מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

שבלול תאים שיער פנימי (IHCs) לשדר אותות אקוסטיים לולייניות גנגליון נוירונים (SGNs) דרך הסינפסות רצועת הכלים. מספר מחקרים ניסיוניים הראו כי הסינפסות תא השיער עשוי להיות המטרות הראשוניות באובדן שמיעה sensorineural (SNHL). מחקרים כאלה הציעו את המושג של שבלול "synaptopathy", אשר מתייחס שינויים מספר סינפסה בסרט, מבנה, או פונקציה שתוצאתה שידור סינפטית נורמלי בין IHCs ו SGNs. בעוד synaptopathy שבלול הוא בלתי הפיך, זה לא משפיע על סף השמיעה. במודלים ניסיוניים המושרה ברעש, נזק מוגבל לסינפסות IHC באזורי תדר נבחרים מועסק כדי לזהות את הגורמים הסביבתיים הגורמים במיוחד לsynaptopathy, כמו גם להשלכות הפיזיולוגיות של הפרעה לאוזן הפנימית הזו מעגל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מורפולוגיה סינפטית שבלול ותפקוד באזור תדר ספציפי בעכברים למבוגרים. בפרוטוקול זה, לוקליזציה של שבלול של אזורים בתדר ספציפי מבוצעת באמצעות מפות מקום תדר בשילוב עם נתונים cochleogram, בעקבות המאפיינים מורפולוגית של סינפסות הסרט מוערכים באמצעות סינפטית חיסוני. הסטטוס התפקודי של הסינפסות ברצועת הכלים נקבע לאחר מכן על בסיס המוני של תגובת המוח השמיעה (ABR) גל I. הדו ח הנוכחי ממחיש כי גישה זו יכולה לשמש כדי להעמיק את ההבנה שלנו של הפתוגנזה ומנגנונים של תפקוד סינפטית ב שבלול, אשר עשוי לסייע בפיתוח התערבויות טיפוליות הרומן.

תדרים בטווח של כ 20 \ u201220, 000 הרץ ניתן להיתפס כגירויים שמיעתי על ידי בני אדם. השמיעה האנושית היא בדרך כלל רגיש ביותר בקרבת 1,000 Hz, שבו רמת הלחץ הממוצע הקול הוא 20 μPa במבוגרים צעירים (כלומר, 0 דציבלים של רמת לחץ קול [dB SPL]). בכמה מצבים פתולוגיים, אובדן שמיעה מוגבל לתדרים ספציפיים. לדוגמה, בשלבים המוקדמים של אובדן שמיעה המושרה רעש (NIHL), "חריץ" (כלומר, שמיעה העלאת הסף) ניתן לצפות audiogram ב 4 kHz¹. לאורך מחיצת שבלול היונקים, ההדרגתיות של נוקשות והמסה לייצר מפת תדר מעריכי, עם זיהוי צליל בתדר גבוה בבסיס של שבלול ואיתור תדר נמוך בקודקוד². אכן, יש מפה בתדר המקום שבלול לאורך קרום בזיאר, המוביל מה שמכונה tonotopic הארגון^2,3. כל מקום נתון על קרום בזיאר יש את הרגישות הגבוהה ביותר רק אחד תדר צליל מסוים, אשר מכונים בדרך כלל את התדר האופייני^3,4, למרות התגובות תדרים אחרים ניתן גם לצפות.

עד כה, מודלים של עכברים שונים המועסקים לחקור פונקציה נורמלית, תהליכים פתולוגיים, ויעילות טיפולית במערכת השמיעה. ידע מדויק של הפרמטרים הפיזיולוגיים של שבלול העכבר הוא תנאי מוקדם עבור מחקרים כאלה של אובדן שמיעה. שבלול העכבר מחולק אנטומית לתוך הפונה הבסיס, באמצע, ו בסיס, המתאימות אזורי תדר שונים. על-ידי תיוג עצבי שמיעתי בתוך הגרעין שבלול לנתח אתרים המתאימים שלהם אינבציה היקפית ב שבלול, מולר ואח ' הצליח להקים את מפת תדר שבלול המקום בעכבר רגיל ב vivo⁵. במרווח של 7.2 – 61.8 kHz, אשר מתאים למיקומים בין 90% ו 10% מהאורך המלא של קרום בזיאר, העכבר שבלול מקום המפה תדר ניתן לתאר על ידי פונקציה רגרסיה פשוטה ליניארית, מציע קשר בין ה מרחק מנורמל מבסיס שבלול והלוגריתם של התדר האופייני⁵. בעכברי מעבדה, מפת תדר המקום ניתן להשתמש כדי לחקור את הקשר בין סף שמיעה בתוך טווחי תדרים ספציפיים ושבלול מראה את המספרים של תאי שיער חסרים באזורים יחסיים לאורך קרום בזיאר⁶. חשוב להניח, מפת תדר המקום מספקת מערכת מיקום לחקירה של נזק מבני מינימלי, כגון נזק הסינפסות רצועת הכלים של תאי השיער במקומות ספציפיים תדר שבלול בעכברים עם טראומה שמיעתי היקפית^{7 ,8}.

ב שבלול היונקים, הסינפסות של הסרט מורכבת מסרט טרום סינפטיות, הקרנה צפופה באלקטרון המההילה הילה של שלפוחיות סינפטית מוכנות שחרור המכיל גלוטמט בתוך ה-IHC, ודחיסות פוסט-סינפטית במסוף העצבים של SGN עם קולטני גלוטמט⁹. במהלך התמרה צליל שבלול, הטיה של החבילה של תא השיער התוצאות ב-IHC depolarization, אשר מוביל גלוטמט לשחרר מ-Ihc אל המסופים הפוסט-סינפטיות, ובכך הפעלת מסלול השמיעה. הפעלת מסלול זה מובילה לטרנספורמציה של אותות מכניים המושרה הקול לתוך קוד תעריף ב-SGN¹⁰. אכן, הסרט ה-IHC סינפסה מתמחה במיוחד לשידורי צליל בשיעור של מאות הרץ עם דיוק גבוה בזמן, והוא בעל חשיבות קריטית למנגנון טרום-סינפטית של קידוד קול. מחקרים קודמים גילו כי הסינפסות הסרט להשתנות מאוד בגודל ומספר באזורים תדירות שונים בעכבר למבוגרים שבלול^11,12, כנראה המשקף הסתגלות מבנית קידוד צליל מסוים עבור צרכי הישרדות. לאחרונה, ניסויים בבעלי חיים ניסיוניים הוכיחו כי synaptopathy שבלול תורמת לצורות מרובות של ליקויי שמיעה, כולל אובדן שמיעה המושרה רעש, הקשורות לגיל אובדן שמיעה, ואובדן שמיעה תורשתי^{13, 14}. לפיכך, שיטות לזיהוי שינויים בקורלציה במספר סינפטית, מבנה ותפקוד באזורי תדר ספציפיים המועסקים יותר ויותר במחקרים של פיתוח שמיעה ומחלת האוזן הפנימית, באמצעות מודלים שנוצרו באמצעות מניפולציה ניסויית של משתנים גנטיים או סביבתיים^15,16,17.

בדוח הנוכחי, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח מספר סינפטית, מבנה, ותפקוד באזור תדר מסוים של קרום בזיאר בעכברים למבוגרים. לוקליזציה של תדר שבלול מבוצעת באמצעות מפת תדר מקום נתון בשילוב עם cochleogram. מאפיינים נורמליים מורפולוגית של הסינפסות בסרט שבלול מוערכים באמצעות מערכת החיסונית הפוסט-סינפטית. הסטטוס הפונקציונלי של הסינפסות סרט שבלול נקבע על בסיס המוני suprathreshold של גל ABR I. באמצעות שינויים קלים, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון תנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים אחרים, כולל חולדות, שרקנים, וגרבילים.

כל ההליכים בוצעו בהתאם NRC/ILAR מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (8 ה Edition). פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש של האוניברסיטה הרפואית ההון, בייג, סין.

1. בחירת חיות

1. לכל הניסויים, השתמשו בעכבר זכר מבוגר C57BL/6J (בן 8 שבועות) כמודל החי.
   הערה: C57BL/6J עכברים נושאת אחוו של התערוכה Cdh23 מואצת הזדקנות במערכת השמיעה, משתקף כמו 40% הפסד של הסינפסות של הסרט בתור בסיס של שבלול ו 10% הפסד בתורו באמצע על ידי 6 חודשים של גיל, ואחריו מהיר להגדיל את ההפסד הזה ב שבלול כולו עם גיל^18,19. לכן, אנו מייעצים זהירות בעת שימוש בעכברים C57BL/6J יותר מאשר 6 חודשים עבור מחקר השמיעה. זנים אחרים של עכברים ניתן להשתמש בהתאם למטרות ניסיוני ספציפי.
2. לבדוק את העכברים באמצעות כיס אבחון מקצועי האוטוסקופ כדי לשלול את הפתוגיות החיצוני או האוזן התיכונה לפני הערכות שמיעה. סימנים פוטנציאליים עשויים לכלול נוזל או מוגלה בתעלת השמיעה החיצונית, אדמומיות ונפיחות ברקמה המקומית, ו ניקוב התוף.
   הערה: למרות שהוא נתקל לעתים נדירות, מזוהה פעם, עכברים עם מחלות האוזן החיצונית או התיכונה צריך להיות נשלל.

2. הערכת שמיעה

1. עכברים מורדם תוך שימוש בהזרקה תוך הצפק של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine הידרוכללוריד (10 מ"ג/ק"ג). שופט את עומק ההרדמה באמצעות גירויים כואבים (למשל, רפלקס הבוהן).
   הערה: כאשר רפלקס הבוהן הוא נעדר לחלוטין, החיה הגיעה לעומק הולם של הרדמה לבדיקות שמיעה. אם נדרש זמן רב יותר עבור הקלטות ABR דו-צדדיים, יש לנהל מינון נמוך יותר (חמישית המינון המקורי) של הרדמה כדי לשחזר את מישור ההרדמה המקורי. שמור על עצמך להימנע ממנת יתר של הרדמה, כמו זה עלול להוביל למוות בעכברים.
2. שמרו על טמפרטורת הגוף של בעל החיים המורתת ב37.5 מעלות צלזיוס בעזרת משטח חימום תרמי. מניחים את בעל החיים ההרדמה בחדר ממוגן חשמלית ומסוכך כדי למנוע הפרעות במהלך מבחן השמיעה.
   הערה: שמרו על הטמפרטורה הפיזיולוגית במהלך ההליך כולו עד שבעל החיים יהיה ער לחלוטין, על מנת למנוע מוות שנגרם על ידי היפותרמיה פוסט-הרדמה.
3. מקום אלקטרודות המחט משנה (20 מ"מ, 28 G) בקודקוד של הגולגולת (הקלטה אלקטרודה), באזור מתחת הפרוציאני צלעות מתחת לפינה של האוזן נמדד (אלקטרודה התייחסות), ו באזור הפרומלא הצלעות (אלקטרודה הקרקע), עם עומק של 3 מ"מ מתחת לעור של ראש העכבר, בהתאמה²⁰.
4. השתמש ברמקול בשדה סגור כדי לבצע גירוי אקוסטי באמצעות צינורית פלסטיק של 2 ס מ עם טיפ דמוי חרוט. התאימו את הקצה לתעלת האוזן החיצונית²¹.
   הערה: ודא כי העכבה החשמלית של ההקלטה התייחסות אלקטרודות הוא פחות מ 3 kOhm (בדרך כלל 1 kOhm). אם העכבה גבוהה, לשנות את האתר הכניסה של האלקטרודה, לנקות את האלקטרודה עם אלכוהול, או להחליף את האלקטרודה כדי למנוע שינויים ב-ABR משרעת גל.
5. עבור הקלטת ABR, ליצור פיפס טון (3 המשך אלפיות, 1 ms עלייה/סתיו פעמים, בקצב של 21.1/s, תדר: 4 – 48 kHz) ולהציג אותם בירידה SPLs מ 90 אל 10 dB ב 5 \ u201210 dB SPLS צעדים²⁰. במהלך שלב זה, התגובות הם מוגבר (10,000 פעמים), מסוננים (0.1 – 3 kHz), וממוצעים (1,024 דגימות/רמת הגירוי).
   הערה: ABRs נאספים עבור כל רמת גירוי 10 שלבים dB, עם תוספת 5 שלבים dB ליד הסף.
6. בכל תדר, לקבוע את הסף ABR, אשר מתייחס SPL מינימלי וכתוצאה מכך הקלטה ABR אמין עם אחד או יותר גלים להבדיל זה יכול להיות מזוהה בבירור על ידי בדיקה חזותית (איור 1).
   הערה: בדרך כלל יש צורך לחזור על התהליך של SPLs נמוך סביב הסף כדי להבטיח את העקביות של צורות גל. סף התגובה הוא רמת הגירוי הנמוכה ביותר שבה ניתן לצפות בצורת גל, כאשר ירידה של 5 dB יוביל להיעלמות של צורת הגל.

3. עיבוד רקמת שבלול

1. לאחר הקלטת ABR, המתת את העכברים המקערים באמצעות פריקת צוואר הרחם, והוא מערוף אותם, חושפים את בולה מהצד הגחוני, ופותחים במספריים חדים כדי לקבל גישה לשבלול.
2. בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את עצמות הזמן, נתק את העורק העצמי, הוצא את הארבס מהחלון הסגלגל, וקרע את קרום החלון העגול. הפוך חור קטן בקודקוד של השבלול על ידי סיבוב בעדינות של קצה מחט (13 מ"מ, 27 G).
3. לתקן את עצמות מבודדות עם 4% (wt/vol) פאראפורמלדהיד ב 0.1 M פוספט באגירה מלוחים (PBS, pH 7.4) לילה ב 4 ° c. באמצעות שימוש בפיפטה דק, ריקון בעדינות באמצעות החללים perilymphatic באמצעות היישום כדי הסגלגל או העגול חלונות (כמו כניסת) ואת הפתיחה בפיסגה (כפורקן).
   הערה: חלבונים מסוימים דורשים משך זמן קצר של קיבעון כדי למנוע הרס של האפיאוסקופים שלהם לאימונויניום. במקרים כאלה, עצמות הדגירה 4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h, בהתאם להוראות של היצרן עבור אימונוהיסטוכימיה. קיבעון יכול גם להתבצע באמצעות זלוף לב להסיר את הדם שבלול, הימנעות רעש הרקע בשל כתמים לא ספציפיים בשלבים מאוחרים יותר, במיוחד בדגמי העכבר של synaptopathy שבלול.
4. לשטוף את העצמות שלוש פעמים עבור 5 דקות עם 0.1 M קר PBS להסיר פאראפורמלדהיד שיורית. Decalcify העצמות עם 10% החומצה ethylenediamאצטט (EDTA) גם ב RT עבור 4 h או ב 4 ° c עבור 24 h באמצעות טלטול עדין בשייקר אופקי ב 20 סל ד. ניתן לרענן את EDTA באמצע.
   הערה: זמני הדאלציפיקציה כפופים לריכוז ההעדפות של EDTA והעדפות המשתמשים. רקמת decalcified צריך לשמור על מידה מסוימת של קשיחות, אשר מקלה על מניפולציה של בידוד שבלול כולו טעינות בשלבים מאוחרים יותר. עצמות הזמן יכול להיות decalcified תוך 10% EDTA עם סיבוב, המאפשר לחוקרים לעזוב את המעבדה לאחר בדיקות ABR וניסויים קיבעון. זמן הדאלקיפיקציה גמיש בטווח של 20 עד 30 שעות ב -4 ° c.
5. העבר עצם ברקה אחת מ EDTA ל 0.1 M PBS. השימוש3,5 מלקחיים דומונט ו 27 המחט G כדי לנתח את האזורים apical, באמצע בסיס שבלול בתורו ולאחר מכן לנתח את שבלול מתוך העצם תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו (כפי שמתואר בעבר²²). הפוך סדרה של חתכים קטנים לאורך הרצועה הספירלית באמצעות להב תער, והסר את קרום הממברנה והקרום של רייסנר (איור 2).
   הערה: כל עוד שבלול הגזור אינו שלם, ניתן לשנות תהליך זה בהתאם לפרוטוקול הרגיל של המפעיל הפרטני.
6. עוד לנתח את אפיתל השמיעה הנותרים כולל ספירלה לימבוס לתוך שבלול הפרט הפניות (איפקס, באמצע, בסיס עם אזור הקרס) עבור ההכנות להרכבה מלאה.
7. תחת מטרת הנפט 40x של מיקרוסקופ אור, למדוד את אורך הקרום בזיאר עם קנה מידה של 250 יקרומטר ממוקם העין, אשר ניתן לכוונן לאורך סטריאוקיליה של ihcs.
8. חישוב אורך של כל שבלול להפוך על ידי הוספת כל אורכי קטע (250 יקרומטר לפלח), ובמקביל להשיג את האורך הכולל של קרום בזיאר על ידי סיכום האורכים של כל סיבוב.
9. להמיר את האורך הכולל של קרום בזיאר כולל אזור הקרס לתוך אחוזים מבוסס על המרחק מן איפקס שבלול (0% מתייחס איפקס שבלול, 100% לבסיס שבלול).
10. המר מרחק זה לתוך התדר האופייני לשבלול באמצעות פונקציה לוגריתמית (d (%) = 1-156.5 + 82.5 × log (f), עם מדרון של 1.25 מ"מ/אוקטבה של תדירות, כאשר d הוא המרחק המנורמל מקודקוד שבלול באחוזים, f הוא תדירות kHz), כפי שתוארה בעבר^5,6. כך טווח התדר באזור המקביל של קרום בזיאר על כל פנייה שבלול ניתן לרכוש.

4. מאימונולואובורנציה

1. לאחר הניתוח, המקום כל להפוך את שבלול בנפרד 2.5 mL שפופרת צנטריפוגה ו השבלול מתהפך 10% סרום עז/PBS/0.1% טריטון X-100 עבור 1 h ב RT על מסובבי.
2. הסר את פתרון החסימה/החדירות לעיל מכל צינור באמצעות טיפ 200 μL מתחת למיקרוסקופ הניתוח ומארג את הדגימות עם נוגדנים עיקריים מדולל ב 5% סרום עז/PBS/0.1% טריטון X-100 לילה ב 4 ° c על מסובבי.
   הערה: עבור immunolabeling של סרטים סינפטיות שבלול, להשתמש בעכבר סמן טרום המוח נגד carboxyl-מסוף כריכת חלבון 2 IgG1 (CtBP2, מתייג את התחום B של חלבון פיגומים RIBEYE, 1:400) ואת העכבר מסמן postsynaptic נגד גלוטמט קולטן 2 IgG2a (GluR2, מתייג יחידת משנה של קולטן אמפא, 1:200)²³.
3. לשטוף שלוש פעמים עבור 5 דקות עם 0.1 M קר PBS להסיר נוגדנים הראשי שיורית מודלת את הדגימות עם נוגדנים משניים מדולל ב 5% סרום עז/PBS/0.1% טריטון X-100 ב RT עבור 2 \ u20123 h בחשכה על מסובבי.
   הערה: להכין תערובות נוגדנים משני המתאים באמצעות עז נגד עכבר באלקסה Fluor 568 (IgG1, 1:500) ו עז נגד עכבר אלקסה Fluor 488 (IgG2a, 1:500), אשר משלימים את הנוגדנים העיקריים המשמשים בשלב 4.2. כדי לשפר את יעילות התיוג עבור סרטים סינפטיות, אנו ממליצים לבחור נוגדנים משניים ספציפיים. מעבדות מסוימות מרחיבות את הדגירה עם נוגדנים משניים כדי להגדיל את GluR2 immunolabeling²⁴.
4. לשטוף שלוש פעמים עבור 5 דקות עם 0.1 M PBS להסיר נוגדנים משניים שיורית להעביר את הדגימות מ 2.5 שפופרות צנטריפוגה ל 35 מ"מ לוחות המכילים 0.1 M PBS.
5. מניחים טיפה של המדיום להרכבה המכילה 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) אל השקופית ולהעביר את הדגימות מ-PBS למדיום ההרכבה. מניחים קצה אחד של שמיכות בשקופית ולשחרר כדי לאפשר את הכיסויים ליפול בעדינות.
   הערה: כדי להבטיח כי תאי השיער הפנים כלפי מעלה וכי אין קיפול או פיתול של דגימות שבלול מתרחשת במהלך ההליך, הר דגימות שבלול תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו.
6. הצב את השקופיות בתיבת שקופיות ב-4 ° צלזיוס ללילה כדי לאפשר לשקופיות להתייבש ולאחר מכן לדמות מתחת למיקרוסקופ לייזר.

5. מורפולוגית הערכה של סרט שבלול הסינפסות

1. שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד עם שלושה לייזרים — 405 ננומטר UV, a 488 לייזר הארגון ננומטר, ו 561 ננומטר דיודה מוצק-מדינה (dpss) לייזר לרגש dapi (הספקטרום העירור 409 – 464 nm), אלקסה fluor 488 (הספקטרום העירור 496 – 549 nm) ו אלקסה fluor 568 (הספקטרום עירור 573 – 631 ננומטר), בהתאמה.
2. לרכוש קונפוקלית וקד z-ערימות מעל מרחק של 8 יקרומטר מכל שבלול לפנות באמצעות 63 x ברזולוציה גבוהה שמן טבילה העדשה.
   הערה: לאחר ההגדרה, יש לשמור ולהחיל את כל הפרמטרים עבור שקופיות הדיגיטציה ולהחילו בצורה אחידה על כל השקופיות.
3. עבור ספירות סינפטית, הגדר את הערימות z (0.3 יקרומטר) כדי להקיף את כל האורך של ihcs, ובכך להבטיח שכל הסינפטיות ניתן לדימות.
4. מזג את התמונות המכילות דקדטה במחסנית z לקבלת הקרנת ציר z, ויבא לתוכנת עיבוד התמונה.
5. חלק את הספירות הכוללות של הסינפטיות בכל מחסנית z באזורי תדר ספציפיים לפי מספר ה-IHCs (שווה לספירות הידניות של DAPI) כדי לחשב את מספר הדקדפי הסינפטית עבור כל IHCS. בכל אזור תדר ספציפי, הממוצע כל הסינפטיות בשלוש תמונות של שדות מיקרוסקופיים שונים המכילים 9-11 IHCs.
   1. חלוקה לרמות של אזור האינטרסים (ROIs) כולל אזורים בעלי צלעות של כל IHC באמצעות לחצן בחירות ביד חופשית. השתמש בפונקציה מדידה עבור כימות אוטומטי של דקדטה, ואת הפונקציה של פרשת השמש כדי להבחין בין כתמים סמוכים סמוך.
   2. לאחר כל ספירה אוטומטית, בצע בדיקות חזותיות עם תיקונים ידניים כדי להבטיח ספירה מהימנה.
      הערה: מומלץ להישאר מתעוור באשר לשאלה האם השקופית היא מהקודקוד, האמצעי או הבסיס של השבלול.
6. הערכת חזותית מבנה סינפטית והפצה, כדי לבודד באופן ידני ihcs בודדים מןהשכנים שלהם על ידי כלי עיפרון (M) כדי להמחיש טוב יותר את ארכיטקטורת ציטושלד ולוקליזציה סינפטית.
7. כדי לבחון את הסמיכות של סרטים טרום סינפטיות (CtBP2) ותיקוני קולטן פוסט סינפטית (GluR2), לחלץ את שטח voxel סביב רצועת הכלים על ידי הכלי סימון מלבני ולבודד רצועת הכלים בודדים על ידי חיתוך. באמצעות לחיצה על תמונה ≫ גודל תמונה, לרכוש מערך תמונות ממוזערות של התחזיות האלה מיניאטורי, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות סינפסות לזווג (הופיע כמו זוגות מקרוב של CtBP2-חיובית ו GluR2-חיובית דקדטה) לעומת יתום סרטים (מחסור במדבקות של קולטן גלוטמט פוסט-סינפטית) (איור 3).
   הערה: סינפסות שבלול נורמלית להופיע כמו immunolabeling משולב של הסרט preסינפטיות בתוך תא השיער (anti-CtBP2) ואת התיקון של מגלוטמט פוסט סינפטיות בטרמינל עצבי השמיעה (anti-GluR2)²⁵. כמה מעבדות להשתמש בתחזיות קונפוקלית וקד בשילוב עם דוגמנות 3d כדי לכמת את גודל התיקון הסינפטית או נפח^26,27. לפני אובדן משמעותי של הסרט סינפסות, סרטים המציגות שינויים בגודל או ללא מזווג מדבקות בקולטן גלוטמט סביר להניח מעיד על תפקוד סינפטית^27,28.

6. הערכה פונקציונלית של רצועת הכלים של שבלול הסינפסות

1. לאסוף את כל גלי ABR עבור כל גירוי בתדר שהוצגו ב SPL של 90 dB עבור ניתוח של הגלים ABR של suprathreshold אני המוני.
   הערה: מחקרים נוירולוגיים ומורפולוגיים הוכיחו כי נמוך הקצב הספונטנית סיבים פגיעים במיוחד להזדקנות רעש חשיפה^29,30. למרות ההפסד הפשוט של הסינפסות הסרט לא יכול להשפיע על ספי ABR, זה בדרך כלל התוצאות הנחות משמעותיות ב-ABR גל אני המוני, כי אלה afferents כולל נמוכה הקצב ספונטנית, סיבים סף גבוהה ומדרג ספונטנית גבוהה, סיבים נמוך הסף תורמים בכבדות לפעילויות מסוכם של סיבי עצב שבלול^28,29,31. עוצמה suprathreshold של 90 dB SPL נבחר כאן.
2. קביעת גל משיא לשיא אני משרעת באמצעות תוכנית ניתוח לא מקוון (איור 4). כל גל שאני במבחן ABR מורכב הסטה חיובי (p) והטיה שלילית (n) שלאחר מכן. ABR גל אני משרעת מוגדר כהפרש מתח בין Ip (השיא החיובי של גל I) ו ב (הפסגה השלילית של גל I)²⁹.
   הערה: בתנאים פתולוגיים, synaptopathy שבלול ניתן לקבוע מבוסס על הגברה suprathreshold של גל ABR אני, אשר משקפים את התגובות התפרצות מסוכם של SGNs עורר על ידי צליל. עם זאת, רגישות שבלול כי הוא לא נפרץ עקב תפקוד OHC הוא תנאי מוקדם עבור שיטה זו.

ABR בדיקות שמיעה בוצעו עבור 10 C57BL/6J עכברים (8 שבועות של גיל) תחת הרדמה. ABRs היתה היתה באמצעות גירויים פרץ טון ב 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz. סף השמיעה של כל חיה זוהה באופן חזותי על ידי הבחנה לפחות אחת צורת גל ברורה ב ABR. כל העכברים הציגו ספי ABR בתגובה התפרצויות טון, נע בין 25 ו 70 dB SPL בהתאם לתדירות של הגירוי. התוצאות שלנו הראו כי הסף שמיעה היה הנמוך ביותר 16 kHz (איור 1), המתאים כ 43% מרחק הקודקוד שבלול (איור 2), הרומז רגישות אקוסטית מופחת באופן משמעותי שבלול אחרים אזורים.

שבלול שלמות הטעינות היו מבודדים מעצמות הזמן בעכברים למבוגרים תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו (איור 2א). כל הטעינות של אפיתל השמיעה היו מיוצרים לתוך שלוש חתיכות, האורכים שנמדדו ובסופו של דבר הומרו למרחק אחוזים מקודקוד שבלול. מיקום התדר על קרום בזיאר של כל סיבוב שבלול היה מחושב באמצעות פונקציה לוגריתמי, כפי שתוארה בעבר^5,6 (איור 2ב).

כדי להעריך את המאפיינים מורפולוגיים של הסינפסות בסרט שבלול, נוגדנים נגד CtBP2 ו GluR2 שימשו תוויות טרום סינפטיות ומבנים פוסט סינפטית, בהתאמה. באוזניים נורמלי של עכברים למבוגרים, מכתים חיסוני חשף זוגות של סרטים סינפטיות וטלאים קולטן גלוטמט לגרות את פני השטח של קרום basolateral של IHCs, עם 8 – 20 זוגות לכל IHCS (איור 3א). למרות שהרוב המכריע של הדקדטה הופיע כזוגות שהיו באוזניים רגילות, ניתן לצפות בסרטים יתומים לעתים נדירות בהגדלה גבוהה (איור 3ב). ספירות של הסינפסות ברצועת הכלים של IHC (כתמים אימונוtive עבור שני CtBP2 ו GluR2) היו הגבוהים ביותר ב -16 באזור kHz, ירידה משמעותית כאשר המרחק ממיקום זה עלה (איור 3ג). מספר הסינפטית נקבע על בסיס התחזיות הקונמוטיות לספק הערכה של המספר המירבי של סיבי עצב השמיעה המעבירים מידע מתוך שבלול למוח²⁹.

הסטטוס הפונקציונלי של שבלול הסרט הסינפסות נחקר בכל העכברים למבוגרים המבוססים על גל הגברה abr המוני, אשר מספקים מידע לגבי שלמות תפקודית של סיבים עצביים השמיעה^29,31. גל ABR אני מגביר המוני בכל תדר של גירוי הציג ברמת לחץ קול של 90 dB נמדדו משיא לאבוס הבא, כפי שמוצג באיור 4א. גל ABR אני משרעת היה הגבוה ביותר בתדר של 16 kHz, המתאים לסף השמיעה הנמוך ביותר, וערכי משרעת באופן משמעותי ירד במרחק ממיקום זה גדל (איור 4ב). תוצאה זו היא עקבית עם שינויים שנצפו בספירת הכלים סינפסה, המציינת כי הסינפסות בתוך אזור זה שבלול עשוי להפגין את תפקוד הסינפטית החיה ביותר. יתר על כן, בשנת לימודי העכבר הקודם של רעש המושרה הקשורות לגיל נוירוניוון שבלול, suprathreshold המוני גל ABR הצטמצמה בפרופורציה לאובדן סרט, המציין כי גל ABR אני משרעת הוא מאוד בקורלציה עם מידת שבלול synaptopathy^29,31.

איור 1 : הערכת שמיעה. ABR השוואות הסף בין תדרים שונים של גירויים פרץ טון הראו כי הסף שמיעה היה הנמוך ביותר 16 kHz ב 10 מבוגרים C57BL/6J עכברים. תגובת ה-ABR הייתה מוגבהת באופן משמעותי באזורי תדר אחרים (ANOVA בכיוון אחד עם מבחן השוואת ההשוואה הכפולה של דנטו, הכולל את הבדיקה הראשונה של השוואה מרובה; *: P < 0.01, n = 20 אוזניים). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 : לוקליזציה של תדר שבלול בעכברים. (א) דמות ייצוגית של ההסבר המלא שבלול, אשר בוטלה מעצם הרקה תחת מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו. (ב) שבלול העכבר מחולק לתוך apical, באמצע, ו בסיס פונה, שבו הקיר הצדדי שבלול מוסר. עיגולים אדומים על השברים של קרום שבלול בסילאר מצביעים על מיקומי התדר ואת המיקומים המקבילים שלהם מנורמל ב שבלול (0% מתייחס איפקס שבלול, 100% לבסיס שבלול). סרגל קנה מידה = 250 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3 : אנליזה קונפוקלית מתוך הסינפסות בסרט שבלול בעכברים. (A) מייצגים תמונות של הסינפסות של סרט עבור 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz אזורים, חיסוני עבור סרטים טרום סינפטיות (CtBP2, אדום) ו פוסט סינפטית מבנים (GluR2, ירוק). קווים מקווקווים לבנים משמשים למתאר תאי שיער פנימיים לצורך התייחסות. סרגל קנה מידה = 10 μm. (ב) High-power התמונות הממוזערות של קונפוקלית z-ערימות להראות כי הסינפסות הסרט האלה הופיעו באופן מקרוב זוגות של CtBP2-חיוביים (אדום) ו GluR2-חיובית (ירוק) דקדטה (שמאל ובאמצע), בעוד סרטים יתומים (מימין) חסר הסינפטיות כתמי קולטן גלוטמט היו נדירים מאוד. סרגל קנה מידה = 0.5 μm. (ג) ניתוח כמותי של לזווג ברצועת הכלים עם כל האלמנטים הפרסינפטית והפוסט-סינפטית התגלו כי מספר התאים הסינפטית לתאי השיער הפנימי היה גבוה באופן משמעותי באזור 16 kHz מאשר באזורים אחרים בתדירות (ANOVA בכיוון אחד עם מבחן השוואת ההשוואה הכפולה של דנטו; *: P < 0.01, n = 6 אוזניים). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4 : ניתוח גל אבאר אני המוני בעכברים . (א) נציג abr בצורת גל מן הישן 8 שבועות C57BL/6j העכבר נחשף 16 kHz הטון טהור בעוצמה של 90 dB (גירוי התפרצות ב 0 ms). ספרות רומיות לסמן את הפסגות של גלי ABR. קווים מנוקדים לסמן את הגל אני שיא שוקת, המציין את השרעת. (ב) ניתוח כמותי של גל ממוצע אני מגביר בתגובה ל 4, 8, 16, 32, ו 48 kHz גירוי הציג ברמת לחץ קול של 90 dB. גל ABR אני המוני היו הגבוהים ביותר בתדירות של 16 kHz ונמוך באופן משמעותי בתדרים אחרים (ANOVA בכיוון אחד עם מבחן מרובה ההשוואה של דאננט לאחר השוואה; *: P < 0.01, n = 20 אוזניים). נתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מאז synaptopathy שבלול התאפיין לראשונה בעכברים למבוגרים עם שינוי סף זמני (TTS) המושרה על ידי 8 \ u201216 kHz הלהקה רעש ב 100 dB SPL עבור 2 h³¹, חוקרים חקרו יותר ויותר את ההשפעות של synaptopathy במגוון יונקים, כולל קופים ובני אדם^32,33. בנוסף לחשיפה רעש, מספר תנאים אחרים המשויכים synaptopathy שבלול (למשל, הזדקנות, השימוש בתרופות האוטוטוקסיטים, מוטציות גנטיות), המוביל להפרעה לטווח קצר של האודישן suprathreshold, ואחריו בלתי הפיך ניוון. של עצב השמיעה בשלב המוקדם של עלבון שבלול, synaptopathy מתרחשת לעתים קרובות במיקום תדירות מסוים, במיוחד במודלים ניסיוניים שבו נזק הסינפסות ihc מוגבל כדי לבחור אזורי תדר^24,31. לכן, הפרוטוקול שלנו משמעותי בכך שהוא מאפשר חקירה של מורפולוגיה סינפטית ותפקוד באזור תדרים ספציפי.

המפה בתדר המקום שבלול יכול לשמש כדי להפלות פונקציה שמיעתי נורמלית וחריגים, עוד המשקף אזור רגיל נורמלי באוזן הפנימית. מאז טכניקות הכנה לפני השטח השתמשו לראשונה להתוות תאים שיער שלמים וחסרים שולי שבלול פונה שונים, cochleogram הפך שיטה שגרתית עבור הפסד תא השיער שיער⁶. לכן, כדי להתאים עלבונות מורפולוגיים ב שבלול לשינויים פיזיולוגיים רלוונטיים, זה סביר לכלול מפת תדר מקום על cochleogram. שיטה זו מאפשרת אחד לקבוע את מספר ומבנה של הסינפסות בהתבסס על המיקומים שלהם לאורך קרום שבלול השבלול ביחס להקים מפות בתדר שבלול מקום, ובכך לספק מספיק מידע עבור השוואות מפורטות בין תוצאות היסטולוגית ופיסיולוגיות. עם זאת, מחקרים מסוימים להעריך synaptopathy מבוסס על קטע שבלול או מרחק לאורך תעלת שבלול, אשר אינה מאפשרת השוואות ישירות בין שבלול הפרט בשל וריאציות פנים מינים באורך קרום בזיאר. לפיכך, חשוב במיוחד לתקנן את הcochleogram על-ידי המרת אורכי שבלול נפרדים ממילימטרים לאחוז יחסי.

Synaptopathy יכול להיות מאושר באמצעות ויזואליזציה של החיסוני עבור CtBP2 חלבון (הסינפטיות סינפטית "ribeye") באזורים בזלת הצלעות של IHCs. אלה טלאים CtBP2-חיוביים יכול לשמש כסמן מבניים עבור כימות של סרטים טרום סינפטיות, ואת הנוכחות של מדבקות פחות בדרך כלל מעיד על אובדן טרום סינפטיות. למרות מחקרים קודמים דיווחו כי 98% של סרטים טרום סינפטיות משויכים עם מסופים פוסט סינפטית באוזן נורמלית³⁰, המספר הפשוט של תיקוני CtBP2-חיוביים לא יהיה מדויק עבור ניתוח כמותי של הסינפסות מלאה, כמו זה עלול להוביל להערכת יתר של ספירות סינפסה באוזן הפצועה על-ידי מעורבות "יתומים" (סרטים מוקדמים לא משויכים עם מסופים פוסט-סינפטיים). כדי לשפר את הדיוק של מספר סינפסה, נוגדנים נוספים נגד מבנה פוסט-סינפטית כגון GluA2, GluA2/3, או PSD-95 משמשים. החלבון בצפיפות postsynaptic PSD-95, קרום guanylate קינאז ממברנה (ממאת) בחלבון פיגומים, יכול להיות מתויג באמצעות נוגדן נגד PSD-95, אשר נצפתה בעיקר על אנשי הקשר בין תאי שיער ו-SGN לסופים סיבים^{34, 35}. עם זאת, את הנוגדן נגד GluR2 הוא ספציפי יותר עבור קולטני-type ionotropic הקולטנים בקרום פוסטסינפטית, אשר יכול לזהות באופן אמין יותר את הסינפסות של הסרט (מעמת זוגות של אימונוofoooooooooooooa הCtBP2 ו פוסט סינפטית GluR2)¹⁵. בנוסף ניתוח מורפולוגיים, ניתוח היסטולוגית של סינפסות מלאה ניתן להשתמש כאינדיקטור פונקציונלי עבור synaptopathy. בעכברים למבוגרים עם synaptopathy שבלול, הנחות ב-abr גל משרעת בעקבות המצגת של גירויים טון בינוני עד גבוה מתרחשים בתדרים tonotopically מריחה על העור הקשורות לאזורים של אובדן סינפטית^26,29. מונה סינפסה מושגת באמצעות שיטה זו מוגבלים בכך שלוקח כ 10 דקות לסרוק אתר אחד על קרום בזיאר. יתר על כן, כדי להעריך וריאציות מרחבי במספר סינפטית ומורפולוגיה המבוססת על מיקום IHC, יש צורך לזהות במדויק את הגבול של גוף ה-it (למשל, באמצעות כתמים רירן VIIa) ולבצע מסוים עיבוד תמונה שלבים²⁶ . באמצעות שיטות כאלה, מחקרים קודמים אישרו כי אובדן הסינפטית הוא גדול יותר על הצד מודיעין של IHC מאשר בצד העמוד של מודלים בעלי חיים של ניוון רעש המושרה²⁶.

מחקרים קודמים הוכיחו כי נמוך הקצב הספונטנית סיבים, גבוה-הסף רגישים יותר נזק לרעש מאשר בקצב ספונטני גבוה, סיבים נמוכים במודלים של בעלי חיים מוגבלים synaptopathy^26,30. מחקרים אלה מספקים את הרציונל עבור שימוש הגברה suprathreshold של גל ABR (נמדד באמצעות גירוי בינוני עד גבוה ברמה גבוהה) כדי להעריך את תפקוד הסינפטיות במודלים בעלי חיים עם סף ABR נורמלי מוצר עיוות מכפלה אקוסטית פליטה ( DPOAEs). מכיוון שהגל העצמי של ABR משקף את התגובות העצביות מסוכם של סיבי עצב השמיעה, כאשר synaptopathy מוערך דרך גל ABR אני משרעת, בדיקות DPOAE צריך גם להתבצע כדי להוציא נזק OHC, אשר גם יכול להפחית המוני ABR המוני בשל הפרעה של התמרה חשמלית מכניזציה. למרות הגל הראשון של הפוטנציאל פעולה מורכבים (CAP), אשר נמדד מאלקטרודות חלון עגול, מייצג גם פעילות מסוכם של עצב שבלול, שיטה זו היא פולשנית יותר ומורכב יותר מאשר ABR מדידות. אם התגובות DPOAE לחזור נורמלי לאחר הסף הזמני משמרות רעש חשופים עכברים³¹ או שהם עדיין לא הידרדר עכברים הזדקנות²⁹, משרעת suprathreshold של גל abr אני יכול מאוד לנבא את מידת synaptopathy שבלול , מאז הנוירונים מושפעים מושתקים כאשר הקשרים שלהם סינפטית שלהם התקשרויות IHCs מושבש. עם זאת, אם רגישות שבלול מופחת בשל גורמים שונים (למשל, בתפקוד OHC), פוחתת בגל ABR אני משרעת לא ניתן עוד לייחס רק לאובדן סינפטית משום שהם ישקפו את השילוב של כל נזק שבלול. לכן, תנאים ניסיוניים מבוקרת עבור הכנה מודל synaptopathy מוגבל נדרשים כדי להבטיח רגישות שבלול לא נפרץ על ידי גורמים אחרים. למרבה הצער, למרות גל ABR אני משרעת מספק מידה אובייקטיבית של הפסד סיבים עצביים השמיעה בבעלי חיים, קשה למדוד אצל בני אדם. יתר על כן, פתווגיות מעורבות מעורבים synaptopathy, אובדן של תאי שיער, ונוכחות של חריגות אחרות שבלול עשוי להופיע בבני אדם, הגבלת השימוש של גל ABR אני משרעת מדידות הגדרות קליניות. השהיית גל ABR מחושב כזמן באלפיות השניה מתחילת הגירוי לשיא חיובי של כל גל, מתן תובנה לתוך זמני השידור לאורך מסלול השמיעה. אין שינויים משמעותיים גל אני ההשהיה נצפו במודלים העכבר של רעש המושרה או הקשורות לגיל synaptopathy³⁶שבלול. עם זאת, כמה ראיות עולה כי ההשפעות של רעש מיסוך על ההשהיה ABR V גל יכול לשמש כדי לאבחן synaptopathy שבלול בבני אדם³⁷.

מספר מחקרים שנעשו לאחרונה תמכו הרעיון כי synaptopathy שבלול הוא האירוע הראשוני העיקרי הקשורים לאובדן שמיעה נסתר, טינטון, ו hyperacusis. למרות המושג של synaptopathy שבלול במחלות האוזן הפנימית הוקמה כעת היטב, השפעתה המפורטת על יכולת השמיעה נשאר ידוע. הפרוטוקול המוצג במחקר הנוכחי מאפשר את החקירה של מורפולוגיה ותפקוד של הסינפסות בסרט שבלול בתוך אזור תדר ספציפי. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור synaptopathy שבלול, המנגנונים הבסיסיים שלה, ואת היעילות של התערבויות טיפוליות פוטנציאליות בדגמים שונים של בעלי חיים ניסיוניים.

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81770997, 81771016, 81830030); פרויקט המימון המשותף של קרן בייג למדעי הטבע וועדת החינוך של בייג (KZ201810025040); הקרן למדעי הטבע של בייג (7174291); ואת הקרן למדע פוסט-דוקטורט (2016M601067).