JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

Abstract

השידור הישיר מדי פעם של שפעת העופות פתוגניים מאוד וירוס H5N1 (HPAI H5N1) ו H7N9 לבני אדם הקשה שלהם הם בעיות חמורות בריאות הציבור ולהציע את האפשרות של מגיפה. עם זאת, ההבנה המולקולרית שלנו של הנגיף היא בסיסית, ויש צורך ללמוד את המאפיינים הביולוגיים של חלבונים המעטפה שלה כמטרות טיפוליות ולפתח אסטרטגיות כדי לשלוט בזיהום. פיתחנו חלקיק ויראלי מוצק שהוקלדו חלקיקים (pp) פלטפורמת ללמוד וירוס שפעת העופות, כולל ניתוח פונקציונלי של hemagglutinin (HA) ו-נוירואמינידאז (NA) מעטפות מאפיינים, המאפיינים של ובתאום מראש של ונאס, קולטנים, הטרופיאמים, נטרול נוגדנים, אבחון, הנגועים, למטרות פיתוח התרופה ועיצוב החיסון. כאן, אנו מתארים הליך ניסיוני כדי ליצור pps עם מעטפה גליקורופטנס (HA, NA) משתי שפעת זנים (HAPI H5N1 ו 2013 H7N9 העופות). הדור שלהם מבוסס על היכולת של וירוסים מסוימים, כגון וירוס לוקמיה murine (MLV), לשלב גליקורופנים מעטפה לתוך pp. בנוסף, אנו גם פירוט כיצד pps אלה הם כימות עם RT-qPCR, ואת זיהוי הנגועים של pps וירוס לא תואם בהתאם למקור של יש ו-NAs. מערכת זו היא גמישה מאוד וישימה וניתן להשתמש בה כדי ליצור pps ויראלי עם גליקורופנים מעטפות שניתן לשלב בכל סוג אחר של וירוס עטוף. כך, פלטפורמת חלקיקים ויראלית זו ניתן להשתמש כדי ללמוד וירוסים פראי בחקירות מחקר רבות.

Introduction

המשימה של חלקיק נגיפי היא להעביר את הגנום שלה מתא מארח נגוע לתא מארח לא נגוע, כדי להעביר אותו לתוך הציטופלסמה או הגרעין בצורה המוסמכת לשכפול1. תהליך זה מופעל בתחילה על ידי קשירה של קולטני תאים מארחים, ולאחריו פיוז'ן של וריריון וקרומים סלולריים. עבור וירוסים עטופים, כמו וירוסי שפעת, גליקורופורינים ספייק הם אחראים על כריכת קולטן ופיוז'ן1,2. מעטפה נגיפית גליקורופנס (למשל, פירוגנס, אנטיגנים), מעורבים בתכונות ואירועים חשובים רבים, כגון מחזור חיים של וירוס (איגוד והיתוך), פתוגנזה ויראלי, חיסוני, מארח תאים אפופטוזיס ו הסלולר tropism, מסלול endocytic הסלולר, כמו גם הילוכים הבינמינים והקצאה1,3,4,5,6,7. מחקר על מעטפה נגיפית גליקורופנס יסייע לנו להבין היבטים רבים של תהליך הזיהום הנגיפי. חלקיקים ויראליות מסוג פסבדו (pp), הנקראת גם פסבדו-מאמרים או פסבדו-מוצרים, ניתן ליצור דרך טכניקת הקלדה מדומה8,9,10. טכנולוגיה זו שימש לפיתוח חלקיקים מוקלדים של וירוסים רבים, כולל צהבת C11,12, צהבת B13, vesicular stomatitis וירוס (vsv)14,15, וירוס שפעת16,17,18,19. טכנולוגיה זו מבוססת על חלבון מחסום-פול של וירוסים או הרטרוירוסים אחרים.

חלקיקי חלקיקים מוקלדים ניתן להשיג באמצעות מערכת שלוש-פלמיד על ידי הפרדת מעטפה נגיפית גליקופרוטאין ביטוי פלבאריבאמצע, אריזה retroviral יעיל החסר המעטפה עטפה גן, ו כתבת נפרדת בתוך pp מפיק תאים. הרטרו וירוס מורכב על ידי חלבון מחסום שלו, והוא ניצנים מקרום התא נגוע המבטא את מעטפת וירוס חלבון1. לכן, אפשר להשיג שפעת סיכוייו גבוה pps באמצעות וירוס מחסום חלבון לייצר ניצנים על קרום הסלולר המבטא שפעת HA ו-NA. במחקרים הקודמים שלנו, יש/NAs בכל השילובים היו פונקציונליים מסוגל לבצע את הפונקציות המתאימות שלהם במחזור החיים הנגיפי16,17,18,20,21. Pps אלה משמשים כדי לחקור מאפיינים ביולוגיים שפעת, כולל hemagglutination פעילות עצבית, מחייב הקולטן הפאיזם, והנגועים. בגלל HA ו-NA הם שניהם משטח חשוב חלבונים פונקציונליים במחזור החיים הנגיפי, לא תואם יש NAs נגזר זנים שונים של שפעת יכול בחלקו להפגין הקצאה מחדש ביניהם. כאן, אנו מייצרים שמונה סוגים של pps שפעת על ידי שילוב 2 יש ושתי NAs (נגזר המתח HPAI H5N1 ואת הכתם H7N9), באמצעות מערכת שלושה פלמיד הקלדה מדומה. אלה שמונה סוגים של pps כוללים שני pps מקורית, H5N1pp, H7N9pp; שני pps לא תואמים, (H5 + N9) pp, (H7 + N1) עמ'; ו 4 pps רק מחסה גליקופרוטאין יחיד (HA או NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. מחקרים על וירוס שפעת, כגון H5N1 ו H7N9, מוגבלים על ידי דרישות אבטחה טיחות. כל המחקרים של זנים וירוס שפעת הבר צריך להתבצע ברמה אבטחה טיחות 3 (bsl-3) המעבדה. ניתן להשתמש בטכנולוגיית חלקיקים מסוג ויראלי לאריזת וירוס מלאכותי בקביעת רמת בטיחות 2 (BSL-2). לכן, pps מייצגים כלי בטוח ושימושי כדי ללמוד את תהליכי וירוס שפעת בהתאם לשני הגליקורופנים העיקריים שלה: hemagגלוטין (HA) ו נוירואמינידדאז (NA).

פרוטוקול זה מתאר את הדור של ה-pps האלה עם אסטרטגיית שלוש-פלאמטר (מוצג מראש באיור 1), כיצד לכמת pps וזיהוי הנגועים. הייצור pp כולל שלושה סוגים של פלמידים (איור 1). הגן מחסום-פול , אשר מקודד את החלבון מחסום וירוס-פול, שוכפל מערכת אריזה רטרווירוס והוכנס לתוך pcdna 3.1 פלאמיד ונקרא pcdna-מחסום-פול. חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP) גן, אשר מקודד חלבון פלורסנט ירוק, שוכפל מ pTRE-EGFP וקטור, הוכנס לתוך pcDNA 3.1 פלאמיד, וקרא pcDNA-GFP. במהלך השכפול, התווסף אות אריזה (ענבל) באמצעות צבע. הגנים HA ו-NA שוכללו לתוך פלאמבאמצע pVRC, בשם pVRC-HA ו pVRC-NA, בהתאמה. הפלסטיות האחרון מקודד את חלבון ההיתוך והוא יכול להיות מוחלף עם חלבון פיוז'ן אחר של ריבית. פלטפורמת ההקלדה המדומה שלנו כוללת שני ביטויים גליקופרוטאין: pVRC-HA ו-pVRC-NA. זה יכול לפשט את המחקר על הסדר מחדש בין זנים וירוסים שונים בהגדרה BSL-2.

Protocol

1. יום 1: תרבית תאים וזריעת

  1. לטפח כליה עובריים האדם (HEK) 293T/17 תאים ב 60 מ"מ מנות עם בינוני חיוני של דולבקה שונה (DMEM) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS) ו 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין (DMEM בינוני מלא, DMEM) ב 37 ° c, 5% פחמן דו חמצני (CO2) 80 חממה
    הערה: מומלץ להתאים 293T/17 תאים מעבר נמוך.
  2. בזהירות לשטוף את התאים עם 5 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) 1x.
    הערה: טיפול ידני של התאים HEK 293T/17 חייב להיות עדין מאוד, כי הם בקלות להתנתק.
  3. הסר את ה-PBS והנתק את התאים עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין-אתילן diamine חומצה (EDTA) תמיסה. מניחים את המנה ב 37 ° c, 5% בחממה2 עבור לא יותר 5 דקות עד התאים הם הנתק.
  4. הנטרל טריפסין על ידי הוספת 5 מ ל של DCM. לפזר את התאים לתוך השעיה תא יחיד על ידי מלטף למעלה ולמטה מספר פעמים.
  5. העבר את השעיות התא לשפופרת צנטריפוגה מקוררת של 15 מ ל. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  6. . מאוד שאפשר השהה מחדש את הגלולה עם 6 מ ל של מדיום DCM וספור את התאים. דלל את התאים ל-1 x 106 תאים/mL עם מדיום dcm.
  7. הזרע את התאים לתוך 6 צלחת הבאר עם 1 מ ל של השעיה התא לכל טוב. לטף בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה. מודקת את הצלחת לילה (14-16 h) ב 37 ° c, 5% החממה2 .

2. יום 2: ארבע-פלגימיד מתווך על ידי ליפומטר

  1. בדוק את המבנה התאי והצפיפות. תחת מיקרוסקופ אור הפוך באופן אידיאלי, התאים צריכים להיות כ 85% שוטפת על הזיהום. החלף את המדיום עם 1 mL של מדיום DMEM free-סרום לכל היותר, ולאחר מכן החזר את הצלחת לתוך החממה.
    הערה: טיפול ידני של התאים HEK 293T/17 חייב להיות עדין מאוד, כי הם בקלות להתנתק.
  2. עבור כל טוב של תאים מתורבתים להיות מזוהמים, לדלל 8 μL של החצייה מגיב לנפח של 150 μL עם בינוני סרום מופחת (צינור 1). מערבבים בעדינות ו-מודרות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT, כ-20 ° c).
    הערה: עבור כל דגימת העברה, הכן שני צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ממוספרים 1 ו-2.
  3. בצינור 2, לדלל 2.5 μg של ה-DNA פלמיד לתוך 150 μL של מדיום סרום מופחת.
    הערה: בתוך צינור 2, לדלל את כל ה-DNA פלאמצע כפי שמוצג בטבלה 1. וירוס בקידוד vesicular stomatitis (VSV) G גליקופרוטאין (פלמיד pLP-VSV) שימש כפקד חיובי, כי VSV מסוגל להדביק מגוון רחב של תאים. חלקיקי שליטה שליליים שחסרים מעטפת שפעת גליקורופדים (Δenv pps) נוצרו באמצעות pcDNA-מחסום-המשך ו-pcDNA-GFP.
  4. לאחר הדגירה 5 דקות, לשלב את ה-DNA מדולל עם הזיהום מדולל מגיב. מערבבים בעדינות ו-דגירה עבור 15 דקות נוספות ב-RT.
  5. הוסף את הקומפלקס DNA-ליפיד כדי המתאים היטב המכיל את התאים ומדיום ללא סרום. מערבבים בעדינות על ידי נדנוד הצלחת הלוך ושוב.
  6. לאחר הדגירה של 4 – 6 h ב 37 ° צ', 5% CO2 חממה, להסיר את המדיום, ולהחליף עם 2 מ ל dmem. מודטה עבור עוד 36 – 48 h ב 37 ° c, 5% שיתוף חממה2 .
    הערה: החלפה עם DMEM ללא סרום ונטול נוגדנים. בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשתיים ובשתי NAs כדי להפיק שמונה סוגים של pps (המוצגת בטבלה 1).

3. יום 3: שזורעי תאים רגישים

  1. עבור שיטת הנגועים, זרע כל סוג של תאים רגישים ב 1 x 104 תאים לכל טוב בצלחת 96 היטב.
    הערה: השתמש בשני סוגים של תא יעד כדי לבצע את הטיפול הנגוע במאמר זה: קו תא אנושי מכתשיים-נגזר (A549 תאים) והתאים דין-דארבי כליות (MDCK). התאים MDCK נמצאים בשימוש נרחב במחקר שפעת יכול להיות שליטה טובה. שלב זה גמיש. כל שורות תא יעד אחרות יכולות לשמש בהתאם לדרישות המחקר.
  2. מודקת את הצלחת לילה (14-16 h) ב 37 ° c, 5% החממה2 .

4. יום 4: בדיקת חלקיקים מסוג ויראלי, ושיטת הקוונפיקציה והנגועים

  1. מוקלדת אוסף חלקיקים נגיפי
    1. בדוק את צבע המדיום. באופן אידיאלי, זה צריך להיות בהיר ורוד או מעט כתום. בדוק את התאים עם מיקרוסקופ הפוך ביולוגי פלורסנט תחת 440 – 460 ננומטר.
    2. ב 36 – 48 העברת הדואר, הקציר pps על ידי passaging באמצעות 0.45 יקרומטר polyvinylidene פלואוריד (pvdf) מסנן הקרום כדי לחסל את הריסות התאים.
    3. חלק את ה-pps לתוך. כמויות קטנות של נפח
    4. אחסן את ה-pps ב-80 ° c.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עם זאת, זה לא מומלץ, כי הנגועים של pps יהיה ירידה חדה לאחר הקפאה והפשרה.
  2. כימות חלקיקים ויראליים
    1. העברה 20 μl של מטוהרים pps 1.5 mL ריבונוקלאז (rnase)-שפופרת מיקרוצנטריפוגה חינם.
    2. הוסף 1 μL של 0.24 U/mL בנזיל. מודטה ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי למנוע זיהום דנ א ו-RNA.
      הערה: היעד RNA, בדרך כלל cytomegalovirus ירוס (CMV)-RNA GFP, ארוזה ב-pps והוא יכול להימנע מלהיות מושפל על ידי בנזיל nuclease.
    3. להקפיא את המדגם ב-70 ° צ' כדי לבטל את הפעלת בנזיל nuclease.
    4. הוסף 2 μL של פרוטאינאז K. מארג ב 50 ° c עבור 30 דקות כדי לעכל את חלבונים המעטפה ולשחרר את ה-CMV-GFP RNA. להשבית את הפרוטאינאז K ב 100 ° c עבור 3 דקות.
    5. לכמת את ה-pps על-ידי היפוך כמותי בזמן אמת (רביעיית)-PCR עם בדיקה אוניברסלית אחת-צעד RT-qPCR Kit, באמצעות פריימר קדימה 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', פריימר הפוכה 5 '-GGGTCTCCTQGACA-3 ', ואת הגשוש 5 '-משפחה-שכונות-טאם-3 ', בזמן אמת, בשנת PCR. לנרמל את pps עבור מספר עותק RNA לפני הנגועים.
  3. שיטת הנגועים
    1. דלל כל סוג של pps במונחים של הנתונים של רביעיית ה-PCR ל-4 x 105 עותקים/mL (עמ' נורמליזציה).
    2. הוסף את טוסיל-פנילאלנין-קטון (TPCK)-טריפסין לריכוז הסופי של 40 μg/mL לתוך pps כי הנמל H7N9 HA. דגירה ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי ליצור חלבוניות הפונקציונלי שלה HA1 ו HA2.
      הערה: אין צורך לטפל ב-pps שH5 עם TPCK-טריפסין, כי יש להם מספר ארגיצין ושאריות ליזין באתר המחשוף HA1-HA2. זה אתר מרובה בסיסי מחשוף יכול להיות ביקע על ידי פרוטסים סלולריים בכל מקום.
    3. ערבב pps מנורמלת עם מדיום DMA (ללא סרום) ביחס 1:1 (אמצעי אחסון/אמצעי אחסון).
    4. הביאו את הצלחת המכילה תאים רגישים לארון בטיחות.
    5. ושטוף את התאים פעם אחת עם 0.1 מ ל של PBS.
    6. הוסף 0.1 mL של התערובת pps-DMEM לבאר אחת. שלישיה במבחנים הנגועים של כל סוג של pps אל קו תא אחד פגיע (מוצג מראש באיור 2).
    7. מודטה את 96 צלחת הבאר עבור 4 – 6 h ב 37 ° צ', 5% שיתוף2 חממה.
    8. מנושף את הסופרנטנט ומחליפים ב-0.1 mL של DCM.
    9. מודטה את 96 צלחת הבאר עבור אחר 24 – 36 h ב 37 ° c, 5% שיתוף אינקובטור2 .

5. יום 5 או 6: איתור הנגועים

  1. הביאי את צלחת ה96. לארון הביוטיחות
  2. ולשטוף את התאים 1x עם 0.2 mL של מקדם שחומם.
  3. הסר את PBS והנתק את התאים עם 0.1 mL של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון.
  4. מניחים את המנה ב 37 ° c, 5% בחממה2 עבור 3 דקות עד התאים מנוכה.
    הערה: הימנע מהדגירה של יותר מ-5 דקות, מכיוון שפעולה זו תוביל להפייפת תאים.
  5. הנטרל טריפסין על ידי הוספת 0.4 mL של DCM.
  6. לפזר את התאים להשעיה תא יחיד על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים.
  7. העבר את השעיות התא לצינור מקורר מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  8. לקבוע את הכתב GFP-תאים חיוביים עם מיון תא מופעל פלואורסצנטית (FACS).
    הערה: כדי לקבוע את היחס של הכתב GFP-תאים היעד חיובי, להגדיר את השערים cytometer הגדר באמצעות דגימות בקרה (מטופל A549 תאים או בתאי MDCK), ולאחר מכן לספור את הכתב GFP-תאים חיוביים של 10,000 תאים לכל מדגם.

תוצאות

בהתאם לנוהל הכללי המתואר לעיל, יצרנו 10 סוגים של pps שילוב של שתי קבוצות יש/NAs או VSV-G גליקופרוטאין או ללא מעטפה גליקורופנס (המוצג בטבלה 1). . שבעה מהם מדבקים ה-pps כי הנמל לא מעטפה גליקופרוטאין או רק הנמל NA לא הראה את הנגועים כאן. הליך הפקת שפעת עמ' מוצג באיור 1. מיקרוגרפים אלקטרונים של העברת pps (למשל, H5N1pp) מוצגים באיור 3. התוצאות של הנגועים שאומרות על pps אלה מוצגות באיור 4. הנגועים של שבעת הסוגים של pps הוערכו בעותקי גנום לכל תא (GCP) [דומה לריבוי של זיהום (המשרד העצמי) הערך של 20. בקבוצה pps מחסה H5, הנגועים של H5N1, (H5 + N9), ו H5 היה 90.05 ± 4.05%, 17.78 ± 1.58%, 10.15 ± 2.85% עבור קו תאים A549 ו 40.37 ± 4.92%, 5.24 ± 1.32%, 4.88 ± 0.27% עבור MDCK, בהתאמה. בקבוצה pps מחסה H7, הנגועים של H7N9, (H7 + N1), ו H7 היה 10.45 ± 2.35%, 6.75 ± 1.37%, 1.23 ± 0.33% עבור קו תאים A549 ו 7.61 ± 1.04%, 4.12 ± 1.29%, 1.08 ± 0.02% עבור MDCK, בהתאמה. עבור הנגועים שאומר על pps, במיוחד HApp (H5pp, H7pp), עצבי האקסוסוגנידאז לא נוספה. באותו מבחן הנגוע, תאי MDCK שימשו גם את קו תא הבקרה כדי לבדוק את pps הנגועים. הנגועים של VSVGpp היה 20.9 ± 2.00% עבור A549 ו 16.02 ± 2.41% עבור תאי MDCK. מעטפת הדלתא גליקורופנס pp (Δenv pp) לא הראה הנגועים במחקר שלנו. נתונים אלה הראו גם כי יש/NAs ממגוון זנים וירוס מסוגלים בהצלחה ליצור חלקיקים ויראלי זיהומיות. פלטפורמת ההקלדה המדומה שלנו יכולה לפתח חלקיקים ויראליות מסוג זיהומיות המשמשים במחקר שפעת.

figure-results-1533
איור 1: סקירה של הליך הפקת שפעת pp. (א) האריזה הפלסטיות pcdna-מחסום-פול, הכתב פלאמאמצע PCDNA-gfp, ואת המעטפה גליקופרוטאין ביטוי פלמידים PVRC-HA ו PVRC-NA, הם מזוהמים לתוך pp-להפקת hek 293/17 תאים. (ב) ב hek 293/17 תאים, Polyproteins מחסום-פול הם מסונתז מועבר על ידי מנגנון לא ידוע לקרום התא. גליקורופנס HA ו-NA מועברים ומעוגנים על קרום התא דרך מסלול הסוד. העיתונאי במרכז העיתונות pcDNA-GFP משועתק לתוך אחד תקועים ענבל-GFP-RNA גנומית. (ג) במהלך או לאחר ההובלה, חלבון מחסום-פול מגייס את ה-RNA החד-ענבל-gfp הגנומית באמצעות אותות האריזה PSI-RNA, ובכך להרכיב את מתחמי טרום הנצה. (ד) מתחם המורכב מחסום-פול-ענבל-RNA, שגורם לעקמומיות ממברנה, המובילה להיווצרות ניצן. במהלך הנצה, המעטפה הנגיפית גליקורופנס יש/נאס משולבים החלקיקים המתהווה. הנצה הושלמה כאשר החלקיקים מחרימים מן קרום התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2685
איור 2: הסדר הכולל בשיטת הנגועים. המבחנים הנגועים של כל סוג של pps לתוך קו תא אחד פגיע נמדדו בטרילקאט. מכתשיים-תאי אדם נגזרים A549 ו-MDCK משמשים כתאים רגישים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3152
איור 3: העברת מיקרוגרפים אלקטרונים של pps. לא מרוכז (משמאל) ומרוכז (מימין) סופרנטאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3546
איור 4: הנגוע של pps מנורמל. הדבקה מוצגת כ-± סטיית התקן (SD) של אחוז התאים הנגועים (n = 3). הנגועים של pps הוערך בשני קווי תא, A549 ו-MDCK תאים. שבעה סוגים של pps הציגו פרופילים נגועים שונים בשני תאי יעד. Pps שרק הנמל אינו מוצג כאן כאשר הם לא הוכיחו את הנגועים. Pps כי הנמל לא מעטפה גליקוטינס (Δenv) גם לא הראו הנגועים במחקר שלנו. אחוז הנגועים מסומן על היחס של כתבת ה-GFP-תאים חיוביים ב10,000 תאים לכל מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ההכנות לסינון ביניים
פלמיד (μL, 0.1 μg/μL)H5N1(H5 + N9)H7N9(H7 + N1)H5N1H7N9לוגΔenv
pcDNA-מחסום-פול10.5310.5310.5310.5311.4311.4311.4311.4311.4312.5
pcDNA-GFP10.5310.5310.5310.5311.4311.4311.4311.4311.4312.5
Pvc-הא1.981.981.981.982.14-2.14---
pVRC-NA1.981.981.981.98-2.14-2.14--
pcDNA-VSVG--------2.14-

טבלה 1: שילובים של החלבונים HA ו-NA נגזר וירוסים H5N1 ו H7N9 ואת הכמויות הנדרשות (נפח) של דנ א פלמיד עבור העברה אחת טובה של 6 היטב צלחת. על פי הריכוז של ההכנות הפלסטיות, לחשב את הנפח הנדרש של כל ה-DNA פלמיד. הסכום הכולל של ה-DNA פלמיד עבור החיתוך של טוב אחד הוא 2.5 μg. כדי להשיג את היעילות הגבוהה ביותר וההשפעות הנמוכות ביותר שאינן ספציפיות, הצלחנו לייעל את תנאי ההעברה באמצעות משתנים מסוגים שונים של דנ א וריכוז מגיב. לאחר מיטוב, היחס של ארבעת הכמויות הפלמידים הוגדר כ 16:16:1:1. הנפח של השימוש מגיב באמצעות הזיהום היטב אחד של 6 צלחת הבאר הוא 8 μL (לא מוצג בטבלה). שניים יש ושני NAs מ H5N1 ו-H7N9 וירוסים ניתן להשתמש כדי להפיק שמונה סוגים של pps: H5N1pp, (H5 + N9) pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1) pp, H7pp ו N9pp. ה-pps שאין בנמל גליקורופנס (Δenv) או רק בנמל NA גליקורופנס לא הראו הנגועים במחקר שלנו.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצר חלקיקים מוקלדים וירוס שפעת (pp) בהגדרה BSL-2. הכתב פלבאמצע pcDNA-GFP משולבים pps והוא יכול לשמש לכמת pps על ידי FACS בתוך שיטת הנגועים. בחרנו שני סוגים של קווי תאים רגישים כי הם נמצאים בשימוש נרחב במחקר שפעת. התאים MDCK יספק שליטה טובה על המשתנה התאים האנושיים המשמשים במחקרים אלה.

פרוטוקול זה מבוסס על הרטרווירוס MLV, אשר יכול לכלול כתבת GFP ולייצר ניצנים על קרום התאית. טכניקה זו פותחה באופן נרחב לאריזת חלקיקי וירוס שפעת4,22,23,24. מערכות אחרות מבוססות על מערכת הקלדה מדומה של HIV-1 ב-19,25,26 או מערכת תא החרקים הבאוולווירוס27,28,29. הרבה גנים עיתונאי אחרים שימשו גם הפקה פסבדו-מאמרים, כגון לוציפראז (לומינציה)30,31,32,33, β-גל/lacz (על ידי צביעתהמטריה)34,35, ומופרש פוספספטאז אלקליין36,37. דוחן ואח '. השתמשו בשיטת הלוציפראז לכמת את הנגועים בחלקיקים מסוג33. בהשוואה לוציפראז, הזריחה הירוקה של GFP היא בקלות נצפתה עם מיקרוסקופ פלורסנט הפוך. זוהי דרך נוחה לבדוק את הזיהום והיעילות של הדלקת. עבור מחקר זה, הנגועים ניתן לקבוע ישירות על ידי זיהוי תאים GFP-חיוביים עם FACS.

בשיטה זו, מספר שלבים משפיעים באופן ביקורתי על התוצאות. צפיפות תא ממוטבת היא גורם קריטי לזיהום מוצלח. בפרוטוקול זה, צפיפות תאים בטווח של 80%-90% שוטף נמצאה להיות אופטימלית עבור הפקת וירוס שפעת pp. צפיפות התאים הגבוהה או הנמוכה יותר תגרום ליעילות מרבית של הזיהום. מעמד פיזיולוגי טוב של תאים המפיק הוא גם מאוד חשוב עבור ייצור חלקיקים גבוהים. זו הסיבה מדוע מעבר התא התחתון HEK 293T/17 תאים מומלץ לייצר pps בפרוטוקול זה. כמו כן, נפח ההשפעה הכימית והיחס בין ארבעת הכמויות הפלסטיות יכול להשפיע גם על היעילות הניתנת לזיהום. כדי להשיג את היעילות הגבוהה ביותר, מומלץ למטב את הגורמים הללו באמצעות שינוי ובדיקת הסכום. אנו מגדיר את היחס של ארבע הפלסטיות כמויות כמו 16:16:1:1 ואת הנפח של החצייה מגיב כמו 8 μL עבור העברה אחת טובה בצלחת 6 היטב. בעיה נוספת היא הטיפול בתאים. The HEK 293T/17producer תאים המפיק הם הדבקה נמוכה, כך טיפול ידני של התאים חייב להיות עדין מאוד. הזיהום יכול להוביל לעלייה חדירות התא, ו סרום ונוגדנים במדיום עלול להגביר את רעילות ציטוזה. מומלץ להשתמש בסרום נטול הנוגדן ונטול הנוגדנים לאחר התרבות HEK 293T/17 תאים. יתר על כן, זמן איסוף חשוב. בשנת 36 – 48 h לאחר ההעברה, את הצבע של הסופר מחייב להיבדק כדי לוודא שהוא ורוד או כתום ורוד לפני pp אוסף. סופרנטנט צהוב מציין כי המדיום הוא חומצי מדי כדי לתמוך בצמיחת תאים ובדרך כלל מוביל התשואות pp עני.

בנינו את שיטת החצייה. בצלחת של 6 מטרים כדי להשיג יותר pp נפח את מספר בארות הגידול ניתן להגדיל ו-supernatants המכילים את אותם pps ניתן לחנות יחד. לחילופין, סוג אחר של כלי קיבול יכול לשמש כדי להגדיל את התשואה pp. למשל, 18 μL של הזיהום מגיב ו-5.5 μg של ה-DNA פלבאמצע יכול לשמש כדי לבצע הזיהום עם 2.2 x 106 תאים בצלחת 1 60 mm. כמו כן, ניתן לבצע שיטת הנגועים בצלחת של 24 שעות.

הצלחת טכניקה זו יכולה להיות מושפעת מגורמים רבים. לכן, יש למטב את ההליך עבור אריזת חלקיקים מסוגים שונים של וירוסים.

בפרוטוקול זה, הקליד חלקיקים ויראליים של HPAI H5N1 ו H7N9, כמו גם שלהם הקצאה מראש, נוצרו. בשיטה זו אנו משתמשים ברביעיית-PCR של gfp-RNA בתוך הסדר הנגוע ברמה של תא בודד (כמו הגנום עותקים לכל תא) במקום תרבית רקמה מינון זיהומיות 50 (TCID50) או מסורתית משרד23,38,39. שיטות וירוסים הנגועים בווירוס מבוססים על מספר הפלאק או TCID50 בחני, אשר הן צורכת זמן ועבודה אינטנסיבית. שניהם בחני לסמוך על המדידה של אפקטים אפקט ציטופתי גלויים (cpe) נגרמת על ידי זיהום וירוס בקווי התא, כך עשוי להיות קשה נכייל וירוסים של הנגועים נמוך (כלומר, H7pp במחקר זה). אנו חושבים שזו שיטה נוחה, יעילה ומהירה לנרמול pps עם רביעיית ה-RNA של GFP הכלול ב-pps שפעת.

יחד, הטכניקה שלנו היא בטוחה וישימה, והוא יכול לשמש לחקר וירוסים עטופים, כולל קולטני שלהם, tropisms, המעטפה גליקופרוטאין פונקציה, נטרול נוגדנים, פיתוח תרופות אנטי-וירוס, אבחון, ועיצוב החיסון ערכה.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של הרפואה המחוזית ג'ה-ג'יאנג ומדעי הבריאות תוכנית טכנולוגיה (גרנט מספרים, 2017ky538), האנגג רפואה עירונית ומדעי הבריאות תוכנית טכנולוגיה (גרנט מספרים, OO20190070), האנגג מדע רפואי ו מפתח טכנולוגיה פרויקט (גרנט מספרים, 2014Z11) ו האנגג העירוני היישומים האוטונומית פרויקט של התפתחות חברתית מחקר מדעי (גרנט מספרים, 20191203B134).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Benzonase NucleaseMillipore70664Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)Corning3599Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)Costar3516Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)Gibco11965092A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serumExcellFND500fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)Beckman coultercytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cellsATCCCRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cellsATCCCRL-11268A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscopeOlympusBX51-32P01-FLB3
Inverted light microscopeOlympusCKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668019Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR KitNEBE3006LWill withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellsATCCCCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)AxygenMCT-150-C33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDFMilliporeSLHV033RSan improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco11058021The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycinGibco15140122Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)Corning430791a stable and highly reactive serine protease
Proteinase KBeyotimeST532Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)Corning430166Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsinSigmaT1426This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056

References

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501(2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629(2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825(2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70(2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254(2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155HPAIH5N1hemagglutinin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved