניסיונית, הזדמנות יקרה לחקור את התגובות התאיות והמולקולריות הנגרמות מנזקי DNA ברזולוציית חלבון אחת ברמת תא אחד נמצאת בדרכה לשלמות.

לסיכום, השילוב של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על ומתודולוגיית רצף של תא אחד יכול לשפר באופן משמעותי את הבנתנו בתחום תיקון הדנ"א.

Disclosures

ללא

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי המעניק ל- GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, מלגת המחקר של יאנוס בוליאי של האקדמיה ההונגרית למדעים BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, מלגת EMBO לטווח קצר 8513, וקרן טמפוס.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody	Abcam	ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine	Lonza	12-707F
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Ethanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved	Gibco	ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glycine	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Isoamyl alcohol	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Phenol	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
Polysorbate 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH₃COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	15400054

References

Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460(2012).
Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174 DSBs

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: