"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

Trotz der außergewöhnlichen Infektiosität des Hepatitis B-Virus (HBV) in-vivo, wo nur drei virale Genom einer Chronifizierung von experimentell infizierten Schimpansen führen kann, erfordern die meisten in-vitro-Modelle mehrere Hunderte bis Tausende von viraler Genome pro Zelle in Bestellung um eine transiente Infektion zu initiieren. Darüber hinaus können statische 2D Kulturen von primären humanen Hepatozyten (PHH) nur Kurzzeitstudien aufgrund ihrer schnellen Entdifferenzierung. Hier beschreiben wir 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen der PHH, Monokulturen oder in Kokulturen mit anderen Nonparenchymal-Leber-Resident-Zellen. Diese bieten eine deutliche Verbesserung zu langfristigen HBV-Infektionen mit physiologischen Host-Zell-Reaktionen zu studieren. Neben der Vermittlung Medikament Wirksamkeitsstudien, toxikologische Analyse und Untersuchung der Pathogenese, ermöglichen diese mikrofluidische Systeme die Bewertung der kurativen Therapien für HBV-Infektion zur Beseitigung kovalent geschlossen, Rundschreiben (ccc) DNA. Diese Methode vorgestellt beschreibt den Aufbau von PHH Monokulturen und PHH/Kupffer Zelle Ko-Kulturen, ihre Infektion mit gereinigtem HBV und die Analyse von Host-Antworten. Diese Methode ist insbesondere für die Bewertung der langfristigen Auswirkungen der HBV-Infektion Behandlungskombinationen und Pathogenese.

Das Studium der HBV hat durch die schlechte Anfälligkeit der Kultur-Systeme erfordern mehrere Hunderte bis Tausende von HBV-Genom-Kopien pro Zelle, die Infektion¹zu initiieren erschwert. Darüber hinaus primären humanen Hepatozyten sind in der Regel außerordentlich empfindlich und schnell während konventionelle Kulturen²Gewebestammzelle. Dies ist hauptsächlich auf der Tatsache, dass die flachen und harten Kunststoffoberflächen nicht die extrazellulären Naturlandschaften gefunden innerhalb der Leber und des allgemeinen Mangels an Sauerstoffversorgung der Kulturen in der Abwesenheit von mikrofluidischen Zirkulation imitieren. Herkömmlichen statischen Hepatozyten Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten schnell Gewebestammzelle und verlieren ihre Anfälligkeit für HBV-Infektion³. Hier beschreiben wir die Einrichtung und die Infektion der PHH gewachsen in 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen, die über herkömmliche 2D statischen PHH Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten aufgrund ihrer längeren Stoffwechsel- und funktionale Kompetenz enorm vorteilhaft sind, erleichtern langfristige Kulturen von mindestens 40 Tage⁴. In diesem System sind PHH auf Kollagen-beschichtete Gerüste, die ständig mit Wachstumsmedium, Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen liefern durchblutet werden ausgesät. Obwohl Alternativkultur Systeme für PHH basiert auf komplexen Kokulturen murine Fibroblasten oder 3D Zunahme der Sphäroide wurden validiert und sind anfällig für HBV-Infektion mit Mannigfaltigkeiten der Infektion von 500 Genom-Äquivalente (GE) von HBV pro Zelle, 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen bleiben das alleinige in-vitro-Modellsystem anfällig für 0,05 GE des HBV pro Zelle⁴. Dies wird zusätzlich durch die Notwendigkeit der Verwendung von hoher Konzentrationen von Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Polyethylenglykol (PEG), um HBV-Infektion zu etablieren in diesen Kulturen untermauert ist entbehrlich für die Infektion von 3D Culture Leber-on-a-Chip-Systeme ⁴. unter die wichtigsten Kennzeichen der HBV-Infektion ist der CccDNA Pool, fungiert als die transkriptionelle Vorlage für alle de Novo–produzierte Virionen^5,6. Obwohl CccDNA in konventionellen Hepatozyten Kulturen^7,8festgestellt werden kann, bleibt es unklar, ob die Regelung der CccDNA und jede therapeutische Ansätze, die darauf abzielen, ihre Beseitigung in teilweise zusammengefasst sind oder komplett entdifferenzierten Hepatozyten. Wir haben gezeigt, dass CccDNA funktional in 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen gebildet wird, auf physiologische Reize reagiert und kann durch Eingriffe in die Zugänglichkeit der transkriptionellen Maschinen CccDNA Genom⁴ausgerichtet sein.

Host-Antworten auf HBV-Infektion in 3D Leber-on-a-Chip-Mimic diejenigen bei HBV-infizierten Patienten, ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern für Infektion sowie Therapieerfolg beobachtet. Zu den einzigartigen Funktionen des Leber-on-a-Chip-Kulturen ist die Fähigkeit, langfristige Host Antworten zwischen PHH und anderen Nonparenchymal Zellen in der Leber, einschließlich Kupffer Zellen⁴Ganglion Zellen⁹und Leber sinusförmigen bewerten Endothelzellen^10,11. Dies bietet die einmalige Gelegenheit, Zell/Zell-Interaktionen in einem komplexen 3D Mikroumgebung zu bewerten.

Darüber hinaus erleichtert die erweiterte Kulturdauer dieser Plattform die Bewertung der sequentiellen medikamentöse Behandlungen und deren Auswirkungen auf HBV Beharrlichkeit, die nicht mit herkömmlichen Hepatozyten-Kultur-Systeme möglich sind.

Dieses Protokoll beschreibt wie 3D Leber-on-a-Chip Kulturen entstehen, für Monokulturen PHH oder Kokulturen PHH mit Kupffer Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von gereinigtem HBV für niedrige Multiplizität der Infektion Studien sowie die anschließende Analyse von Host und virale Antworten.

1. Montage und Gleichgewichtherstellung der Platten

1. Stellen Sie sicher, dass der Kompressor und der Zusammenhang mit der LiverChip-Plattform Vakuumpumpe eingeschaltet sind. Führen Sie die Montage und Gleichgewichtherstellung der Platten in einer Klasse II Schrank.
2. Aseptisch montieren Sie mikrofluidischen Platten indem eine sterile Membran zwischen Platte und Hinzufügen der gut mit Deckplatte (Abbildung 1a).
3. Sicherstellen Sie, dass die sterile Membran reibungslos auf die beiden Stifte der Grundplatte, seit ungleichmäßige Membran Platzierung Kompromisse mikrofluidischen Verkehr ruht.
4. Fügen Sie einen sterile Platte Deckel und ziehen Sie die Schrauben an der Unterseite der Platte mit einer automatisierten Präzision Drehmoment bis 33 lb mit einer Spirale Anzugsreihenfolge. Stellen Sie sicher, dass alle Schrauben bis 35 lb mit einem manuellen Drehmoment angezogen werden. Während dieses Schrittes zu gewährleisten, die Schrauben sind symmetrisch (Abbildung 1a).
5. Prewarm Hepatozyten seeding Mittel mit Williams E Mittel, primäre Hepatozyten Auftauen und Plattieren, Ergänzungen, 5 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 µM Dexamethason auf 37 ° C vor der Grundierung.
6. Grundieren Sie die komplett montierte Platte in der Wasch-Dock und Hinzufügen von 400 µL der Hepatozyten Aussaat Medium zum Reservoir Rand jedes gut. Sicherstellen Sie, dass die Platte waschen Dock vollständig einrastet.
7. Fluss in Aufwärtsrichtung für 3,5 min mit 1 µL/s zu initiieren. Die erfolgreiche Funktion der mikrofluidischen Zirkulation kann durch die roten Indikatoren an der Seite der Platte (Abbildung 1a) ermittelt werden.
8. Sobald das Medium zur Zelle Wachstum Seite der Platte gepumpt wird, gewährleistet die korrekte Montage des Strömungskanals, eine zusätzliche 1,2 mL der Hepatozyten Aussaat Medium hinzufügen.
9. Sorgfältig übertragen Sie die Platte in die docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ und initiieren Sie Strömung in der Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s 16 h (Abbildung 1 c).
10. Übertragen Sie die Platte zum Waschen Dock und beseitigen Sie Luftblasen in den Brunnen zu, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.
11. Fügen Sie eine sterile, runden Filterpapier, gefolgt von einer Zelle Anlage Gerüst und einen Sicherungsring, in jede Vertiefung mit sterilen Pinzette. Drücken Sie jede Vertiefung mit einem sterilen Kolben um die Bindung läutet und Gerüste (Abbildung 1 b) einrastet.
12. Aspirieren Sie alle mittelständischen und fügen Sie 400 µL vorgewärmte Hepatozyten seeding Medium sanft über das Gerüst und initiieren Sie fließen in die Richtung nach unten für 3,5 min mit 1 µL/s zu.
13. Aspirat alle Mittel der Platte aus dem Reservoir gepumpt. Dieser Schritt ist notwendig, das Medium in den Strömungskanal enthaltenen zu ersetzen.
14. Hinzugeben Sie 1,4 mL Hepatozyten Aussaat Medium in jede Vertiefung vor der Rückkehr der Plattenrandes in das Dock, um das Gesamtvolumen pro Bohrloch komplett. Das Volumen pro Bohrloch ist jetzt 1,6 mL (1,4 mL in den Brunnen und 0,2 mL im Strömungskanal).

(2) Auftauen und Aussaat des Hepatozyten für Monokulturen

1. Prewarm Hepatozyten Auftauen und Hepatozyten seeding Medium auf 37 ° C vor dem Auftauen eine Durchstechflasche PHH gemäß den Anweisungen des Lieferanten. Verwenden Sie eine Zentrifuge bei Raumtemperatur während dieses Schrittes um zu abrupte Temperaturschwankungen zu vermeiden. Führen Sie das Auftauen und Aussaat von Hepatozyten in einer Klasse II-Kabinett.
2. Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL der Hepatozyten seeding Medium und zählen Sie die Zellen verwenden Trypan blau. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen über 90 % liegt.
3. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis sie in die Vertiefungen hinzugefügt werden.
4. Transfer der äquilibriert und komplett montierten Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen.
5. 600.000 Hepatozyten in jede Vertiefung in einem 500 µL Volumen von Hepatozyten seeding Medium hinzufügen.
6. Initiieren Sie fließen in die Richtung nach unten mit einer Durchflussrate von 1 µL/s zu und bringen Sie das Gesamtvolumen in den Brunnen bis 1,6 mL durch Zugabe von 900 µL der Hepatozyten Aussaat Medium.
7. Übertragen Sie die Platte auf der Docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂.
8. Fließen in die Richtung nach unten mit einer Durchflussrate von 1 µL/s für 8 h, gefolgt von einer Strömung Umkehr in der Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 8 h zu initiieren.
9. Übertragen Sie die Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen.
10. Jedes gut und initiieren fließen in die Richtung nach unten mit einer Durchflussrate von 1 µL/s für 3,5 min fügen Sie 400 µL der Hepatozyten Wartung Medium (Williams E Mittel ergänzt mit Hepatozyten Wartung Ergänzungen und 100 nM Dexamethason hinzu).
11. Aspirieren Sie alle Mittel aus dem Reservoir und 1,4 mL Hepatozyten Wartung Medium (Abbildung 1-d).
12. Ersetzen Sie das Medium mit Hepatozyten Wartung Medium alle 48 h. Um sicherzustellen, dass alle Mittel in den Brunnen ersetzt wird, führen Sie einen Waschschritt vor der Zugabe von frischen Hepatozyten Wartung Medium.
13. Übertragen Sie für die Waschschritt die Platte zum Waschen Dock, aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen und fügen Sie 400 µL Wartung Medium hinzu.
14. Initiieren Sie fließen in die Richtung nach unten mit 1 µL/s für 3,5 min. Aspirat alle Mittel, die auf der Federseite zum Tank hin der Brunnen.
15. Fügen Sie 1,4 mL der Hepatozyten Wartung Medium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO_{2 hinzu}, übertragen Sie die Platte in die docking-Station und initiieren Sie fließen in die Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 48 h (Abb. 1f) zu.
    Hinweis: Für Hepatozyten Monokulturen verwendet als Steuerelemente für Kokulturen, um kontrollierten Bedingungen zu gewährleisten wird eine zweite Art von Wartung Medium verwendet, das ist spezifisch für den Einsatz in Kokulturen mit primären menschlichen Kupffer Zellen. 48 h nach dem Austausch der Hepatozyten Aussaat Medium mit Hepatozyten Wartung Medium (3.Tag nach Aussaat), das regelmäßige Hepatozyten Wartung Medium ersetzt werden, mit Coculture Wartung Medium II, vor allem in Monokulturen PHH im Vergleich zu Kokulturen PHH und Kupffer Zellen als die Mittelkomponenten unterscheiden sich geringfügig.

(3) Auftauen und Aussaat von Kupffer Zellen und Hepatozyten für Ko-Kulturen

1. Um einen genauen Vergleich der Ergebnisse zu gewährleisten, immer vergleichen Sie PHH/Kupffer Zelle Kokulturen zu PHH Monokulturen
2. Für Kokulturen PHH und Kupffer Zellen Auftauen ein Fläschchen von Kupffer Zellen in fortgeschrittenen Dulbeccos Adlers Medium (AdDMEM) ohne Dexamethason geändert aber ergänzt durch primäre Hepatozyten Auftauen und Beschichtung ergänzt (Coculture Aussaat Medium) gemäß zu den Anbietern Anweisungen. Führen Sie das Auftauen und Aussaat der Kupffer Zellen und Hepatozyten in einer Klasse II-Kabinett.
3. Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL Coculture Aussaat Medium und zählen Sie die Zellen verwenden Trypan blau. Stellen Sie sicher, dass die Lebensfähigkeit der Zellen über 90 % liegt.
4. Halten Sie die Zellen auf dem Eis vor der Aufnahme in die Brunnen, Zelladhäsion zu vermeiden.
5. Folgen Sie den Anweisungen in Schritte 2.1-2.3 für das Auftauen des primären humanen Hepatozyten.
6. Transfer der äquilibriert und komplett montierten Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen.
7. Fügen Sie 60.000 Kupffer Zellen und/oder 600.000 Hepatozyten in jede Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 250 µL des Coculture Aussaat Medium.
8. Initiieren Sie Strömung in Richtung bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s nach unten zu, und fügen Sie 900 µL Coculture Aussaat Medium in jede Vertiefung.
9. Übertragen Sie die Platte in die docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂.
10. Fließen in die Richtung nach unten mit einer Durchflussrate von 1 µL/s für 8 h, gefolgt von Flow Umkehr der Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 8 h zu initiieren.
11. Übertragen Sie die Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen.
12. 400 µL Coculture Wartung Medium hinzufügen ich (AdDMEM ohne Dexamethason aber ergänzt mit Hepatozyten Wartung Ergänzungen) zu jeder gut und initiieren fließen in die Richtung nach unten mit einer Durchflussrate von 1 µL/s für 3,5 min.
13. Aspirieren Sie alle Mittel aus der Federseite zum Tank hin und 1,4 mL Coculture Wartung Medium ich in jede Vertiefung.
14. Übertragen Sie die Platte in die docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂ und initiieren Sie fließen in die Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 48 h zu.
15. Übertragen Sie die Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen. Fügen Sie 400 µL Coculture Wartung Medium II (Williams E Medium ohne Dexamethason aber ergänzt mit 100 nM Hydrocortison und Hepatozyten Wartung Ergänzungen) und initiieren Sie fließen in die Richtung nach unten mit 1 µL/s für 3,5 min zu.
16. Aspirieren Sie alle Mittel, die auf der Federseite zum Tank hin der Brunnen.
17. Fügen Sie 1,4 mL Coculture Wartung Medium II und übertragen Sie die Platte in die docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂zu.
18. Fluss in der Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 48 h (Abbildung 1e) zu initiieren.
19. Ersetzen Sie das Medium alle 48 h mit Coculture Wartung Medium II. Um sicherzustellen, dass alle Mittel in den Brunnen ersetzt wird, führen Sie einen Waschschritt vor der Zugabe von frischem Medium.
20. Waschen, übertragen die Platte zum Waschen Dock, aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen, und 400 µL Coculture Wartung Medium II hinzufügen.
21. Initiieren Sie fließen in die Richtung nach unten mit 1 µL/s für 3,5 min. Aspirat alle Mittel, die auf der Federseite zum Tank hin der Brunnen.
22. Übertragen Sie die Platte in die docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂fügen Sie 1,4 mL Coculture Wartung Medium II und initiieren Sie Strömung in der Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 48 h (Abb. 1f) zu.

4. Herstellung von eine infektiöse Hepatitis B-Virus Infektion Studien

1. Führen Sie in diesem Abschnitt des Protokolls in einer Aufhaltestufe III Lab. Aussaat, mittlere Veränderungen, mittlere Sammlung und Viruskonzentration in einer Klasse II Schrank zu tun.
2. HBV-produzierenden Zellen (z. B. HepDE19, HepAD38)-Kultur in Kollagen beschichtet T1000 5-lagigen Flaschen in 120 mL komplette DMEM/F12 (10 % FBS, Penicillin/Steptomycin nichtessentiellen Aminosäuren, 500 μg/mL G418 und 1 μg/mL Tetracyclin) bis 90 % Konfluenz erreicht.
3. Ändern Sie das Medium auf Induktion Medium (komplette DMEM ohne Tetracyclin) um die HBV-Produktion induzieren.
4. Sammeln Sie das komplette mittlere Volumen alle 48 h für 12 Tage nach dem Rücktritt von Tetracyclin und speichern Sie es bei 4 ° c
5. Filtern Sie die gesammelten Mittel durch einen 0,45 µm Flasche Top Filter.
6. Sterile PEG 8000 in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis die gesammelten Mittel bis eine Endkonzentration von 4 % w/w, mischen durch invertieren 8 x-10 X, und bei 4 ° C für 16 h Zentrifuge bei 10.000 X g für 1 h bei 4 ° C zu sammeln die PEG ausgefällt Virus und Aufschwemmen inkubieren Das Pellet in PBS mit 10 % FBS.
7. Kombinieren Sie die PEG ausgefällt Virus aus allen Ernte Zeitpunkten und auf einem 20 % Saccharose Kissen Schicht. Zentrifugieren Sie bei 140.000 X g für 16 h bei 4 ° C mit einer SW28-Rotor.
8. Aspirieren Sie überstand und Aufschwemmen Sie das Pellet in PBS mit 10 % FBS und aliquoten ergänzt und bei-80 ° c lagern
9. Bestimmen Sie die HBV-DNA-Kopie Anzahl anwesend im Überstand von HBV-DNA qPCR (Schritt 6).

5. 3D Kulturen mit HBV-Infektion

1. Durchführen Sie Infektionen in einer Klasse II Schrank innerhalb einer Aufhaltestufe III Labor.
2. 3 Tage nach der Aussaat die Monokulturen oder Kokulturen, die erforderliche Anzahl von HBV-haltigen Aliquote bei Raumtemperatur auftauen und die erforderlichen Virus-Dosis bei 1,8 mL Hepatozyten Wartung Medium oder Coculture Wartung Medium II pro Bohrloch, bzw. zu verdünnen.
3. Dieser 1,8 mL verdünnte Virus ist ausreichend für die Waschschritt (400 µL) und den Ersatz des Mediums in den Brunnen (1,4 mL). Die erforderlichen Multiplizität der Infektion muss jedoch entfallen die endgültige Kulturvolumen von 1,6 mL eingestellt werden.
4. Übertragen Sie die Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen. Fügen Sie 400 µL des HBV-haltigen Medium hinzu und initiieren Sie fließen in die Richtung nach unten mit 1 µL/s für 3,5 min. Absaugen zu, alle mittleren erscheinen auf der Seite Reservoir der Brunnen.
5. Hinzugeben Sie 1,4 mL HBV-haltigen Medium/Coculture Wartung mittlere II pro gut und übertragen Sie die Platte in die docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂. Fließen in die Richtung nach unten mit einer Durchflussrate von 1 µL/s für 8 h, gefolgt von einer Umkehr in der Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s zu initiieren.
6. 24 h nach dem Hinzufügen des HBV, übertragen die Platte zum Waschen Dock und aspirieren Sie alle Mittel aus den Brunnen.
7. Waschen Sie alle gut in die Platte 3 X mit dem entsprechenden Medium, je nach Art der Kultur wie in beschrieben Schritte 2.12 – 2.14, um übrig gebliebene Virus aus dem Brunnen zu beseitigen. Im Gegensatz zu Schritte 2.12 – 2.14 fügen Sie 1,6 mL Medium in jeden gut Konto für extra Volumen zu untersuchenden Inokulum Übertrag (Abbildung 1 g) auszuschließen hinzu.
8. Im Anschluss an diese Waschschritte sammeln Sie 200 µL Medium aus jedem Brunnen, die vollständige Entfernung des Inokulums HBV durch Quantifizierung der extrazellulären HBV-DNA zu bestätigen.
9. Übertragen Sie die Platte auf der Docking-Station in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und mit 5 % CO₂und initiieren Sie fließen in die Richtung nach oben bei einer Durchflussmenge von 1 µL/s für 48 h zu.
10. 48 h später sammeln die komplette gut Volumen für nachgelagerte Analyse, gefolgt von drei Wäschen mit Hepatozyten Wartung Medium wie in Schritten 2.12 – 2.14 beschrieben. Ersetzen Sie das Medium und waschen Sie jeweils gut 3 x alle 48 Std. bis zu experimentellen Beendigung zu.

(6) Quantifizierung der extrazellulären HBV-DNA

1. Isolieren Sie die Gesamt-DNA aus der Kultur-Überstände nach den Anweisungen des Herstellers mit dem Zusatz von 1 µg des Trägers RNA in einer Aufhaltestufe III Labor um die Virus-Inaktivierung in den Proben vor dem Verschieben auf einen anderen Bereich zu gewährleisten.
2. Bereiten Sie einen master-Mix mit quantitativen PCR-master-Mix, 600 nM forward Primer, 600 nM-rückwärts-Primer, und 300 nM der Sonde.
3. Fügen Sie den master-Mix in jede Vertiefung ein 384-Well-Platte 7 µL.
4. Fügen Sie 5 µL DNA-Proben in Duplikat, eine keine-Template-Kontrolle und Duplikate von seriell verdünnt HBV Genom-haltigen Plasmid-basierten Standard (z. B. pCMV-HBV) von 10⁹ Kopien pro Reaktion auf 10² Exemplare pro Reaktion in jede Vertiefung des die qPCR Platte.
5. Legen Sie eine selbstklebende Abdeckung über der Platte und sicherstellen Sie, dass jeder richtig gut abgedichtet ist.
6. Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 300 X g.
7. Starten Sie die qPCR gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Die Zyklus-Bedingungen für Real-Time PCR sind 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min.
8. Die Anzahl der HBV-DNA-Kopien innerhalb der unbekannten Proben nach der Standardkurve zu quantifizieren.

(7) Quantifizierung der intrazellulären HBV Pregenomic (Pg) RNA

1. Gesamt-RNS von Gerüsten nach den Anweisungen des Herstellers zu isolieren. Um vollständige Zelle Lysis zu gewährleisten, Wirbel jedes Gerüst 3 X für 30 s gefolgt von Zentrifugation bei 300 X g für 1 min zwischen jedem aufschütteln. Führen Sie die Zelle lyse in die Aufhaltestufe III Labor um die Virus-Inaktivierung in den Proben vor dem Verschieben auf einen anderen Bereich zu gewährleisten.
2. Transkribieren Sie cDNA aus der isolierten RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Die Zyklus-Bedingungen für die Retrotranscription sind 25 ° C für 10 min, 120 min, 37 ° C und 85 ° C für 5 Minuten.
4. Halten Sie die cDNA-Proben bei 4 ° C für kurzfristige oder bei-20 ° C für die langfristige Lagerung.
5. PgRNA und RPS11 mit quantitativen PCR master-Mix und forward und reverse Primer für PgRNA und RPS11 (verwendet als Housekeeping-Gene) auf eine Endkonzentration von 0,2 µM bereiten Sie master Mischungen vor.
6. Fügen Sie 7,5 µL des master-Mix und 2,5 µL cDNA pro Bohrloch auf einem 384-Well-Platte. RPS11 und PgRNA jeder Probe in zweifacher Ausfertigung zu messen und eine keine-Template-Kontrolle gut für beide Gene enthalten.
7. Legen Sie eine selbstklebende Abdeckung über der Platte und sicherstellen Sie, dass jeder gut abgedichtet ist.
8. Zentrifugieren Sie die Platte für 1 min bei 300 X g.
9. Legen Sie die Platte in der qPCR-Cycler und starten Sie die qPCR mit quantitativen PCR Standardprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Die Zyklus-Bedingungen für Real-Time PCR sind 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 2 min, von 40 Zyklen von 95 ° C gefolgt für 15 s und 60 ° C für 1 min.
10. Den Ausdruck des PgRNA im Vergleich zu RPS11 zu berechnen.

8. die Immunfluoreszenz Färbung des viralen Antigens

1. Entfernen Sie den Sicherungsring aus dem Brunnen und entfernen Sie das Gerüst mit der Pinzette in einer Klasse II-Kabinett im Containment Level III Labor zu.
2. Befestigen Sie die Zelle-haltigen Gerüste mit 4 % Paraformaldehyd in 1 mL PBS für 30 min bei Raumtemperatur in die Aufhaltestufe III Lab. Die folgenden Schritte können in einem anderen Bereich durchgeführt werden.
3. Waschen Sie die Gerüste 3 X mit 1 mL PBS.
4. Permeabilize der Zellen mit 0,1 % Triton X-100 in 1 mL PBS für 1 h bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die Gerüste 3 X mit 1 mL PBS.
6. Block unspezifischen Bindung durch Inkubation von Gerüsten mit 1 % BSA in 1 mL PBS 16 h bei 4 ° C.
7. Waschen Sie die Gerüste 3 X mit 1 mL PBS.
8. Führen Sie Primärantikörper Färbung mit Kaninchen Anti-Hepatitis B Virus Core Antigen bei einer Verdünnung von 1: 200 in 1 % BSA in 1 mL PBS 16 h bei 4 ° C.
9. Waschen Sie die Gerüste 1 X mit 0,1 % Tween in 1 mL PBS (PBS-Tween) und 3 X mit 1 mL PBS.
10. Führen Sie Sekundärantikörper Färbung mit Ziege Anti-Kaninchen IgG (H + L) Kreuz adsorbiert Alexa Fluor 594-konjugierten Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1:2,000 in 1 % BSA in 1 mL PBS 16 h bei 4 ° C.
11. Waschen Sie die Gerüste 1 X mit 1 mL 0,1 % PBS-Tween und 3 X mit 1 mL PBS.
12. Counterstain die Gerüste mit DAPI in 1 mL PBS in einer Konzentration von 2 µg/mL für 10 min bei Raumtemperatur.
13. Waschen Sie die Gerüste 1 X mit 1 mL 0,1 % PBS-Tween und 3 X mit 1 mL PBS.
14. Die Gerüste auf einen Objektträger übertragen und für die Bildgebung zu montieren.
15. Bild der Gerüste mit einem Fluoreszenzmikroskop.

9. Humanalbumin ELISA

1. Führen Sie in diesem Abschnitt des Protokolls in einer Klasse II Schrank in die Aufhaltestufe III Labor zugewiesen, wenn mit infektiösem Material arbeiten.
2. Um die Lebensfähigkeit und metabolische Funktionen der PHH bewerten, bewerten Sie menschliches Albumin-Produktion von ELISA.
3. Mantel-96-Well-Platten mit 50 µL pro Bohrloch Ziege-Anti-Human-Antikörpers verdünnt 1:800 Beschichtung Puffer (100 mM Bicarbonat/Carbonat, pH 9,6). Die Abdeckplatten und 2 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren
4. Aspirieren den Beschichtung Antikörper von der Platte und waschen Sie es 4 X mit 0,05 % 200 µL PBS-Tween.
5. Fügen Sie 200 µL blocking-Puffer (1 % BSA mit PBS-Puffer), Deckplatten Sie ab, und lang 1 h bei 37 ° C inkubieren Sie oder bei 4 ° C für 3 Monate aufbewahren. Für die langfristige Lagerung 0,05 % Natriumazid hinzufügen des blockierenden Puffers.
6. Aspirieren den blockierenden Puffer und 1 X mit 200 µL von 0,05 % waschen PBS-Tween.
7. Fügen Sie 50 µL zuvor verdünnten Proben pro Bohrloch (1: 100). Das Beispiel Verdünnungsmittel enthält 1 % BSA in 0,05 % PBS-Tween. 1 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren
   Hinweis: Brüten Sie die Standards zur gleichen Zeit wie die Proben. Einen Konzentrationsbereich von 500 – 0.488 ng/mL (1:2 serielle Verdünnungen) wird empfohlen. Führen Sie alle seriellen Verdünnungen von Humanalbumin in Probe Verdünnungsmittel.
8. Aspirieren Sie die Proben von der Platte und waschen Sie es 4 X mit 0,05 % 200 µL PBS-Tween.
9. Fügen Sie 50 µL HRP-konjugierten Ziege Anti-Human-Albumin Antikörper zuvor verdünnt 1: 10.000 in Probe Verdünnungsmittel. 2 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° c inkubieren
10. Aspirieren den Antikörper von der Platte und waschen Sie es 6 X mit 0,05 % 200 µL PBS-Tween.
11. 100 µL der TMB Reagenz und, sobald die höchsten Standards voll entwickelt sind, hinzufügen 100 µL 1 M H₂SO₄ bis die kolorimetrischen Reaktion zu stoppen.
12. Lesen Sie die Extinktion bei 450 nm auf einer 96-Well-Platte-Leser für die Analyse.

10. Interleukin (IL) 6 und Tumor-Nekrose-Faktoren (TNF)-α-Produktion in 3D Ko-Kulturen

1. Führen Sie in diesem Abschnitt des Protokolls in einer Klasse II Schrank in die Aufhaltestufe III Labor zugewiesen, wenn mit infektiösem Material arbeiten.
2. Quantifizieren Sie die IL6 und TNF-Produktion um die Funktionalität und Rentabilität der primären Kupffer Zellen zu bewerten. Um die Produktion dieser Zytokine von Kupffer Zellen induzieren, behandeln Sie Kokulturen mit 1 µg/mL Lipopolysaccharid (LPS) 9d mittelfristig Coculture Instandhaltung II für 48 h nach Aussaat.
3. Am Tag 11 nach dem säen, ernten Sie das Medium aus jedem Brunnen und bei-80 ° c lagern
4. Messen Sie die IL6 und TNF Konzentration in das Kulturmedium, durch einen entsprechenden Test und gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Wir beschreiben eine einfache und vielseitige Plattform für die langfristige Kultur der primären menschlichen Kupffer Zellen bzw. Hepatozyten und deren Infektion mit HBV. Primären humanen Zellen sind auf Kollagen-beschichtetem Polystyrol Gerüste in einer mikrofluidischen Platte Baugruppe ausgesät, die kontinuierlich die Zellen mit Wachstumsmedium (Abbildung 1a) perfuses.

PHH, die in der Regel nur stabil für eine begrenzte Zeit in herkömmlichen Kultur-Systeme sind, kann funktional für längere Zeit aufrechterhalten werden. Humanalbumin, die wird von funktionellen Hepatozyten sezerniert und gilt als den besten Marker für die Bewertung der hepatischen Metabolismus, äußert stabil und hoch von 3D Kulturen bis Tag 40 Post-Aussaat (Abbildung 2). Für Kokulturen können Kupffer Zelle Funktionalität und Rentabilität durch die Sekretion von bestimmten Zytokinen (z. B. IL6 und TNF) ausgewertet werden. Produktion von Zytokinen zu messen, empfiehlt sich die Verwendung von Capture-basierte Erkennung nach LPS-Stimulation der Kokulturen (Abbildung 3).

Zellen bilden hepatische Microtissues, in der Regel innerhalb 3 Tagen nach der Aussaat von PHH, demonstrieren funktionelle Galle Canaliculi und vollständige Zelle Polarisation (Abbildung 2). Neben der Beibehaltung ihrer physiologischen Zellstoffwechsels, werden diese Kulturen besonders anfällig für HBV-Infektion. HBV-DNA und anderen viralen Markern, im Gegensatz zu anderen Kultur werden leicht nachweisbaren vom 2. Tag nach der Infektion (Abbildung 4). Neben sekretierten Marker der viralen Infektion, Hepatozyten-haltigen Gerüste aus den Kulturen abgerufen und für die Immunfluoreszenz-Erkennung von viralen Antigenen verwendet werden können (z. B. HBsAg, HBcAg) (Abbildung 4). Wo herkömmliche Hepatozyten Kulturen erfordern Inokulation mit mindestens 500 HBV GE pro Zelle und die Zugabe von 2 % DMSO und 4 % PEG, so wenig wie 0,05 HBV GE sind in der Lage, die Infektion in 3-d-Kulturen ohne das Erfordernis von DMSO oder PEG (Abbildung 4) zu initiieren.

Abbildung 1: Aufbau des 3-d-Leber-on-a-Chip-Kulturen. (ein) ist dies ein schematischer Aufbau für die Montage der Kultur-Platte um die Schaffung von mikrofluidischen Zirkulation zu gewährleisten. (b) dieses Panel zeigt eine Nahaufnahme der Kultur Brunnen, darunter das Filterpapier, Gerüst und Sicherungsring. (c) dieses Panel zeigt den Prozess der Platte Gleichgewichtherstellung vor der Aussaat der Kulturen. Die nächsten beiden Fenster zeigen den Prozess der Aussaat für Hepatozyten Monokulturen (d) und (e) Hepatozyten/Kupffer Zelle Kokulturen. (f) zeigt dieses Fenster die Waschschritte mittlere Veränderungen. (g) dieses Panel zeigt die HBV-Infektion Einrichtung, einschließlich der Beseitigung des Inokulums. S.M. = Aussaat Mittel, M.M. = Wartung Mittel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: hepatische Microtissue Bildung und Hepatozyten Lebensfähigkeit. (ein) dieses Panel zeigt längs Hellfeld Bilder 3D Hepatozyten Monokulturen demonstrieren Microtissue Bildung nach Aussaat. (b) dieses Panel zeigt Immunfluoreszenz Bildgebung der Kulturen für die Zellkerne (blau) und Humanalbumin (grün). (c) dieses Panel zeigt längs insgesamt Albumin, sowie pro Zelle angepasst Albumin Produktion in 40 Tagen von Hepatozyten Monokulturen, wie mittels ELISA bestimmt. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± SD Diese Zahl wird von Ortega-Prieto Et Al.⁴angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Kupffer Zelle Funktionalität in 3-d-Kokulturen. Diese Tafeln zeigen die Sekretion von (einem) IL6 und (b) TNF in Hepatozyten Monokulturen und Hepatozyten/Kupffer Zelle cocultures 11 Tage nach Aussaat in Reaktion auf exogen hinzugefügt LPS am 9. Tag Post Aussaat, wie menschliche magnetische anhand Luminex-Assay. Diese Zahl wird von Ortega-Prieto Et Al.⁴angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: HBV-Infektion in Leber-on-a-Chip Kulturen. (ein) zeigt dieses Fenster die Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Erkennung von HBcAg (rot), HBsAg (grün) und Zellkerne (blau) 10 Tage nach der Infektion der Kulturen mit HBV. (b) zeigt dieses Fenster die Anfälligkeit der Kulturen gegen HBV-Infektion mit verschiedenen Mannigfaltigkeiten der Infektion, wie durch eine Quantifizierung der HBV-DNA in die Kultur Überstände bestimmt. (c) zeigt dieses Fenster die Quantifizierung der longitudinalen Anhäufung von HBV PgRNA bezogen auf das Zimmermädchen gen RPS11. Die angezeigten Daten sind Mittelwert ± SD Diese Zahl wird von Ortega-Prieto Et Al.⁴angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der langfristigen Kulturen der PHH haben die Entwicklung der verschiedenen Kultur-Modelle mit erhöhter Funktionalität und Langlebigkeit, jeweils ausstellenden differenzierte vor- und Nachteile vorangetrieben. Es ist jetzt weithin anerkannt, dass statische 2D Kulturen der PHH bestimmte Aspekte der Hepatozyten Biologie für sehr begrenzte Zeit imitiert werden. So Micropatterned cocultures^12,13, Sphäroid Kulturen^14,15, und 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen^16,17 sind diese grundlegenden Systeme ersetzen. Vor allem bei Infektionskrankheiten, die mit ihrem Wirt zu bestimmte Mikroumgebungen nutzen Weiters haben studieren, ist die Voraussetzung für die Bereitstellung von physiologischen Umgebungen durch die oft anspruchsvollen Art der Kultivierung menschlichen-Tropic untermauert. Infektionskrankheiten, einschließlich Hepatitis-C-Viren, HBV und Malaria.

Der wichtigste Schritt bei der Durchführung von 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen ist die Qualität der ursprünglich aus der Region Primärzelle Typen. Diese Zellen sollten für ihre Einhaltung Kapazität getestet und nur plateable PHH viele sollte verwendet werden, um erfolgreiche Gewebebildung und Kultur-Generation zu gewährleisten. Obwohl frisch isolierte PHH verwendet werden kann, ihre Kryokonservierung ist in der Regel kompliziert und erfordert spezielle Rate gesteuert Gefriergeräte.

Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen 2D Kulturen Host genetischen Hintergrund ist in Bezug auf Anfälligkeit für HBV-Infektion vernachlässigbar, und alle-bisher getesteten Hepatozyten Spender sind HBV-Infektion⁴herstellen.

Obwohl Patienten abgeleitet HBV-Infektionen des 3D Kulturen herstellt, ist es unerlässlich, PEG-ausgefällt zu nutzen und Saccharose Kissen-gereinigte HBV wann immer mit induzierbaren HBV-Produzent-Zelle für die Generation der viralen Impfkulturen Zeilen. Zelle Kultur Überstände direkt angewendet, 3D Leber-on-a-Chip-Kulturen, sei es durch das Vorhandensein von hemmenden Faktoren oder aufgrund einer Inkompatibilität des vorliegenden Wachstumsfaktoren mit Hepatozyten, führen nicht ohne weiteres Infektion. Darüber hinaus sollte bei der Auswahl der Patienten abgeleiteten viraler Impfkulturen nur Serum verwendet werden, da Plasma unweigerlich gerinnt und die mikrofluidischen Zirkulation der Kultur-Plattform verstopft.

Unabhängig von der viralen Inokulum verwendet ist zelluläre Lebensfähigkeit und Differenzierung zu gewährleisten, sowie eine vollständige Entfernung des ersten HBV Inokulums Schlüssel zum erfolgreichen Infektion Langzeitstudien. Der bequemste Weg, dies zu tun ist nach der Beseitigung der viralen Inokulums sowie die Messung der menschlichen Serum-Albumin Niveaus während der gesamten Kultur Kulturen Probenahme. Der Hinweis, ähnlich wie bei allen anderen beschriebenen Plattformen, HBV-Infektion, einmal etabliert, verbreiten nicht ohne weiteres auf nicht infizierten Zellen. Der zugrunde liegende Mechanismus dafür bleibt schwer fassbar, da HBV-Infektion in-vivo bereitwillig den Großteil der Hepatozyten in der Leber infiziert.

In Bezug auf Kokulturen PHH und Kupffer Zellen ist es ratsam, viel Tests von Kupffer Zellen, IL6 und TNF-Sekretion in Reaktion auf die LPS Stimulation zu bewerten, da nicht alle im Handel erhältlichen Kupffer Zelle Spender eine gleiche Reaktionsfähigkeit haben durchführen.

Wichtig ist, für alle medikamentöse Behandlungen oder erste Kulturen mit HBV-Infektion, muss das Gesamtvolumen des Brunnens (1,4 mL), sowie ab der Mikrofluidik-Kanal (0,2 mL), berücksichtigt werden bei der Berechnung der Droge oder Inoculum Konzentrationen. Um eine genaue Dosierung zu gewährleisten, wird ein Waschschritt mit HBV oder Drogen-haltigem Medium durchgeführt, um den Kanal mikrofluidischen prime.

Die verwendeten Plattform nutzt 600.000 PHH pro Bohrloch, die vielschichtige Hepatozyten innerhalb der Gerüste gewährleistet. Obwohl die Anzahl von Zellen variiert werden kann, sorgt für die gewählten Zellkonzentration optimale Ergebnisse. Das Plattenformat hält insgesamt 12 Gerüste, die zu 36 Gerüste erweitert werden kann. Ist jedoch aufgrund der mikrofluidischen Anforderungen skalieren zu höheren gut Zahlen nicht möglich bis heute.

Mit diesen Ansätzen können Kulturen mit optimalen Zellleistung mindestens 40 Tage lang gepflegt werden bietet, bisher nie da gewesene Möglichkeiten, neuartige Medikamenten-Kandidaten zu bewerten, als auch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen hepatischen Zellen zu studieren Populationen während der HBV-Infektion.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Arbeit wurde von einem Starter Stipendium des European Research Council (637304), ein Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), und CN Bio Innovationen finanziert.