Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften und des Funktionellen Status von Bandsynapsen bei normalen Mäusen. Das vorliegende Modell eignet sich auch für lärminduzierte und altersbedingte Cochlea-Synaptopathie-eingeschränkte Modelle. Die korrelativen Ergebnisse früherer Mausstudien werden ebenfalls diskutiert.

Cochlea-Innenhaarzellen (IHCs) übertragen akustische Signale über Bandsynapsen an Spiralganglionneuronen (SGNs). Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass Haarzellsynapsen die ersten Ziele bei sensorineuralem Hörverlust (SNHL) sein können. Solche Studien haben das Konzept der Cochlea "Synaptopathie" vorgeschlagen, die sich auf Veränderungen der Bandsynapse Zahl, Struktur oder Funktion, die in abnormale synaptische Übertragung zwischen IHCs und SGNs führen bezieht. Während Cochlea-Synaptopathie irreversibel ist, wirkt sie sich nicht auf die Hörschwelle aus. In lärminduzierten Versuchsmodellen wird eine eingeschränkte Schädigung von IHC-Synapsen in ausgewählten Frequenzregionen eingesetzt, um die Umweltfaktoren zu identifizieren, die speziell Synaptopathie verursachen, sowie die physiologischen Folgen der Störung dieses Innenohrs. bahn. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Morphologie und Funktion der Cochlea-Synaptik bei erwachsenen Mäusen vor. In diesem Protokoll wird die Cochlea-Lokalisierung bestimmter Frequenzregionen mittels Ortsfrequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten durchgeführt, woraufhin die morphologischen Eigenschaften von Bandsynapsen mittels synaptischer Immunostaining. Der Funktionelle Status von Bandsynapsen wird dann auf der Grundlage der Amplituden der auditiven Brainstem Response (ABR) Welle I bestimmt. Der vorliegende Bericht zeigt, dass dieser Ansatz genutzt werden kann, um unser Verständnis der Pathogenese und Mechanismen der synaptischen Dysfunktion in der Cochlea zu vertiefen, die bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen helfen können.

Frequenzen im Bereich von ca. 20bis220.000 Hz können vom Menschen als akustische Reize wahrgenommen werden. Das menschliche Gehör ist normalerweise am empfindlichsten in der Nähe von 1.000 Hz, wobei der durchschnittliche Schalldruckpegel bei jungen Erwachsenen bei 20 Pa liegt (d. h. 0 Dezibel Schalldruckpegel [dB SPL]). Unter bestimmten pathologischen Bedingungen ist der Hörverlust auf bestimmte Frequenzen beschränkt. Beispielsweise kann in den frühen Stadien des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) eine "Notch" (d. h. eine Höhe des Hörschwellenwerts) im Audiogramm bei 4 kHz¹beobachtet werden. Entlang der Cochlea-Partition des Säugetiers erzeugen ihre Abstufungen von Steifigkeit und Masse eine exponentielle Frequenzkarte mit hochfrequenter Schallerkennung an der Basis der Cochlea und Niederfrequenz-Detektion an der Spitze². Tatsächlich gibt es entlang der Basilarmembran eine Cochlea-Ortsfrequenzkarte, die zu der so genannten tonotopischen Organisation^2,3führt. Jeder angegebene Platz auf der Basilarmembran hat die höchste Empfindlichkeit gegenüber nur einer bestimmten Schallfrequenz, die in der Regel als charakteristische Frequenz^3,4bezeichnet wird, obwohl auch Reaktionen auf andere Frequenzen beobachtet werden können.

Bis heute wurden verschiedene Mausmodelle verwendet, um die normale Funktion, pathologische Prozesse und die therapeutische Wirksamkeit im Hörsystem zu untersuchen. Die genaue Kenntnis physiologischer Parameter in der Mauscochlea ist Voraussetzung für solche Studien zum Hörverlust. Die Maus-Cochlea ist anatomisch in apikale, mittlere und basale Drehungen unterteilt, die unterschiedlichen Frequenzbereichen entsprechen. Durch die Kennzeichnung von auditiven Nervenaffeen am Cochlea-Kern zur Analyse der entsprechenden peripheren Innervationsstellen in der Cochlea gelang es Müller et al. die Erstellung der Cochlea-Ortsfrequenzkarte in der normalen Maus in vivo⁵. Im Intervall von 7,2–61,8 kHz, was Positionen zwischen 90% und 10% der gesamten Länge der Basilarmembran entspricht, kann die Maus-Cochlea-Ortfrequenzkarte durch eine einfache lineare Regressionsfunktion beschrieben werden, was auf eine Beziehung zwischen normalisierter Abstand von der Cochlea-Basis und dem Logarithmus der Charakteristischen Frequenz⁵. Bei Labormäusen kann die Ortsfrequenzkarte verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen Hörschwellen innerhalb bestimmter Frequenzbereiche und Cochleogrammen zu untersuchen, die die Anzahl fehlender Haarzellen in relativen Regionen entlang der Basilarmembran⁶zeigen. Wichtig ist, dass die Ortsfrequenzkarte ein Positionierungssystem für die Untersuchung minimaler struktureller Schäden bietet, wie z. B. Schäden an den Bandsynapsen von Haarzellen an bestimmten Cochlea-Frequenzorten bei Mäusen mit peripherem Hörtrauma^{7 ,8}.

In der Säugetier-Cochlea bestehen Bandsynapsen aus einem präsynaptischen Band, einer elektronendichten Projektion, die einen Halo von freilos reifen synaptischen Vesikeln, die Glutamat im IHC enthalten, und einer postsynaptischen Dichte am Nerventerminal des SGN mit Glutamatrezeptoren⁹. Bei der Cochlea-Schalltransduktion führt die Ablenkung des Haarzellbündels zu einer IHC-Depolarisation, die zu einer Glutamatfreisetzung von IHCs auf die postsynaptischen affetischen Klemmen führt und so den Gehörweg aktiviert. Die Aktivierung dieses Weges führt zur Umwandlung schallinduzierter mechanischer Signale in einen Ratencode in der SGN¹⁰. Tatsächlich ist die IHC-Bandsynapse hochspezialisiert für unermüdliche Schallübertragung mit Raten von Hunderten von Hertz mit hoher zeitlicher Präzision und ist von entscheidender Bedeutung für präsynaptische Mechanismen der Klangcodierung. Frühere Studien haben gezeigt, dass Bandsynapsen stark in Größe und Anzahl in verschiedenen Frequenzregionen in der erwachsenen Maus Cochlea^11,12, wahrscheinlich reflektieren strukturelle Anpassung an die besondere Klangkodierung für Überlebensbedürfnisse. In jüngster Zeit haben experimentelle Tierstudien gezeigt, dass die Cochlea-Synaptopathie zu mehreren Formen von Hörstörungen beiträgt, einschließlich lärmbedingter Hörverluste, altersbedingter Hörverlust und erblichem Hörverlust^{13, 14}. So wurden Methoden zur Identifizierung korrelierter Veränderungen der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in bestimmten Frequenzregionen zunehmend in Studien zur auditiven Entwicklung und Der Inneren Ohrenkrankheit eingesetzt, indem Modelle verwendet wurden, die über experimentelle Manipulation von genetischen oder Umweltvariablen^15,16,17.

Im aktuellen Bericht stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in einem bestimmten Frequenzbereich der Basilarmembran bei erwachsenen Mäusen vor. Die Cochlea-Frequenzlokalisierung wird mit einer bestimmten Orts-Frequenz-Karte in Kombination mit einem Cochleogramm durchgeführt. Die normalen morphologischen Eigenschaften von Cochlea-Band-Synapsen werden mittels präsynaptischer und postsynaptischer Immunostainierung bewertet. Der Funktionszustand von Cochlea-Band-Synapsen wird anhand der suprathresholdamplituden der ABR-Welle I bestimmt. Bei geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll verwendet werden, um physiologische oder pathologische Bedingungen in anderen Tiermodellen, einschließlich Ratten, Meerschweinchen und Keimen, zu untersuchen.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NRC/ILAR Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage) durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Capital Medical University, Peking, China, genehmigt.

1. Tierauswahl

1. Für alle Experimente verwenden Sie erwachsene C57BL/6J männliche Mäuse (8 Wochen alt) als Tiermodell.
   HINWEIS: C57BL/6J-Mäuse, die eine Spleißvariante des Cdh23 tragen, zeigen eine beschleunigte Seneszenz im Hörsystem, die sich als 40%iger Verlust von Bandsynapsen an der Basaldrehung der Cochlea und einen Verlust von 10% in der mittleren Drehung um 6 Monate widerspiegelt, gefolgt von einem Zunahme dieses Verlustes in der gesamtenCochlea mit 18^Jahren,19. Daher raten wir zur Vorsicht bei der Verwendung von C57BL/6J Mäusen, die älter als 6 Monate für die auditive Forschung sind. Andere Stämme von Mäusen können je nach spezifischen experimentellen Zielen verwendet werden.
2. Untersuchen Sie die Mäuse mit einem professionellen diagnostischen Taschentooskop, um Äußere oder Mittelohrpathologien vor Höruntersuchungen auszuschließen. Mögliche Anzeichen können Flüssigkeit oder Eiter im äußeren Gehörgang, Rötung und Schwellung im lokalen Gewebe und tympanische Membranperforation sein.
   HINWEIS: Obwohl dies selten anzutreffen ist, sollten Mäuse mit Außen- oder Mittelohrerkrankungen ausgeschlossen werden, sobald sie identifiziert wurden.

2. Anhörungsprüfung

1. Anästhesisieren Von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion eines Gemischs aus Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg) und Xylazinhydrochlorid (10 mg/kg). Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie über schmerzhafte Reize (z.B. Zehen-Pinch-Reflex).
   HINWEIS: Wenn der Zehen-Pinch-Reflex vollständig fehlt, hat das Tier eine ausreichende Tiefe der Anästhesie für auditive Tests erreicht. Wenn mehr Zeit für bilaterale ABR-Aufnahmen benötigt wird, verabreichen Sie eine niedrigere Dosierung (ein Fünftel der ursprünglichen Dosierung) von Anästhetika, um die ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen. Achten Sie darauf, eine Anästhesie-Überdosierung zu vermeiden, da dies bei Mäusen zum Tod führen kann.
2. Halten Sie die Körpertemperatur des anästhesierten Tieres bei 37,5 °C mit einem thermoregulierenden Heizkissen. Legen Sie das anästhesierte Tier in einen elektrisch und akustisch abgeschirmten Raum, um Störungen während des gesamten Hörtestes zu vermeiden.
   HINWEIS: Halten Sie die physiologische Temperatur während des gesamten Eingriffs aufrecht, bis das Tier vollständig wach ist, um den Tod durch Unterkühlung nach der Anästhesie zu verhindern.
3. Subdermalen Nadelelektroden (20 mm, 28 G) am Scheitelpunkt des Schädels (Aufnahmeelektrode), im ipsilateralen Ohrspeicheldrüsenbereich unterhalb der Pinna des gemessenen Ohrs (Referenzelektrode) und im kontralateralen Ohrspeicheldrüsenbereich (Bodenelektrode) mit einer Tiefe von 3 mm unter der Haut des Mauskopfes, bzw.²⁰.
4. Verwenden Sie einen geschlossenen Lautsprecher, um eine akustische Stimulation über ein 2 cm großes Kunststoffrohr mit einer kegelförmigen Spitze durchzuführen. Die Spitze in den äußeren Gehörgang²¹einbauen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die elektrische Impedanz in den Aufnahme- und Referenzelektroden weniger als 3 kOhm (normalerweise 1 kOhm) beträgt. Wenn die Impedanz hoch ist, ändern Sie die Einfügestelle der Elektrode, reinigen Sie die Elektrode mit Alkohol oder ersetzen Sie die Elektrode, um Veränderungen in der ABR-Wellenamplitude zu vermeiden.
5. Erzeugen Sie für ABR-Aufnahmen Tonpips (3 ms Dauer, 1 ms Anstiegs-/Fallzeiten, mit einer Geschwindigkeit von 21,1/s, Frequenz: 4–48 kHz) und präsentieren Sie sie bei abnehmenden SPLs von 90 bis 10 dB in 5-u201210 dB SPL-Schritten²⁰. Während dieses Schritts werden die Antworten verstärkt (10.000 Mal), gefiltert (0,1–3 kHz) und gemittelt (1.024 Proben/Stimuluslevel).
   HINWEIS: ABRs werden für jede Stimulusstufe in 10 dB-Schritten gesammelt, mit zusätzlichen 5 dB-Schritten in der Nähe des Schwellenwerts.
6. Bestimmen Sie bei jeder Frequenz den ABR-Schwellenwert, der sich auf die minimale SPL bezieht, was zu einer zuverlässigen ABR-Aufzeichnung mit einer oder mehreren unterscheidbaren Wellen führt, die durch visuelle Inspektion eindeutig identifiziert werden können (Abbildung 1).
   HINWEIS: In der Regel ist es notwendig, den Prozess für niedrige SPLs um den Schwellenwert herum zu wiederholen, um die Konsistenz der Wellenformen zu gewährleisten. Die Ansprechschwelle ist die niedrigste Stimulusstufe, bei der die Wellenform beobachtet werden kann, wenn eine Abnahme von 5 dB zum Verschwinden der Wellenform führen würde.

3. Cochlea-Gewebeverarbeitung

1. Nach abR-Aufnahme, einschläfern die anästhesierten Mäuse durch Zervixdislokation, enthaupten sie, entblößen die Bulla von der ventralen Seite, und öffnen Sie mit scharfen Scheren, um Zugang zur Cochlea zu erhalten.
2. Entfernen Sie mit einer feinen Zange die zeitlichen Knochen, trennen Sie die Schlagmittelarterie, entfernen Sie die Bänder aus dem ovalen Fenster und brechen Sie die runde Fenstermembran. Machen Sie ein kleines Loch an der Spitze der Cochlea, indem Sie die Spitze einer Nadel (13 mm, 27 G) sanft drehen.
3. Fixieren Sie die isolierten Knochen mit 4% (wt/vol) Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) über Nacht bei 4 °C. Mit einer feingekippten Pipette sanft fixieren durch die perilymphatischen Räume durch die Auftragen auf die ovalen oder runden Fenster (als Einlass) und die Öffnung an der Spitze (als Auslass).
   HINWEIS: Einige Proteine benötigen eine kurze Fixierungsdauer, um die Zerstörung ihrer Epitope für die Immunkennzeichnung zu vermeiden. In solchen Fällen, inkubieren Knochen in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) für 2 h, abhängig von den Anweisungen des Herstellers für Immunhistochemie. Die Fixierung kann auch über Herzperfusion durchgeführt werden, um das Cochlea-Blut zu entfernen, um Hintergrundgeräusche aufgrund unspezifischer Färbung in späteren Stadien zu vermeiden, insbesondere in Mausmodellen der Cochlea-Synaptopathie.
4. Spülen Sie die Knochen dreimal für 5 min mit 0,1 M kaltem PBS, um Restparaformaldehyd zu entfernen. Entkalkung der Knochen mit 10% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) entweder bei RT für 4 h oder bei 4 °C für 24 h durch sanftes Schütteln in einem horizontalen Shaker bei 20 Umdrehungen pro Minute. EDTA kann auf halbem Weg aktualisiert werden.
   HINWEIS: Die Entkalkungszeiten unterliegen der Konzentration von EDTA und den Vorlieben der Nutzer. Entkalktes Gewebe sollte ein gewisses Maß an Zähigkeit beibehalten, was die Manipulation der Isolierung von Cochlea-Vollteilen in späteren Schritten erleichtert. Temporale Knochen können in 10% EDTA mit Rotation entkalkt werden, so dass Forscher das Labor nach ABR-Tests und Fixierungsexperimenten verlassen können. Die Entkalkungszeit ist flexibel im Bereich von 20 bis 30 h bei 4 °C.
5. Übertragen Sie einen entkalkten Temporalknochen von EDTA auf 0,1 M PBS. Verwenden Sie #3, #5 Dumont Zange und die 27 G Nadel, um die apikalen, mittleren und basalen Cochlea-Regionen nacheinander zu sezieren und dann die Cochlea aus dem Knochen unter einem Stereo-Sektionsmikroskop zu sezieren (wie zuvor beschrieben²²). Machen Sie eine Reihe von kleinen Schnitten entlang des Spiralbandes mit einer Rasierklinge, und entfernen Sie die tektoriale Membran und Reissners Membran (Abbildung 2).
   HINWEIS: Solange die sezierte Cochlea intakt ist, kann dieser Prozess entsprechend dem üblichen Protokoll des einzelnen Bedieners modifiziert werden.
6. Weitere sezieren sie das verbleibende auditive Epithel einschließlich des spiralförmigen Limbus in einzelne Cochlea-Drehungen (Apex, Mitte und Basis mit Hakenbereich) für Vollmontagepräparate.
7. Messen Sie unter einem 40-fachen Ölobjektiv eines Lichtmikroskops die Basilarmembranlänge mit einer Skala von 250 m im Okular, die entlang der Stereocilia der IHCs eingestellt werden kann.
8. Berechnen Sie die Länge jeder Cochlea-Drehung, indem Sie alle Segmentlängen (250 m pro Segment) hinzufügen, und erhalten Sie gleichzeitig die Gesamtlänge der Basilarmembran, indem Sie die Längen jedes Zuges summieren.
9. Konvertieren Sie die Gesamtlänge der Basilarmembran einschließlich der Hakenregion in einen Prozentsatz basierend auf dem Abstand von der Cochlea-Spitze (0% bezieht sich auf die Cochlea-Spitze, 100% auf die Cochlea-Basis).
10. Konvertieren Sie diesen Abstand in die Cochlea-Kennfrequenz mit einer logarithmischen Funktion (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 x log(f), mit einer Neigung von 1,25 mm/Oktave der Frequenz, wobei d der normalisierte Abstand vom Cochlea-Apex in Prozent ist, f ist Frequenz in kHz), wie zuvor beschrieben^5,6. So kann ein Frequenzbereich in einem entsprechenden Bereich der Basilarmembran an jeder Cochlea-Drehung erfasst werden.

4. Immunfluoreszenz Färbung

1. Nach der Zerlegung jede Cochlea-Drehung in ein separates 2,5 ml Zentrifugenrohr legen und Cochlea-Drehungen in 10% Ziegenserum/PBS/0,1% Triton X-100 für 1 h bei RT auf einem Rotator inkubieren.
2. Entfernen Sie die oben genannte Blockier-/Permeabilisierungslösung aus jedem Rohr mit einer 200-L-Pipettenspitze unter einem Seziermikroskop und inkubieren Sie die Proben mit primär in 5% Ziegenserum/PBS/0,1% Triton X-100 über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator verdünnten Primärantikörpern.
   HINWEIS: Für die Immunolabeling von Cochlea-Synaptikbändern verwenden Sie die präsynaptische Markermaus Anti-Carboxyl-Terminal-Bindungsprotein 2 IgG1 (CtBP2, Kennzeichnung der B-Domäne des RIBEYE Gerüstproteins, 1:400) und den postsynaptischen Marker-Maus-Antiglutamatrezeptor 2 IgG2a (GluR2, Beschriftung einer Untereinheit des AMPA-Rezeptors, 1:200)²³.
3. Spülen Sie dreimal für 5 min mit 0,1 M kaltem PBS, um die verbleibenden primären Antikörper zu entfernen und die Proben mit sekundären Antikörpern zu bebrüten, die in 5% Ziegenserum/PBS/0,1% Triton X-100 bei RT für 2-u20123 h in Dunkelheit auf einem Rotator verdünnt werden.
   HINWEIS: Bereiten Sie geeignete sekundäre Antikörpermischungen mit Ziegenanti-Maus Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) und Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 4.2 verwendet. Um die Etikettiereffizienz für synaptische Bänder zu verbessern, empfehlen wir die Auswahl spezifischer sekundärer Antikörper. Einige Labore erweitern die Inkubation mit sekundären Antikörpern, um die GluR2-Immunkennzeichnung zu erhöhen²⁴.
4. Spülen Sie dreimal für 5 min mit 0,1 M PBS, um sekundäre Restantikörper zu entfernen und die Proben von 2,5 ml Zentrifugenrohren auf 35-mm-Platten mit 0,1 M PBS zu übertragen.
5. Legen Sie einen Tropfen Desonstfolge mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) auf das Dia und übertragen Sie die Proben von PBS auf das Montagemedium. Legen Sie eine Kante eines Deckelslips auf die Rutsche und lassen Sie sie los, damit der Deckelrutsch sanft fällt.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Haarzellen nach oben zeigen und während des Eingriffs keine Faltung oder Verdrehung von Cochlea-Proben erfolgt, montieren Sie Cochlea-Proben unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop.
6. Legen Sie die Dias über Nacht bei 4 °C in eine Diabox, um die Dias trocknen zu lassen und dann unter einem laserkonfokalen Mikroskop abzubilden.

5. Morphologische Bewertung von Cochlea-Band-Synapsen

1. Bilddiaglyse mit einem konfokalen Mikroskop mit drei Lasern – einer 405 nm UV-Diode, einem 488 nm Argonlaser und einem 561 nm Dioden-gepumpten Festkörperlaser (DPSS) zur Anregung von DAPI (Erregungsspektrum 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (Erregungsspektrum 496–549 nm) und Alexa Fluor 568 (Erregungsspektrum 573–631 nm).
2. Erwerben Sie konfokale Z-Stacks über eine Entfernung von 8 m von jeder Cochlea-Drehung mit einer 63-fachhochauflösenden Öl-Tauchlinse.
   HINWEIS: Nach der Definition sollten alle Parameter für die Digitalisierung von Photomikroskopen gespeichert und gleichmäßig auf alle Folien angewendet werden.
3. Legen Sie für die Anzahl der synaptischen Punktzeichen die Z-Stacks (0,3 m Schrittgröße) so fest, dass sie die gesamte Länge der IHCs überspannen, um sicherzustellen, dass alle synaptischen Punktzeichen abgebildet werden können.
4. Führen Sie die Bilder, die Punktzeichen enthalten, in einem Z-Stack zusammen, um die Z-Achsen-Projektion zu erhalten, und importieren Sie sie in die Bildverarbeitungssoftware.
5. Teilen Sie die synaptischen Gesamtanzahl in jedem Z-Stack in bestimmten Frequenzbereichen durch die Anzahl der IHCs (gleich der DAPI-Kernmanuellanzahl), um die Anzahl der synaptischen Punktzeichen für jeden IHC zu berechnen. In jedem bestimmten Frequenzbereich durchschnittlich alle synaptischen Punktzeichen in drei Bildern verschiedener mikroskopischer Felder, die 9–11 IHCs enthalten.
   1. Beschreiben Sie die Interessenregion (ROIs), einschließlich der basolateralen Regionen jedes IHC, indem Sie die Freihandauswahl-Schaltfläche verwenden. Verwenden Sie die Messfunktion für die automatische Quantifizierung von Punktzeichen und die Wasserscheidefunktion, um zwischen eng angrenzenden Stellen zu unterscheiden.
   2. Führen Sie nach jeder automatisierten Zählung visuelle Inspektionen mit manuellen Korrekturen durch, um die Pünktlichkeitszählung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Experimentatoren sollten geblendet bleiben, ob die Rutsche von der Spitze, der Mitte oder der Basaldrehung der Cochlea stammt.
6. Bewerten Sie die synaptische Struktur und Verteilung visuell, um einzelne IHCs mit dem Bleistiftwerkzeug (M) manuell von ihren Nachbarn zu isolieren, um die zytoskelettale Architektur und die synaptische Lokalisierung besser zu visualisieren.
7. Um die Gegenüberstellung von präsynaptischen Bändern (CtBP2) und postsynaptischen Rezeptor-Patches (GluR2) zu untersuchen, extrahieren Sie den Voxel-Raum um band durch das Rechteckige Marquee-Tool und isolieren Sie einzelne Band von Crop. Durch Klicken auf Bild > Bildgröße,erwerben Sie ein Thumbnail-Array dieser Miniaturprojektionen, die dann verwendet werden können, um gepaarte Synapsen (erscheint als eng nebeneinander ierte Paare von CtBP2-positive und GluR2-positive Punktias) im Vergleich zu verwaisten Bänder (fehlende postsynaptische Glutamatrezeptor-Pflaster) (Abbildung 3).
   HINWEIS: Normale Cochlea-Synapsen erscheinen als kombinierte Immunlabelierung des präsynaptischen Bandes innerhalb der Haarzelle (Anti-CtBP2) und des postsynaptischen Glutamatrezeptor-Patches am Hörnerv -Terminal (Anti-GluR2)²⁵. Einige Labore verwenden konfokale Projektionen in Verbindung mit 3D-Modellierung, um synaptische Patchgröße oder Volumen^26,27zu quantifizieren. Vor dem signifikanten Verlust von Band synapsen, Bänder mit Änderungen in der Größe oder ohne gepaarte Glutamat-Rezeptor-Patches sind wahrscheinlich Anzeichen für synaptische Dysfunktion^27,28.

6. Funktionelle Bewertung von Cochlea-Band Synapsen

1. Sammeln Sie alle ABR-Wellen für jeden Frequenzreiz, der bei einer SPL von 90 dB für die Analyse suprathresholdr ABR-Welle-I-Amplituden dargestellt wird.
   HINWEIS: Neurophysiologische und morphologische Studien haben gezeigt, dass niedrige spontane, hochschwellige Fasern besonders anfällig für Alterung und Lärmexposition sind^29,30. Obwohl der einfache Verlust von Bandsynapsen die ABR-Schwellenwerte nicht beeinflussen kann, führt er häufig zu signifikanten Reduktionen der ABR-Welle-I-Amplituden, da diese Afferents einschließlich niedriger spontaner, hochschwelliger Fasern und hoher spontaner niedrigschwellige Fasern tragen stark zu den summierten Aktivitäten der Cochlea-Nervenfasern^28,29,31bei. Hier wird eine suprathreshold Intensität von 90 dB SPL ausgewählt.
2. Bestimmen Sie die Amplitude von Peak-to-Peak I mithilfe eines Offline-Analyseprogramms (Abbildung 4). Jede Welle I im ABR-Test besteht aus einer beginnenden positiven (p) Verformung und der anschließenden negativen (n) Verformung. ABR-Welle I Amplitude ist definiert als die Spannungsdifferenz zwischen Ip (der positive Spitze der Welle I) und In (der negative Peak der Welle I)²⁹.
   HINWEIS: Unter pathologischen Bedingungen kann die Cochlea-Synaptopathie auf der Grundlage der suprathresholdamplituden der ABR-Welle I bestimmt werden, die die summierten Beginnreaktionen von SGNs widerspiegeln, die durch den Klang evoziert werden. Jedoch, Cochlea-Empfindlichkeit, die nicht durch OHC Dysfunktion beeinträchtigt wird, ist eine Voraussetzung für diese Methode.

ABR-Hörtests wurden an 10 C57BL/6J-Mäusen (8 Wochen alt) unter Anästhesie durchgeführt. ABRs wurden mit Tonburstreizen bei 4, 8, 16, 32 und 48 kHz ausgelöst. Die Hörschwelle jedes Tieres wurde visuell durch die Unterscheidung von mindestens einer klaren Wellenform im ABR festgestellt. Alle Mäuse wiesen ABR-Schwellenwerte als Reaktion auf Tonausbrüche auf, die je nach Frequenz des Stimulus zwischen 25 und 70 dB SPL lagen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hörschwelle mit 16 kHz am niedrigsten war (Abbildung 1), was einem Abstand von ca. 43 % zum Cochlea-Spitzenwert entspricht (Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass die akustische Empfindlichkeit in anderen Cochlea-Betrieben signifikant reduziert wird. Regionen.

Cochlea-Vollmontage wurden von zeitlichen Knochen bei erwachsenen Mäusen unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop isoliert (Abbildung 2A). Ganze Halterungen des auditiven Epithels wurden in drei Teile zerlegt, deren Längen gemessen und schließlich in prozentuale Entfernung von der Cochlea-Spitze umgewandelt wurden. Die Frequenzposition auf der Basilarmembran jeder Cochlea-Drehung wurde mit einer logarithmischen Funktion berechnet, wie zuvor beschrieben^5,6 (Abbildung 2B).

Zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften von Cochlea-Band-Synapsen wurden Antikörper gegen CtBP2 bzw. GluR2 verwendet, um präsynaptische bzw. postsynaptische Strukturen zu kennzeichnen. In normalen Ohren erwachsener Mäuse ergab die Immunfärbung nebeneinander einander nebeneinander folgende Paare von synaptischen Bändern und Glutamatrezeptor-Pflastern, die die Oberfläche der basolateralen Membran von IHCs mit 8–20 Paaren pro IHC szenierten (Abbildung 3A). Obwohl die überwiegende Mehrheit der Punktzeichen als nebeneinander stehende Paare in normalen Ohren erschien, konnten verwaiste Bänder selten bei hoher Vergrößerung beobachtet werden (Abbildung 3B). Die Anzahl der IHC-Bandsynapsen (immunpositive Flecken für CtBP2 und GluR2) war im 16-kHz-Bereich am höchsten und nahm mit zunehmender Entfernung von diesem Standort signifikant ab (Abbildung 3C). Die synaptischen Zählungen, die auf der Grundlage konfokaler Projektionen ermittelt werden, liefern eine Schätzung der maximalen Anzahl von auditiven Nervenfasern, die Informationen von der Cochlea an das Gehirn übertragen²⁹.

Der funktionelle Status von Cochlea-Band-Synapsen wurde bei allen erwachsenen Mäusen auf Basis von ABR-Welle-I-Amplituden untersucht, die Informationen über die funktionelle Integrität der auditiven Nervenfasern^29,31liefern. ABR-Welle I Amplituden bei jeder Frequenz des Stimulus, die bei einem Schalldruckpegel von 90 dB dargestellt werden, wurden von der Spitze bis zum folgenden Trog gemessen, wie in Abbildung 4Adargestellt. Die AMPlitude der ABR-Welle I war mit einer Frequenz von 16 kHz am höchsten, was der niedrigsten Hörschwelle entspricht, und die Amplitudenwerte verringerten sich signifikant, als der Abstand von dieser Position zunahm (Abbildung 4B). Dieses Ergebnis stimmt mit den beobachteten Veränderungen in band-Synapsen-Zahlen, was darauf hindeutet, dass Synapsen innerhalb dieser Cochlea-Region die lebendigste synaptische Funktion aufweisen können. Darüber hinaus verringerten sich in früheren Mausstudien zur lärminduzierten und altersbedingten Cochlea-Neurodegeneration suprathreshold Amplituden der ABR-Welle I im Verhältnis zum Bandverlust, was darauf hindeutet, dass die AMPlitude der ABR-Welle I in hohem Maße mit dem Grad der Cochlea-Synaptopathie^29,31.

Abbildung 1 : Anhörungsprüfung. ABR-Schwellenvergleiche zwischen verschiedenen Frequenzen von Ton-Burst-Stimuli zeigten, dass die Hörschwelle bei 10 erwachsenen C57BL/6J-Mäusen mit 16 kHz am niedrigsten war. Die ABR-Antwort war in anderen Frequenzregionen signifikant erhöht (einwegige ANOVA mit Dunnetts Multiple-Vergleich-Post-hoc-Test; *: P < 0,01, n = 20 Ohren). Die Daten werden als mittelwertes SEM ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Cochlea-Frequenzlokalisierung bei Mäusen. (A) Ein repräsentatives Bild der voll explantierten Cochlea, die unter einem Stereo-Seziermikroskop aus dem temporalen Knochen seziert wurde. (B) Die Maus-Cochlea ist in apikale, mittlere und basale Drehungen unterteilt, wo die Cochlea-Seitenwand entfernt wird. Rote Kreise auf den Fragmenten der Cochlea-Basilarmembran zeigen die Frequenzpositionen und ihre entsprechenden normalisierten Positionen in der Cochlea an (0% bezieht sich auf die Cochlea-Spitze, 100% auf die Cochlea-Basis). Skalenbalken = 250 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Konfokale Analyse von Cochlea-Band Synapsen bei Mäusen. (A) Repräsentative Bilder von Bandsynapsen für die Regionen 4, 8, 16, 32 und 48 kHz, immunostainiert für präsynaptische Bänder (CtBP2, rot) und postsynaptische Strukturen (GluR2, grün). Weiße gestrichelte Linien werden verwendet, um innere Haarzellen als Referenz zu skizzieren. Skalenbalken = 10 m. (B) Hochleistungs-Miniaturansichten aus konfokalen Z-Stacks zeigen, dass diese Bandsynapsen als eng nebeneinander stehende Paare von CtBP2-positivem (rot) und GluR2-positivem (grünem) Puncta (links und mitte) erschienen, während verwaiste Bänder (rechts) ohne postsynaptische Glutamatrezeptor-Pflaster waren sehr selten. Skalenbalken = 0,5 m. (C) Die quantitative Analyse des gepaarten Bandpunkts mit allen präsynaptischen und postsynaptischen Elementen ergab, dass die Anzahl der synaptischen Punktuton pro inneren Haarzelle im 16-kHz-Bereich signifikant höher war als in anderen Frequenzregionen (einweg-ANOVA mit Dunnetts Mehrfachvergleich nach hoc-Test; *: P < 0,01, n=6 Ohren). Die Daten werden als mittelwertes SEM ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Analyse der ABR-Welle I Amplituden bei Mäusen . (A) Repräsentative ABR-Wellenform einer 8 Wochen alten C57BL/6J-Maus, die einem reinen Tonreiz von 16 kHz bei einer Intensität von 90 dB ausgesetzt ist (Stimulusbeginn bei 0 ms). Römische Ziffern markieren die Gipfel der ABR-Wellen. Gepunktete Linien markieren die Welle I Spitze und Trog, die die Amplitude anzeigt. (B) Quantitative Analyse der durchschnittlichen Wellen-I-Amplituden als Reaktion auf die 4, 8, 16, 32 und 48 kHz-Stimuli, die bei einem Schalldruckpegel von 90 dB dargestellt werden. ABR-Welle I Amplituden waren mit der Frequenz von 16 kHz am höchsten und bei anderen Frequenzen deutlich niedriger (einwegige ANOVA mit Dunnetts Multiple-Vergleich-Post-hoc-Test; *: P < 0,01, n = 20 Ohren). Die Daten werden als mittelwertes SEM ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Da die Cochlea-Synaptopathie erstmals bei erwachsenen Mäusen mit einer temporären Schwellenverschiebung (TTS) charakterisiert wurde, die durch 8-u201216 kHz Oktavbandrauschen bei 100 dB SPL für 2 h³¹induziert wurde, haben Forscher die Auswirkungen der Synaptopathie in verschiedenen Säugetiere, einschließlich Affen und Menschen^32,33. Neben der Lärmexposition wurden mehrere andere Erkrankungen mit cochlea-Synaptopathie in Verbindung gebracht (z. B. Alterung, Verwendung von ototoxischen Medikamenten und genetische Mutationen), was zu einer kurzfristigen Störung des suprathreshold Auditions führte, gefolgt von irreversiblen Degeneration des Hörnervs. In der frühen Phase der Cochlea-Beleidigung tritt Synaptopathie oft an einem bestimmten Frequenzort auf, insbesondere in experimentellen Modellen, bei denen Die Schädigung von IHC-Synapsen auf ausgewählte Frequenzbereiche^24,31beschränkt ist. Daher ist unser Protokoll insofern von Bedeutung, als es die Untersuchung der synaptischen Morphologie und -funktion in einem bestimmten Frequenzbereich ermöglicht.

Die Cochlea-Ortfrequenzkarte kann verwendet werden, um normale und abnormale Hörfunktionen zu unterscheiden, was den normalen und abnormalen Bereich im Innenohr weiter widerspiegelt. Seit Oberflächenvorbereitungstechniken zum ersten Mal verwendet wurden, um intakte und fehlende Haarzellen in den verschiedenen Cochlea-Drehungen zu zeichnen, ist das Cochleogramm zu einer Routinemethode zur Quantifizierung des Haarzellverlustes geworden⁶. Daher ist es sinnvoll, eine Ortsfrequenzkarte auf dem Cochleogramm aufzunehmen, um morphologische Beleidigungen in der Cochlea mit relevanten physiologischen Veränderungen zu korrelieren. Diese Methode ermöglicht es, die Anzahl und Struktur von Synapsen auf der Grundlage ihrer Positionen entlang der Cochlea-Basilarmembran in Bezug auf etablierte Cochlea-Ortfrequenzkarten zu bestimmen und so ausreichende Informationen für detaillierte Vergleiche bereitzustellen. zwischen histologischen und physiologischen Ergebnissen. Einige Studien bewerten jedoch die Synaptopathie auf der Grundlage des Cochlea-Segments oder der Entfernung entlang des Cochlea-Kanals, was keine direkten Vergleiche zwischen einzelnen Cochleae aufgrund von Intra-Arten-Variationen in der Basilarmembranlänge zulässt. Daher ist es besonders wichtig, das Cochleogramm zu standardisieren, indem einzelne Cochlea-Längen von Millimetern in einen relativen Prozentsatz umgewandelt werden.

Die Synaptopathie kann durch Visualisierung der Immunfärbung für CtBP2-Protein (das synaptische Isoform "Ribeye") in den basolateralen Regionen von IHCs bestätigt werden. Diese CtBP2-positiven Patches können als struktureller Marker für die Quantifizierung von präsynaptischen Bändern dienen, und das Vorhandensein von weniger Patches deutet in der Regel auf einen präsynaptischen Verlust hin. Obwohl frühere Studien berichtet haben, dass 98% der präsynaptischen Bänder mit postsynaptischen Klemmen im normalen Ohr³⁰gepaart sind, ist die einfache Anzahl der CtBP2-positiven Pflaster möglicherweise nicht genau für die quantitative Analyse vollständiger Synapsen, da dies kann zu einer Überschätzung der Synapsenzählungen im verletzten Ohr führen, indem "Waisen" (präsynaptische Bänder, die mit postsynaptischen Klemmen nicht gepaart sind) beteiligt sind. Um die Genauigkeit der Schätzung der Synapsenzahl zu verbessern, werden zusätzliche Antikörper gegen postsynaptische Strukturen wie GluA2, GluA2/3 oder PSD-95 verwendet. Das postsynaptische Dichteprotein PSD-95, ein membranassoziiertes Guanyatkinase (MAGUK) Gerüstprotein, kann mit einem Antikörper gegen PSD-95 gekennzeichnet werden, der meist an den Kontakten zwischen Haarzellen und SGN-Faserendungen³⁴beobachtet^{wird. 35}. Der Antikörper gegen GluR2 ist jedoch spezifischer für ionotrope Glutamatrezeptoren vom Typ AMPA in der postsynaptischen Membran, die Bandsynapsen (nebeneinanderanlegte Paare von immunfluoreszierenden Punktzeichen des präsynaptischen CtBP2 und postsynaptische GluR2)¹⁵. Neben der morphologischen Analyse kann die histologische Analyse vollständiger Synapsen als funktioneller Indikator für die Synaptopathie verwendet werden. Bei erwachsenen Mäusen mit Cochlea-Synaptopathie treten Reduktionen der ABR-Welle I Amplitude nach der Darstellung von mittel- bis hochgradigen Tonreizen bei Frequenzen auf, die tonotopisch mit Regionen mit synaptischem Verlust zusammenhängen^26,29. Die mit dieser Methode erhaltenen Synapsenzahlen sind insofern begrenzt, als es etwa 10 Minuten dauert, eine Stelle auf der Basilarmembran zu scannen. Um räumliche Variationen in synaptischer Anzahl und Morphologie anhand der IHC-Position zu bewerten, ist es außerdem notwendig, die Grenze des ICH-Körpers (z.B. über Myosin-VIIa-Färbung) genau zu identifizieren und bestimmte Bildverarbeitungsschritte durchzuführen²⁶ . Mit solchen Methoden haben frühere Studien bestätigt, dass der synaptische Verlust auf der modiolaeren Seite des IHC größer ist als auf der Säulenseite in Tiermodellen der lärminduzierten Degeneration²⁶.

Frühere Studien haben gezeigt, dass niedrige spontane, hochschwellige Fasern anfälliger für Lärmschäden sind als hochspontane, niedrigschwellige Fasern in Tiermodellen mit eingeschränkter Synaptopathie^26,30. Diese Studien liefern die Gründe für die Verwendung suprathresholdr Amplituden der ABR-Welle I (gemessen mit mittel- bis hohen Tonreizen) zur Beurteilung der synaptischen Funktion in Tiermodellen mit normaler ABR-Schwelle und Verzerrungsprodukt-Otoakustikemissionen ( DPOAEs). Da Welle I der ABR die summierten neuronalen Reaktionen von auditiven Nervenfasern widerspiegelt, sollten DPOAE-Tests durchgeführt werden, um OHC-Schäden auszuschließen, die auch ABR-Amplituden aufgrund der Störung der mechanoelektrische Transduktion. Obwohl die erste Welle des zusammengesetzten Wirkungspotentials (CAP), die anhand von Rundfensterelektroden gemessen wird, auch eine summierte Aktivität des Cochlea-Nervs darstellt, ist diese Methode invasiver und komplexer als ABR-Messungen. Wenn dPOAE-Antworten nach temporären Schwellenverschiebungen bei lärmexponierten Mäusen³¹ wieder normal werden oder sich bei alternden Mäusen noch nicht verschlechtert haben²⁹, kann die supraschwellige Amplitude der ABR-Welle I den Grad der Cochlea-Synaptopathie stark vorhersagen. , da betroffene Neuronen zum Schweigen gebracht werden, wenn ihre synaptischen Verbindungen zu IHCs gestört sind. Wenn jedoch die Cochlea-Empfindlichkeit aufgrund verschiedener Faktoren (z. B. OHC-Dysfunktion) reduziert wird, kann die Abnahme der AMPlitude der ABR-Welle I nicht mehr allein auf synaptischen Verlust zurückgeführt werden, da sie die Kombination aller Cochlea-Schäden widerspiegeln. Daher sind kontrollierte experimentelle Bedingungen für die Synaptopathie-beschränkte Modellvorbereitung erforderlich, um sicherzustellen, dass die Cochlea-Empfindlichkeit nicht durch andere Faktoren beeinträchtigt wird. Leider, obwohl ABR Welle I Amplitude bietet ein objektives Maß für auditive Nervenfaserverlust bei Tieren, ist es schwierig, beim Menschen zu messen. Darüber hinaus können gemischte Pathologien mit Synaptopathie, Verlust von Haarzellen und das Vorhandensein anderer Anomalien in der Cochlea beim Menschen auftreten, was die Verwendung von AMPlitudenmessungen der ABR-Welle I in klinischen Umgebungen einschränkt. Die ABR-Wellenlatenz wird als Die Zeit in Millisekunden vom Beginn des Stimulus bis zum positiven Höhepunkt jeder Welle berechnet und bietet Einen Einblick in die Übertragungszeiten entlang des Hörwegs. Keine signifikanten Veränderungen in der Wellen-I-Latenz wurden in Mausmodellen der lärminduzierten oder altersbedingten Cochlea-Synaptopathie³⁶beobachtet. Jedoch, einige Hinweise darauf, dass die Auswirkungen der Maskierung Von Lärm auf ABR Welle V Latenz kann verwendet werden, um Cochlea-Synaptopathie beim Menschen zu diagnostizieren³⁷.

Mehrere neuere Studien haben die Vorstellung unterstützt, dass Cochlea-Synaptopathie das primäre Anfangsereignis ist, das mit verstecktem Hörverlust, Tinnitus und Hyperakusis verbunden ist. Obwohl das Konzept der Cochlea-Synaptopathie bei Innenohrerkrankungen inzwischen fest etabliert ist, bleibt seine detaillierte Auswirkung auf die Hörfähigkeit unbekannt. Das in der aktuellen Studie vorgestellte Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Morphologie und Funktion in Cochlea-Band-Synapsen innerhalb eines bestimmten Frequenzbereichs. Somit kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Cochlea-Synaptopathie, ihre zugrunde liegenden Mechanismen und die Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Interventionen in verschiedenen experimentellen Tiermodellen zu untersuchen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030) unterstützt. das gemeinsame Förderprojekt der Beijing Natural Science Foundation und des Beijing Education Committee (KZ201810025040); der Beijing Natural Science Foundation (7174291); und der China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).