"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

למרות infectivity יוצא דופן של הנגיף הפטיטיס B (HBV) אין ויוו, שבו רק שלושה הגנום הנגיפי יכול לגרום כרוניות שימפנזות השפעול נגוע, ביותר במבחנה מודלים דורשים כמה מאות אלפי הגנום הנגיפי לכל תא סדר ליזום זיהום ארעית. בנוסף, תרבויות 2D סטטי hepatocytes אנושי ראשוני (PHH) מאפשרים רק לטווח קצר מחקרים עקב dedifferentiation המהירה שלהם. כאן, אנו מתארים 3D תרבויות הכבד-על-שבב של PHH, monocultures או cocultures עם שאר התאים בכבד תושב nonparenchymal. אלה מציעים שיפור משמעותי ללמוד זיהומים HBV לטווח ארוך עם התגובות התא המארח פיזיולוגיים. בנוסף בהנחיה התרופות היעילות לימודי ניתוח רעילות, חקירות פתוגנזה מערכות התרבות microfluidic אלה מאפשרים הערכת טיפולי ריפוי זיהום HBV שמטרתן חיסול covalently סגור, מעגלי (ccc) ה-DNA. זה הציג שיטה מתאר את הסידור של PHH monocultures, PHH/Kupffer תא תרבויות המשנה שלהם זיהום עם HBV מטוהרים, הניתוח של תגובות המארח. שיטה זו ישימה במיוחד על הערכת ההשפעות לטווח ארוך של זיהום, שילובי טיפול פתוגנזה ו HBV.

המחקר של HBV מסובך מאת הרגישות המסכן של מערכות התרבות, הדורשים כמה מאות אלפי עותקים הגנום HBV בכל תא ליזום את זיהום¹. יתר על כן, hepatocytes האדם העיקרי בדרך כלל חלשים במיוחד, במהירות dedifferentiate במהלך תרבויות קונבנציונאלי². זה בעיקר בשל העובדה כי משטחי פלסטיק שטוחה וקשה מחקה את סביבות חוץ-תאית טבעיים המצויים בכבד, חוסר חמצון של התרבויות בהיעדר זרימת microfluidic כללי. תרבויות hepatocyte סטטי המקובלת על צלחות מצופה קולגן במהירות dedifferentiate, מאבדים את הרגישות שלהם ל- HBV זיהום³. כאן, אנו מתארים את הקמה זיהום של PHH גדל בתרבויות הכבד-על-שבב 3D, אשר מהווים יתרון במידה רבה על-קונבנציונאלי 2D סטטי PHH תרבויות על צלחות מצופה קולגן בשל היכולת המורחבת שלהם מטבולית ופונקציונליים, הקלת תרבויות לטווח ארוך לפחות 40 יום⁴. במערכת זו, PHH הם נזרע על פיגומים מצופים קולגן, אשר הם perfused ללא הרף עם מדיום הגידול לאספקת חמצן וחומרים מזינים לתאים. אף-על-פי תרבות חלופית מערכות PHH מבוסס על cocultures מורכבים fibroblasts מאתר או גידול 3D spheroids יש מאומתים, רגישים לזיהומים HBV באמצעות multiplicities של זיהום במקבילות הגנום 500 (GE) של HBV בכל תא, תלת-ממד כבד-על-שבב תרבויות נשארים במערכת מודל במבחנה הבלעדית רגישים 0.05 ג ' נרל אלקטריק של HBV לכל תא⁴. זה היא בנוסף ביסודה על ידי הצורך באמצעות ריכוז גבוה של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), פוליאתילן גליקול (PEG) להקים HBV זיהום בתרבויות אלה, ובגלל זה לוותר על הזיהום של מערכות התרבות הכבד-על-שבב תלת-ממד ⁴. בין גולת העיקריים של HBV זיהום הוא מאגר cccDNA, אשר משמש התבנית תעתיק עבור כל de novo–המיוצר virions^5,6. אף-על-פי cccDNA ניתן להבחין ב- hepatocyte קונבנציונלי-תרבויות-^7,-⁸, עדיין לא ברור לגבי האם ברגולציה של cccDNA ויש גישות טיפוליות שמטרתן חיסול הם recapitulated ב חלקית או hepatocytes לחלוטין dedifferentiated. אנחנו הראו cccDNA הזה נוצר באופן פונקציונלי בתרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד, מגיב לגירויים פיזיולוגיים, ניתן לפלח על ידי הפרעה את הנגישות של מכונות תעתיק הגנום cccDNA⁴.

לארח התגובות HBV זיהום ב- 3D לחקות הכבד-על-שבב לאלה הנהוגות HBV נגועים, המאפשר זיהוי סמנים ביולוגיים זיהום, כמו גם ההצלחה הטיפולית. בין התכונות הייחודי של הכבד-על-שבב תרבויות הוא היכולת להעריך תגובות לטווח ארוך מארח בין PHH לבין שאר התאים nonparenchymal בתוך הכבד, כולל תאים⁴Kupffer, תאי stellate⁹של הכבד sinusoidal תאי אנדותל^10,11. זה מציע הזדמנות ייחודית כדי להעריך את האינטראקציות תא תא microenvironment תלת-ממד מורכבים.

בנוסף, תקופת תרבות מורחב של פלטפורמה זו מקלה על ההערכה של טיפולים בסמים רציפים והשפעתם על התמדה HBV, אשר לא ניתן באמצעות מערכות התרבות hepatocyte קונבנציונלי.

פרוטוקול זה מתאר כיצד 3D הכבד-על-שבב תרבויות נוצרים, עבור monocultures של PHH או עבור cocultures של PHH עם תאים Kupffer. יתר על כן, אנו מתארים את הייצור של HBV מטוהרים ללימודי נמוך-ריבוי-של-זיהום, כמו גם ניתוח עוקבות של המארח ותגובות ויראלי.

1. Equilibration של צלחות והאסיפה

1. ודא כי המדחס והן את משאבת ואקום המשויך פלטפורמת LiverChip מופעלים. לבצע את ההרכבה ואת equilibration של הלוחות בכיתה II בארון.
2. גילוח ורחיצה כירורגית להרכיב את הצלחות microfluidic על-ידי הצבת קרום סטרילי בין הבסיס צלחת והוספת הפלטה היטב המכיל (איור 1 א').
3. ודא כי קרום סטרילי בצורה חלקה נשענת על שני הפינים צלחת הבסיס, מאז קרום לא אחיד השמה פשרות מחזור הדם microfluidic.
4. להוסיף מכסה צלחת סטרילי והדק את הברגים בבסיס של צלחת באמצעות מומנט אוטומטיים דיוק של עד 33 ק ג באמצעות ספירלה הידוק רצף. ודא כי כל הברגים הם הידקו עד 35 ק ג באמצעות מומנט ידנית. במהלך שלב זה, להבטיח הברגים הם הידקו באופן סימטרי (איור 1 א').
5. Prewarm hepatocyte זריעה בינוני המכיל וויליאמס E בינוני, hepatocyte העיקרי מפשיר, ציפוי תוספי מזון, 5% סרום שור עוברית (FBS) ו 1 מיקרומטר דקסמתזון עד 37 ° C לפני לקרקע.
6. פריים לוח שהורכב לחלוטין על-ידי הצבתו בתוך הרציף כביסה והוספת µL 400 של hepatocyte זריעה בינוני לצד מאגר של כל טוב. להבטיח שהצלחת שתיצמד הרציף כביסה לחלוטין.
7. ליזום את לזרום לכיוון עליון למשך 3.5 דקות ב- 1 µL/s. הפונקציה מוצלחת של מחזור הדם microfluidic ניתן לקביעה דרך האינדיקטורים אדום על הצד של הצלחת (איור 1 א').
8. ברגע המדיום נשאבים לצד צמיחה סלולרי של הצלחת, הבטחת הרכבה נכונה של ערוץ הזרימה, להוסיף אוטם 1.2 נוסף של hepatocyte זריעה בינוני.
9. בזהירות להעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה בתוך חממה humidified-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ , ליזום את לזרום לכיוון עליון בספיקה של 1 µL/s עבור 16 h (איור 1 c).
10. להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, לחסל בועות בתוך הבאר על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
11. הוסף אחד עקר, עגול נייר סינון, ואחריו לפיגום מצורף תא, צליל תומכים, מכל קידוח באמצעות מלקחיים סטרילי. לחץ כלפי מטה בכל טוב עם פומפה סטרילי כדי לנעול את הטבעות ואת פיגומים שהגנו למקום (איור 1b).
12. האחות בינוני כל להוסיף 400 µL prewarmed hepatocyte בינוני זריעה בעדינות על הגרדום, ליזום את לזרום בכיוון מטה 3.5 דקות ב- 1 µL/s.
13. וביופסיה בינוני כל וכישרונות לצד מאגר של הצלחת. שלב זה נחוץ להחלפת המדיום הכלול ערוץ הזרימה.
14. להוסיף 1.4 מ של hepatocyte זריעה בינוני מכל קידוח לפני שחזר את הצלחת אל המזח כדי להשלים את הנפח הכולל לכל טוב. אמצעי האחסון לכל טוב נמצא עכשיו 1.6 מ ל (1.4 mL בבאר ו- 0.2 מ"ל בתעלה זרימה).

2. מפשיר, זריעה של Hepatocytes עבור Monocultures

1. Prewarm hepatocyte מפשיר בינוני, בינוני זריעה hepatocyte עד 37 ° C לפני מפשיר בקבוקון אחד של PHH בהתאם להוראות הספקים. השתמש צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במהלך שלב זה כדי להימנע שינויי טמפרטורה פתאומי. מבצעים את הפשרתו זריעה של hepatocytes בכיתה II הקבינט.
2. Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיום זריעה hepatocyte ולספור את התאים באמצעות trypan blue. ודא הכדאיות של התאים מעל 90%.
3. שמור את התאים על הקרח עד שהם מתווספים הבארות.
4. להעביר את הצלחת equilibrated, שהורכב במלואו אל המזח כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות.
5. להוסיף 600,000 hepatocytes מכל קידוח באמצעי אחסון µL 500 hepatocyte בינוני זריעה.
6. ליזום את לזרום בכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s ולהביא את הנפח הכולל בבאר 1.6 mL על-ידי הוספת µL 900 של hepatocyte זריעה בינוני.
7. להעביר את הצלחת לתחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂.
8. ליזום את לזרום בכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s עבור 8 שעות, ואחריו היפוך זרימה לכיוון מעלה בספיקה של 1 µL/s עבור 8 שעות.
9. להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות.
10. להוסיף 400 µL hepatocyte תחזוקה בינוני (בינוני וויליאמס E בתוספת hepatocyte תחזוקה תוספי תזונה ו- 100 ננומטר דקסאמתאזון) כל טוב, אתחול זרימה לכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s 3.5 דקות.
11. האחות בינוני כל מן המאגר ולהוסיף 1.4 מ של hepatocyte תחזוקה בינוני (איור 1 d).
12. החלף את המדיום hepatocyte תחזוקה בינוני כל 48 שעות. כדי להבטיח שכל מדיום בבאר מוחלף, לבצע צעד כביסה לפני התוספת של hepatocyte טריים תחזוקה בינוני.
13. עבור השלב כביסה, להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות ולהוסיף 400 µL תחזוקה בינוני.
14. ליזום זרימה לכיוון מטה-µL/s 1 עבור 3.5 מינימלית וביופסיה בינוני כל המופיעים בצד מאגר מים מן הבארות.
15. להוסיף 1.4 מ של hepatocyte תחזוקה בינונית ותוך חממה humidified של 37 ° C, עם 5% CO₂, להעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה, ליזום את לזרום לכיוון עליון בספיקה של 1 µL/s במשך 48 שעות (איור 1f).
    הערה: עבור monocultures hepatocyte משמשים שולטת על cocultures, על מנת להבטיח תנאים מבוקרים, סוג נוסף של תחזוקה בינוני משמש, אשר הוא ספציפי לשימוש cocultures עם ראשי תאים אנושיים Kupffer. 48 שעות לאחר החלפת את hepatocyte זריעה בינוני hepatocyte תחזוקה בינונית (יום 3 פוסט-זריעה), המדיום תחזוקה hepatocyte הרגיל יוחלף coculture תחזוקה בינוני II, בפרט monocultures של PHH בהשוואת כדי cocultures של תאים הן PHH והן Kupffer, כמו הרכיבים בינוני שונים במקצת.

3. מפשיר, זריעה של תאים Kupffer, Hepatocytes עבור תרבויות שיתוף

1. על מנת להבטיח השוואה של תוצאות, תמיד להשוות בין PHH/Kupffer תא cocultures אל PHH monocultures
2. עבור cocultures של תאים PHH ו- Kupffer, להפשיר בקבוקון אחד של תאים Kupffer מתקדמת של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (AdDMEM) ללא דקסמתזון אבל בתוספת hepatocyte הראשית מפשיר ו ציפוי תוספי תזונה (coculture זריעה בינוני) לפי הוראות הספקים. מבצעים את הפשרתו זריעה של תאים Kupffer hepatocytes בכיתה II הקבינט.
3. Resuspend תאי 1 מ"ל של coculture זריעה בינוני ולספור את התאים באמצעות trypan blue. ודא הכדאיות של התאים מעל 90%.
4. שמור את התאים על קרח קודם להוספתם לבארות כדי למנוע הידבקות תאים.
5. בצע את ההוראות בשלבים 2.1 – 2.3 עבור הפשרתו של ראשי hepatocytes אנושי.
6. להעביר את הצלחת equilibrated, שהורכב במלואו אל המזח כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות.
7. להוסיף כל טוב הנפח הכולל של 250 µL כל של coculture זריעה בינוני 60,000 תאים Kupffer ו/או 600,000 hepatocytes.
8. ליזום את לזרום בכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s ולהוסיף µL 900 של coculture זריעה בינוני כל טוב.
9. להעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂.
10. ליזום את לזרום בכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s עבור 8 שעות, ואחריו היפוך זרימה לכיוון מעלה בספיקה של 1 µL/s עבור 8 שעות.
11. להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות.
12. להוסיף 400 µL coculture תחזוקה בינוני I (AdDMEM ללא דקסמתזון אבל שהושלם עם תוספי תחזוקה hepatocyte) כל טוב, אתחול זרימה לכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s 3.5 דקות.
13. האחות בינוני כל מהצד מאגר ולהוסיף 1.4 מ של coculture תחזוקה בינונית את כל טוב.
14. להעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂ , ליזום את לזרום לכיוון עליון בספיקה של 1 µL/s במשך 48 שעות.
15. להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות. להוסיף 400 µL coculture תחזוקה בינוני II (E וויליאמס בינוני ללא דקסמתזון אבל שהושלם עם 100 ננומטר הידרוקורטיזון, hepatocyte תחזוקה תוספי מזון), ליזום את לזרום בכיוון מטה-µL/s 1 3.5 דקות.
16. האחות בינוני כל המופיעים בצד מאגר מים מן הבארות.
17. להוסיף 1.4 מ של coculture תחזוקה בינוני השני, להעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂.
18. ליזום את לזרום לכיוון עליון בספיקה של 1 µL/s במשך 48 שעות (איור 1e).
19. החלף את המדיום כל 48 שעות coculture תחזוקה בינוני II. כדי להבטיח שכל מדיום בבאר מוחלף, לבצע צעד כביסה לפני התוספת של בינוני טריים.
20. לשטוף, להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות, וכן להוסיף 400 µL coculture תחזוקה בינוני II.
21. ליזום זרימה לכיוון מטה-µL/s 1 עבור 3.5 מינימלית וביופסיה בינוני כל המופיעים בצד מאגר מים מן הבארות.
22. להוסיף 1.4 מ של coculture תחזוקה בינוני השני, להעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂, ליזום את לזרום לכיוון עליון בספיקה של 1 µL/s במשך 48 שעות (איור 1f).

4. הייצור של וירוס בלתי זיהומיות הפטיטיס B ללימודי זיהום

1. ביצוע סעיף זה של הפרוטוקול רמה הבלימה השלישי מעבדה. האם זריעה, שינויים בינוני, בינוני, ואוסף וירוס ריכוז בשיעור השני הקבינט.
2. התרבות התאים מייצרי HBV (למשל, HepDE19, HepAD38) במצופים קולגן T1000 שכבה 5 מבחנות ב- 120 מ של DMEM מלאה/F12 (10% FBS, פניצילין/steptomycin, חומצות אמינו שאינן חיוניות, 500 μg/mL G418 ו טטרציקלין 1 μg/mL) עד שיגיעו 90% confluency.
3. שנה המדיום לבינונית אינדוקציה (מלאה DMEM ללא טטרציקלין) כדי לעודד ייצור HBV.
4. לאסוף את עוצמת הקול בינונית מלאה כל 48 שעות לנסיגה שלאחר 12 ימים של טטרציקלין ואחסן אותו ב 4 º C.
5. לסנן את המדיום שנאספו דרך מסנן העליון של בקבוק 0.45 מיקרומטר.
6. להוסיף 8000 יתד עקר בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) למדיום שנאספו כדי ריכוז סופי של 4% w/w, לערבב על ידי היפוך 8 x-10 x, דגירה ב 4 ° C עבור ה 16 צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור h 1 ב 4 ° C כדי לאסוף את הוירוס זירז פג resuspend בגדר ב- PBS המכיל 10% FBS.
7. לשלב את הווירוס זירז פג כל נקודות זמן האיסוף, להחליק אותו על גבי כרית 20% סוכרוז. צנטריפוגה ב x 140,000 g עבור h 16 ב 4 ° C באמצעות רוטור של SW28.
8. וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב- PBS בתוספת 10% FBS ו aliquot ולאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.
9. לקבוע את מספר עותק HBV DNA נוכח תגובת שיקוע על ידי HBV DNA qPCR (שלב 6).

5. זיהום של תרבויות 3D עם HBV

1. לבצע זיהומים בשיעור השני ארון בתוך בידוד רמה III מעבדה.
2. 3 ימים לאחר זריעה של monocultures או cocultures, להפשיר את המספר הנדרש של HBV המכילות aliquots בטמפרטורת החדר ו לדלל את המינון הנדרש וירוס מ 1.8 ל hepatocyte תחזוקה בינונית או coculture תחזוקה בינוני השני לכל טוב, בהתאמה.
3. וירוס זה מדולל 1.8-mL מספיקה עבור השלב כביסה (400 µL) והחלפה של בינוני בבאר (1.4 מ"ל). עם זאת, ריבוי הנדרש של זיהום צריכה תיקון לחשבון עבור אמצעי האחסון תרבות הסופי של מ ל 1.6.
4. להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות. להוסיף 400 µL בינוני המכילים HBV וליזום זרימה לכיוון מטה-µL/s 1 עבור 3.5 מינימלית וביופסיה בינוני כל המופיעים בצד מאגר מים מן הבארות.
5. להוסיף 1.4 מ של HBV המכילות תחזוקה בינוני/coculture תחזוקה II בינונית לכל טוב ולהעביר את הצלחת לתוך תחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂. ליזום את לזרום בכיוון מטה בספיקה של 1 µL/s עבור 8 שעות, ואחריו היפוך לכיוון מעלה בספיקה של 1 µL/s.
6. 24 שעות לאחר התוספת של HBV, להעביר את הצלחת להגיע לרציף כביסה, תשאף בינוני כל מן הבארות.
7. לשטוף כל טוב בצלחת x 3 עם המדיום המתאים, בהתאם לסוג של התרבות כפי שמתואר בספר צעדים 2.12 – 2.14, לסלק הווירוס שאריות מן הבאר. בניגוד צעדים 2.12 – 2.14, להוסיף מ 1.6 ל בינוני היטב בכל חשבון עבור אמצעי האחסון הנוסף ניתן לטעום כדי לא לכלול inoculum דחויים (איור 1 g).
8. בעקבות צעדים אלה כביסה, לאסוף µL 200 בינוני מכל קידוח לאשר הסרה מלאה של inoculum HBV מאת כימות של חוץ-תאית HBV DNA.
9. להעביר את הצלחת לתחנת העגינה בתוך חממה humidified 37 ° C, עם 5% CO₂ולאחר ליזום את לזרום לכיוון עליון בספיקה של 1 µL/s במשך 48 שעות.
10. 48 שעות לאחר מכן, לאסוף האחסון טוב מלא לניתוח במורד הזרם, ואחריו שלושה שוטף hepatocyte תחזוקה בינונית כמתואר בצעדים 2.12 – 2.14. להחליף את המדיום ולשטוף כל 3 טוב x כל 48 שעות עד סיום ניסיוני.

6. כימות של חוץ-תאית HBV DNA

1. בודד הכולל הדנ א תרבות supernatants לפי ההוראות של היצרן עם התוספת של 1 µg נושאת RNA ההכלה ברמה III מעבדה כדי להבטיח איון וירוס הדגימות לפני העברתם לאזור אחר.
2. להכין תערובת הבסיס המכיל מיקס מאסטר PCR כמותי, 600 nM פריימר לפנים, 600 nM הפוכה פריימר, עד 300 nM של בדיקה.
3. להוסיף 7 µL של המיקס מאסטר לתוך כל טוב של צלחת 384-. טוב.
4. להוסיף 5 µL של דגימות די אן איי כפילויות, פקד לא-תבנית ו כפילויות באופן סדרתי מדולל HBV המכילות הגנום המבוסס על פלסמיד תקן (למשל, pCMV-HBV) שנעו בין 10⁹ עותקים בכל תגובה 10² עותקים בכל תגובה כל טוב של qPCR צלחת.
5. המקום של כיסוי דבק יניף ולהבטיח כי כל טוב חתום כראוי.
6. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב x 300 גרם.
7. להתחיל את qPCR לפעול על פי הוראות היצרן. התנאים מחזור עבור ה-PCR בזמן אמת הם 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות.
8. לכמת את מספר העותקים HBV DNA בתוך הדגימות לא ידוע לפי העקומה סטנדרטי.

7. כימות של תאיים HBV Pregenomic (עמוד) RNA

1. לבודד RNA הכולל של פיגומים על פי הוראות היצרן. על מנת להבטיח פירוק התא מלא, מערבולת כל לגרדום x 3 עבור 30 s ואחריו צנטריפוגה ב x 300 גרם עבור 1 דקות בין כל vortexing. לבצע את פירוק התא רמת הבלימה השלישי מעבדה כדי להבטיח איון וירוס הדגימות לפני העברתם לאזור אחר.
2. לתמלל cDNA מ הרנ א מבודד על פי הוראות היצרן.
3. מחזור עבור retrotranscription התנאים 25 º C למשך 10 דקות, 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות, ו- 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
4. שומרים את הדגימות cDNA ב 4 ° C עבור לטווח קצר או ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
5. להכין תערובות מאסטר pgRNA ואת RPS11 המכיל כמותיים PCR בסיס תמהיל תחל ואחורה עבור pgRNA ו- RPS11 (משמש בתור משק הגן)-ריכוז סופי של 0.2 µM.
6. הוסף µL 7.5 של המיקס מאסטר µL 2.5 של cDNA לכל טוב על צלחת 384-. טוב. למדוד את RPS11 ואת pgRNA של כל דגימה של כפילויות, כוללים פקד מתבנית לא טוב עבור שני גנים.
7. המקום של כיסוי דבק יניף ולהבטיח כי כל טוב אטומה לחלוטין.
8. Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב x 300 גרם.
9. הכנס את הצלחת לתוך הצנטרפוגה qPCR ולהתחיל את qPCR להפעיל אותו באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי PCR כמותי לפי הוראות היצרן. התנאים מחזור עבור ה-PCR בזמן אמת הם 50 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C עבור 1 דקות.
10. לחשב את הביטוי של pgRNA ביחס RPS11.

8. immunofluorescence מכתים של אנטיגן ויראלי

1. תסיר את הטבעת שהגנו מן הבאר ולהסיר לגרדום עם מלקחיים בכיתה הקבינט II במעבדת השלישי רמת הבלימה.
2. לתקן פיגומים המכילות תאים עם 4% paraformaldehyde ב 1 מ"ל של PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר הבלימה ברמת המעבדה השלישי. ניתן לבצע את הפעולות הבאות באיזור שונה.
3. לשטוף פיגומים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS.
4. Permeabilize התאים באמצעות 0.1% טריטון-X 100 מ ל 1 ל- PBS לשעה בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף פיגומים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS.
6. בכריכת בלוק שאינם ספציפיים על ידי דגירה של פיגומים עם 1% BSA ב 1 מ"ל של PBS 16 h-4 מעלות צלזיוס.
7. לשטוף פיגומים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS.
8. לבצע נוגדן ראשוני מכתים בעזרת הארנב נגד הפטיטיס B וירוס core אנטיגן לדילול 1:200 ב 1% BSA ב 1 מ"ל של PBS עבור 16 h-4 מעלות צלזיוס.
9. לשטוף פיגומים 1 x עם 0.1% Tween ב 1 מ"ל ל- PBS (PBS-Tween) ו- 3 x 1 מ ל- PBS.
10. לבצע נוגדנים משניים מכתים שימוש עז ארנב אנטי איג (H + L) קרוס-הספוחה מצומדת אלקסה עבור חיל הים 594 משני נוגדן לדילול 1:2,000 ב 1% BSA ב 1 מ"ל של PBS עבור 16 h-4 מעלות צלזיוס.
11. לשטוף פיגומים 1 x עם 1 מ"ל של 0.1% ל- PBS-Tween ו- x 3 מ ל 1 ל- PBS.
12. Counterstain פיגומים באמצעות דאפי ב 1 מ"ל של PBS ב ריכוז של µg 2/mL 10 דקות בטמפרטורת החדר.
13. לשטוף פיגומים 1 x עם 1 מ"ל של 0.1% ל- PBS-Tween ו- x 3 מ ל 1 ל- PBS.
14. העברת פיגומים על שקופית מיקרוסקופ והר זה עבור הדמיה.
15. תמונה פיגומים באמצעות מיקרוסקופ זריחה.

9. האנושי אלבומין אליסה

1. ביצוע סעיף זה של הפרוטוקול בכיתה II בארון מוקצה הבלימה ברמת המעבדה השלישי אם עובדים עם חומר זיהומיות.
2. כדי להעריך את הכדאיות והפונקציונליות מטבולית של PHH, הערכת ייצור אלבומין האדם מאת אליסה.
3. המעיל 96-ובכן צלחות עם µL 50 לכל טוב של נוגדנים נגד עיזים מדולל 1:800 במאגר ציפוי (100 מ מ ביקרבונט/קרבונט, pH 9.6). לכסות את הלוחות ואת תקופת דגירה של 2 h ב 37 ° C או לילה ב 4 º C.
4. האחות הנוגדן ציפוי מהצלחת. ולשטוף אותו x 4 עם µL 200 של 0.05% PBS-Tween.
5. להוסיף 200 µL מאגר חסימה (BSA 1% ב- PBS), לכסות את הלוחות, דגירה אותם עבור h 1 ב 37 ° C או לאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 חודשים. לאחסון לטווח ארוך, להוסיף אזיד הנתרן 0.05% למאגר חסימה.
6. האחות המאגר חסימה ולשטוף x 1 עם µL 200 של 0.05% PBS-Tween.
7. הוסף µL 50 דוגמאות בעבר מדולל לכל טוב (1: 100). Diluent מדגם מכיל BSA 1% ב- 0.05% PBS-Tween. תקופת דגירה של h 1 ב 37 ° C או לילה ב 4 º C.
   הערה: דגירה הסטנדרטים באותו זמן כמו הדגימות. טווח ריכוז של 500 – 0.488 מומלץ ng/mL (דילולים טורי 1:2). ביצוע דילולים כל טורי של אלבומין האנושי מדגם diluent.
8. האחות דגימות מן הצלחת ולשטוף אותו x 4 עם µL 200 של 0.05% PBS-Tween.
9. הוסף µL 50 של נוגדנים נגד אלבומין עז מצומדת HRP מדולל בעבר 1:10,000 ב מדגם diluent. תקופת דגירה של 2 h ב 37 ° C או לילה ב 4 º C.
10. האחות הנוגדן מהצלחת. ולשטוף אותו x 6 עם 200 µL של 0.05% PBS-Tween.
11. להוסיף 100 µL של ריאגנט שוייץ ולהוסיף, ברגע בסטנדרטים הגבוהים ביותר מפותחות לגמרי, µL 100 1 M H₂אז₄ כדי לעצור את התגובה ערכי צבע מוחלטים.
12. לקרוא את ספיגת ב 450 ננומטר על קורא 96-ובכן צלחת לניתוח.

10. אינטרלוקין (IL) 6 וייצור α גורמי נמק הגידול (TNF) בתרבויות שיתוף תלת-ממד

1. ביצוע סעיף זה של הפרוטוקול בכיתה II בארון מוקצה הבלימה ברמת המעבדה השלישי אם עובדים עם חומר זיהומיות.
2. לכמת ההפקה IL6 ו TNFα כדי להעריך את הפונקציונליות ואת הכדאיות של התאים Kupffer הראשי. כדי לעודד הייצור של ציטוקינים אלה על ידי תאים Kupffer, התייחס cocultures עם 1 µg/mL ליפופוליסכריד (LPS) 9 d פוסט-זריעה במדיום תחזוקה coculture II במשך 48 שעות.
3. -יום 11 פוסט-זריעה, קציר המדיום מכל קידוח ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.
4. מודדים את ריכוז IL6 ו TNFα במדיום התרבות מאת assay המתאים ועל פי הוראות היצרן.

אנו מתארים פלטפורמה פשוטה, רב-תכליתי עבור התרבות לטווח ארוך של התאים Kupffer העיקרי של האדם ו/או hepatocytes ולדלקת שלהם עם HBV. ראשי תאים אנושיים הם נזרע על פיגומים פוליסטירן מצופים הקולגן בתוך אסיפה צלחת microfluidic, אשר ללא הרף perfuses התאים עם מדיום הגידול (איור 1 א').

PHH, אשר בדרך כלל יציבים רק כמות מוגבלת של זמן במערכות תרבות קונבנציונאלי, יכול להישמר פונקציונלית במשך פרקי זמן ארוכים. אלבומין האנושי, אשר מופרש על ידי hepatocytes פונקציונלי, והוא נחשב הסמן הטוב ביותר על ההערכה של מטבוליזם בכבד, stably, מאוד מבוטא על ידי תרבויות 3D עד היום 40 פוסט-זריעה (איור 2). עבור cocultures, Kupffer תא הפונקציונליות ואת הכדאיות יכול להיות מוערך על ידי הפרשת ציטוקינים ספציפיים (למשל, IL6 ו TNFα). למדידת ייצור ציטוקינים, מומלץ השימוש באמצעי זיהוי מבוסס-לכידת על LPS-גירוי של cocultures (איור 3).

תאים יוצרים microtissues הכבד, בדרך כלל תוך 3 ימים של זריעה של PHH, הוכחת פונקציונלי. מרה canaliculi, התא מלא קיטוב (איור 2). בנוסף תמך חילוף החומרים הסלולר פיזיולוגיים שלהם, תרבויות אלה הופכים במיוחד לזיהומים HBV. HBV DNA וסמנים ויראליות אחרות, בניגוד למערכות אחרות תרבות, להפוך בקלות לזיהוי מזיהום שלאחר יום 2 (איור 4). בנוסף מופרשים סמנים של זיהום נגיפי, פיגומים המכילות hepatocyte יכול להיות מאוחזר התרבויות ומשמש immunofluorescence איתור אנטיגנים ויראלי (למשל, HBsAg, HBcAg) (איור 4). כאשר תרבויות hepatocyte המקובלת דורשים חיסון עם ג ' נרל אלקטריק לפחות 500 HBV לכל תא, על התוספת של 2% דימתיל סולפוקסיד ו 4% פג, גם 0.05 HBV ג ' נרל אלקטריק בהיקף מסוגלים ליזום זיהום בתרבויות תלת-ממדי ללא הדרישה של דימתיל סולפוקסיד או PEG (איור 4).

איור 1: הקמה של תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממדי. () זה סכמטית פריסה עבור ההרכבה של צלחת תרבות כדי להבטיח את הקמתה של מחזור הדם microfluidic. (b) לוח זה מציג מבט מקרוב על הבארות תרבות, כולל נייר סינון לגרדום, הטבעת הסגירה. (ג) לוח זה מראה את התהליך של צלחת equilibration לפני זריעה התרבויות. הלוחות שני הבא להראות את התהליך של זריעה עבור monocultures hepatocyte (ד) ו- (e) hepatocyte/Kupffer תא cocultures. (f) לוח זה מראה את השלבים כביסה מעורבת בינונית שינויים. (g) לוח זה מראה את הסידור זיהום HBV, לרבות הסרת inoculum. ש. מ. = בינוני זריעה, ועותרת = תחזוקה בינוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: הכדאיות היווצרות של hepatocyte הכבד microtissue. לוח זה () מציג תמונות האורך brightfield של monocultures 3D hepatocyte הוכחת היווצרות microtissue בעקבות זריעה. (b) לוח זה מראה immunofluorescence הדמיה של תרבויות עבור גרעינים (כחול), אנושי אלבומין (ירוק). (ג) לוח זה מראה האורך הכולל אלבומין, כמו גם בכל תא מותאם ייצור אלבומין, במהלך 40 ימים של hepatocyte monocultures, כפי שנקבע על ידי אליסה. הנתונים המוצגים הינם SD. זאת אומרת ± דמות זו מותאמת אורטגה-פרייטו ואח '⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: Kupffer תא פונקציונליות תלת-ממדי cocultures. לוחות אלה מציגות את הפרשת () IL6 ואת (b) TNFα ב- hepatocyte monocultures, hepatocyte/Kupffer תא cocultures 11 ימים שלאחר זריעה בתגובה LPS exogenously נוסף-יום 9 פוסט זריעה, כפי שנקבע באמצעות האדם מגנטי Luminex assay. דמות זו מותאמת אורטגה-פרייטו ואח '⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4: HBV זיהום בתרבויות הכבד-על-שבב- () לוח זה מציג זיהוי מיקרוסקופ immunofluorescence HBcAg (אדום), HBsAg (ירוק), גרעינים (כחול) 10 ימים בעקבות הזיהום של התרבויות עם HBV. (b) לוח זה מראה את הרגישות של התרבויות לזיהום HBV באמצעות multiplicities שונות של זיהום, כפי שיקבע על כימות של HBV DNA ב supernatants התרבות. (ג) לוח זה מציג כימות של הצטברות האורך של HBV pgRNA ביחס הגן משק בית RPS11. הנתונים המוצגים הינם SD. זאת אומרת ± דמות זו מותאמת אורטגה-פרייטו ואח '⁴. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

האתגרים בשמירה על תרבויות ארוכת טווח של PHH הניעו הפיתוח של מספר מודלים תרבות עם פונקציונליות מוגברת, אריכות ימים, אחד מפגין דיפרנציאלית יתרונות וחסרונות. זה נרחב כעת ידוע כי תרבויות 2D סטטי של PHH הם מחקה היבטים מסוימים של ביולוגיה hepatocyte עבור סכומים מאוד מוגבלת של זמן. לפיכך, micropatterned cocultures^12,13,^14,תרבויות ספרואיד¹⁵, תרבויות הכבד-על-שבב 3D^16,17 במהירות החלפת מערכות בסיסי יותר אלו. במיוחד כאשר הלומדים מחלות זיהומיות, אשר יש coevolved עם המנחה שלהם כדי לנצל את microenvironments ספציפיים, הדרישה למתן סביבות פיזיולוגיים היא ביסודה על ידי טיב לעיתים קרובות מאתגרת culturing האדם-חוג מחלות זיהומיות, כולל וירוס הפטיטיס C, HBV ו מלריה.

השלב הקריטי ביותר בביצוע תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד היא האיכות של סוגי בתחילה מתוצרת התא הראשי. תאים אלה צריך להיבדק על יכולת הדבקות שלהם, רק plateable הרבה PHH אמור לשמש על מנת להבטיח היווצרות רקמת מוצלחת ויצירת תרבות. אף-על-פי PHH מבודדים טרי יכול לשמש, הקפאה קריוגנית שלהם הוא בדרך כלל מורכב ודורש מקפיאים שבשליטת תעריף מיוחד.

בניגוד קונבנציונאלי תרבויות 2D סטטי, הרקע הגנטי של המארח הוא זניח ביחס הרגישות לזיהום HBV, כל התורמים hepatocyte נבדק ובכך-הרחוק הם מסוגלים ליצור זיהום HBV⁴.

אף-על-פי HBV נגזר המטופל יוצר דלקות של תרבויות 3D, זה הכרחי כדי לנצל זירז פג וטיהרו סוכרוז כרית-HBV בכל פעם באמצעות הסלולרי מפיק HBV inducible קווים לדור של inocula ויראלי. תא supernatants תרבות מוחל ישירות על תרבויות הכבד-על-שבב תלת-ממד, או באמצעות הנוכחות של גורמים מעכבות או עקב חוסר תאימות של גורמי גדילה הנוכחי עם hepatocytes, לא בקלות לגרום זיהום. בנוסף, בעת בחירת המטופל, נגזר inocula ויראלי, רק סרום אמור לשמש, שכן פלזמה באופן בלתי נמנע נקרש שסותם את זרימת הדם microfluidic של פלטפורמת תרבות.

ללא קשר inoculum ויראלי בשימוש, הבטחת הכדאיות הסלולר ובידול, כמו גם להבטיח הסרה מלאה של inoculum הראשונית HBV, הוא המפתח להצלחה בלימודים זיהום לטווח ארוך. הדרך הנוחה ביותר לעשות זאת היא דגימה תרבויות בעקבות הסרת inoculum ויראלי, כמו גם מדידת רמות אלבומין אנושי לאורך כל תקופת תרבות. ראוי לציין, באופן דומה כדי לתאר כל פלטפורמות אחרות, זיהום HBV, הוקמה לאחר, בקלות להתפשט לתאים נגוע. המנגנון הבסיסי זה עודנו מאז HBV זיהום ויוו מדביק ברצון הרוב hepatocytes בתוך הכבד.

לגבי cocultures של תאים PHH ו- Kupffer, מומלץ לבצע בדיקות רבות של תאים Kupffer כדי להעריך את הפרשת IL6 ו TNFα בתגובה לגירוי LPS, מכיוון שלא כל התורמים תא Kupffer זמינים מסחרית של תגובתיות שווה.

חשוב, עבור כל טיפולים תרופות או זיהום ראשוני של תרבויות עם HBV, הנפח הכולל של הבאר (1.4 מ ל), כמו גם החל ערוץ microfluidic (0.2 מ"ל), חייב להילקח בחשבון לחישוב ריכוז סמים או inoculum. על מנת להבטיח מינון מדויק, צעד אחד כביסה בינונית המכיל HBV או סמים זה מבוצע על מנת פריים בערוץ microfluidic.

פלטפורמת בשימוש מנצל PHH 600,000 לכל טוב, המבטיח hepatocytes מרובה שכבות בתוך פיגומים. אף-על-פי מספר תאים יכולים להיות מגוונים, ריכוז התא שבחרת מבטיחה תוצאות אופטימליות. התבנית צלחת מחזיקה סכום כולל של 12 פיגומים, אשר ניתנת לשדרוג פיגומים 36. עם זאת, עקב דרישות microfluidic, אולם שינוי קנה המידה למספרים גבוהים יותר טוב. בלתי אפשרי לצאת

באמצעות גישות אלה, תרבויות יכול להישמר עם ביצועים מיטביים תא לפחות 40 ימים, אשר, עד כה, מציע הזדמנויות חסר תקדים כדי להעריך את הרומן סמים המועמדים, כמו גם ללמוד הגומלין המורכבים בין תאים שונים הכבד אוכלוסיות במהלך זיהום HBV.

המחברים אין לחשוף.

עבודה זו מומן על ידי מענק Starter של המועצה האירופית למחקר (637304), Wellcome אמון החוקר פרס (104771/ת/14-Z), ועל ידי CN ביו חידושים.