Method Article
Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.
פיתוח תא T תוך-הרתי דורש meshwork תלת-ממדי מורכב מורכב מתאי סטרומה שונים, כלומר, תאים שאינם-T. Thymocytes לעבור פיגום זה בצו של זמן ומרחב מתואם מאוד בעת שעברה ברצף נקודות בדיקת חובה, כלומר, מחויבות שושלת תא T, ואחריו דור רפרטואר קולט תא T ובחירה לפני יצואם לפריפריה. שני סוגי תאי התושב גדולים ויוצרים פיגום זה הם תאים בקליפת המוח (cTECs) והלשדיים הרתי אפיתל (mTECs). תכונה מרכזית של mTECs היא הביטוי המופקר כביכול של אנטיגנים-מוגבל רקמות רבות. אנטיגנים-מוגבל רקמות אלו מוצגים לה בוסר thymocytes במישרין או בעקיפין על ידי mTECs או תאים דנדריטים הרתי, בהתאמה וכתוצאה מכך סובלנות עצמית.
דגמים מתאימים במבחנה חיקוי המסלולים ופונקציות ההתפתחותי של cTECs וmTECs הם Lac כרגעהמלך. זה חוסר מודלים ניסיוניים נאותים יש למשל הקשו הניתוח של ביטוי גנים מופקר, שעדיין הוא הבין היטב ברמה התאית ומולקולרית. מתאמנים את מודל 3D organotypic שיתוף תרבות לתרבות לשעבר vivo mTECs המבודד. מודל זה תוכנן במקור כדי לטפח קרטינוציטים בדרך כגון כדי ליצור מקבילה עור במבחנה. מודל 3D נשמר תכונות פונקציונליות מרכזיות של ביולוגיה Mtec: התפשטות (i) ובידול מסוף של CD80 lo, Aire-השלילי להיי CD80, mTECs Aire-החיובי, (ii) היענות לRANKL, וכן (iii) ביטוי מתמשך של FoxN1, Aire וגנים-מוגבל רקמה בmTECs היי CD80.
thymocytes פיתוח מהווה כ 98% מהתימוס, ואילו 2% הנותרים מורכב ממגוון רחב של תאים שביחד מרכיב את סטרומה הרתי (כלומר, תאי אפיתל, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאי B, fibroblasts, תאי האנדותל). התאים החיצוניים של קליפת המוח אפיתל (cTECs) להשיג הגירה של תאים פרו-T ממח העצם, האינדוקציה שושלת תא T בתאים טרום-T multipotent וסלקציה חיובית של עצמי MHC מוגבל thymocytes בשל. התאים הפנימיים הלשדיים הרתי אפיתל (mTECs) מעורבים באינדוקצית סובלנות של thymocytes אלה עם זיקה גבוהה TCR למתחמי פפטיד העצמי / MHC או על ידי בחירה שלילית התרמה או הסטייה שלהם לשושלת תא T רגולטורים. בהקשר של אינדוקציה סובלנות מרכזית, mTECs הם ייחודיים בכך שהם מבטאים מגוון רחב של-אנטיגנים עצמי מוגבל רקמה (Tras) כך שיקוף עצמי ההיקפית. תופעה זו נקראת ביטוי גנים מופקר (PGE)1,2.
המחקרים העדכניים ביותר בסוג התא מרתק זו מסתמכים על תאים מבודדים vivo לשעבר, כמו מערכות תרבות 2D לטווח קצר שונות הביאו תמיד בהפסד של PGE ומולקולות רגולטור מפתח כמו כיתת MHC II, FoxN1 וAire בתוך 2 הימים הראשונים 3-6 . זה נשאר עם זאת ברור, שרכיבים ותכונות של meshwork 3D שלם של בלוטת התימוס מסוימים היו חסרות במודלי 2D. התרבות מחדש צבירת הרתי האיבר (RTOC) לא הייתה כל כך הרבה במערכת רק 3D, המאפשרת חקר התפתחות תאי T, מצד אחד, וביולוגיה של תא סטרומה, ומצד שני, במייקרו-סביבת הרתי שלם 7. ובכל זאת, יש לי RTOCs מגבלות מסוימות, כלומר, הם כבר מכילים תערובת מורכבת של תאים, דורשים ההזנה של תאי סטרומה עובריים ולסבול תקופה תרבות מקסימלי של 5 עד 10 ימים.
חוסר רדוקציוניסט במערכות תרבות מבחנה עכב את המחקר שלכמה היבטים של organogenesis פיתוח התא והרתי T לפחות רגולציה לא המולקולרית של PGE והקשר שלה לביולוגיה התפתחותית של mTECs.
בשל הקרבה-ההתייחסות של הארגון המובנה של תאי האפיתל של עור והתימוס, בחרנו מערכת 3D תרבות organotypic (OTC) שפותח במקור כדי לחקות את הבידול של קרטינוציטים במבחנה ובכך ליצור מקבילה עורי. מערכת OTC מורכבת ממטריצת פיגום אינרטי מעולף עם fibroblasts עורי שלכודים בג'ל הפיברין, על שקרטינוציטים הם זורעים 8,9. כאן, החלפנו קרטינוציטים עם mTECs המטוהר. תוך שמירה על התכונות הבסיסיות של מודל זה, אנו מותאמים פרמטרים מסוימים.
במודל OTC אימץ mTECs התרבו, עבר התמיינות מסוף ומתוחזק זהות Mtec וPGE, מחקה וכך באופן הדוק בפיתוח mTECs vivo 10. הערה טכנית זה מספקת פרוטוקול מפורט המאפשר הגדרת השלבים של OTCs התימוס.
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של קרלסרוהה Regierungspräsidium. כל בעלי החיים שוכנו בתנאי הפתוגן ללא ספציפיים במרכז הגרמני לחקר הסרטן (DKFZ). לכל גורי עכבר ניסויי התרבות החל 1-7 ימים של גיל היו בשימוש.
1. בידוד של mTECs מקורנית
הערה: שלבי העיכול הבאים בוצעו כפי שתואר לעיל 1 בתנאים סטריליים עם כמה שינויים כדלקמן.
2. 3D Organotypic שיתוף תרבויות (OTCs)
הערה: בונה 3D-עורי לטיפוח organotypic של keratinocytes הוכן כפי שתואר לעיל 9,13. בכל צעדי תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. OTCs באמצעות mTECs הוכן עם שינויים קלים באופן הבא.
אנחנו אימצנו מודל 3D organotypic התרבות המשותפת (3D OTC) שפותח במקור לתרבות לטווח ארוכה במבחנה של קרטינוציטים 9. mTECs המועשר MACS (ראה איור תכנית העשרת MACS 1) היו זורעים על פיגום הכולל ג'ל הפיברין ופיברובלסטים בפח. Fibroblasts לספק המטריצה חיונית תאית (ECM) התומכת mTECs במבחנה. MTECs עובדו בOTCs ל4-14 ימים בנוכחות RANKL בתרבויות שקועות בניגוד קרטינוציטים, שהם מחקים את הסביבה שלהם in vivo (ראה איור תכנית הגדרת OTC 2) נחשף אוויר.
שני תת Mtec ניתח כאן (כלומר, CD80 הפלא וCD80 mTECs היי) שרדו במשך כל תקופת התרבות של עד 14 ימים. MTECs זוהו על ידי קרטין 14 ביטוי והיה בקלות להבחין בין fibroblasts vimentin-חיובי (איור 3A, 3B). מעניין לציין, mTECs בוגר והבשל גדל בדפוסים שונים בתרבות. CD80 lo mTECs נוצר בדרך כלל דו-שכבות (בקשר הדוק עם fibroblasts), בעוד mTECs היי CD80 נטה ליצור אגרגטים תא קומפקטיים מופרדים על ידי fibroblasts. דפוסים אלה היו מאוד לשחזור.
תת Mtec שרד לא רק, אלא גם התרבו בתנאי 3D OTC כפי שהוערך על ידי התאגדות edu (איור 3 ג, 3D). מעניין לציין, CD80 lo mTECs התרבו בשיעור גבוה יותר בנוכחות RANKL, בעוד ההפך היה נכון לmTECs היי CD80 10.
בנוסף, CD80 lo mTECs מובחן לmTECs היי CD80 בנוכחות RANKL בתוך 4 ימים של תרבות, כפי שצוין על ידי עד-הרגולציה החזקה של CD80. MTECs המובחן נשמר גם הביטוי של Aire, FoxN1 (גן ועמ 'rotein), כמו גם אבחנה הביע Aire-עצמאי ו-dependent Tras 10.
העשרת 1. MACS איור של Tecs. לאחר סינון, mTECs היו מועשר מהשעית התא בודדת התימוס באמצעות תא מגנטי מיון (MACS). ראשית, שושלות תאי hematopoietic היו מדולדלים באמצעות אנטי CD45-microbeads. CD45 - התאים אז הודגרו עם נוגדן אנטי CD80 PE, ואחריו נגד PE-microbeads. Eluate מכיל CD80 + -mature mTECs היה ישירות בתרבית על OTCs, ואילו זרימה דרך הכיל CD80 - mTECs בוגר ותאי סטרומה אחרים. MTECs היו מועשר נוסף באמצעות microbeads הנוגדן וstreptavidin אנטי EpCAM-ביו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תכנית להתקנה בשלבים של OTCs 3D. מטריצת פיגום הוצבה להוספת מסנן 12 גם. Fibroblasts עורי עור explanted (270,000 תאים / OTC גם) היו מחוסן לג'ל הפיברין (בהיקף של 1: 1 יחס של פיברינוגן ותרומבין). שווי עורי אלה שנגרמו ל4-5 ימים עם DMEM + חומרים מזינים עד mTECs (250,000 תאים / OTC גם) היו זורעים על גבי ותרבותי עם המדיום מועשר בחומרים מזינים שונים (rFAD + חומרים מזינים).
איור 3. דפוסי צמיחה והתפשטות של mTECs בתוך OTCs. CD80 lo mTECs המועשר נוטה לגדול כדו שכבתי בקשר הדוק עם fibroblasts (), ש"ש ereas לגדול mTECs היי CD80 המובחן כאגרגטים תא או אשכולות הדוקים (B). OTCs תויגו ביום 4 של תרבות עם 14 אנטי-קרטין (אדום) ונוגדנים נגד vimentin (ירוק), יחד עם כתמים גרעיניים (Hoechst, כחול). כדי להעריך את ההתפשטות של mTECs, OTCs היו פעמו עם edu (6.7 מיקרומטר / מיליליטר, כלומר, 10 מיקרומטר / טוב) עבור 4 שעות לפני הסיום של התרבויות. קריו-סעיפי OTC אז הוכתמו 14 אנטי-קרטין (ירוק), ותערובת תגובת edu-לחץ-IT (מגנטה) יחד עם כתמים גרעיניים (Hoechst, כחול). תמונות נציגם מתארים מתרבות edu + CD80 lo mTECs (C) וedu + CD80 mTECs היי (ד) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1. השוואה בין שתי מערכות תרבות הרתי 3D.
לצד RTOCs, OTCs 3D היה עדיף בהרבה על ידי במונחים של בידול TEC ותחזוקה / אינדוקציה PGE (טבלה 1) בהשוואה לאחרים (i) "תרבויות 3D פשוטות" באמצעות - fibroblasts לבד בלי הפיגום; (Ii) מערכות 2D באמצעות - תאי פיברובלסטים / מזין שיתוף תרבותי עם Tecs 10, (iii) תאי 3T3-J2 בי השיבוטים TEC לפתח, אבל PGE הולכים לאיבוד, (iv) matrigel או (v) רכיבי ECM (נתונים שלא פורסמו). PGE נשמר לעד 7 ימים בOTCs 3D, להיות נקודת הזמן האופטימלית לאחר מכן 4 ימים, PGE מתחיל לרדת. תכונות מורפולוגיות TEC אחרות נשמרו לעד 14 ימים. מעניין לגלות שOTCs נתמך בשלב הסופי של בידול Mtec ראה במבנים כמו Hassall-נוצרו לעתים 10.
Thymi משמש לOTCs נגזרו מעכברים לאחר לידה צעירה כמו שיש להם נטייה גבוהה יותר לשרוד בתרבות לעומת thymi המבוגר. Tecs נגזר הלוך ושובעוברי מ 'thymi עדיין לא נבדק בOTCs. יותר מכך, לאחר תקופה הארוכה העיכול (לא באמצעות טריפסין בשל מחשוף של אפיטופים מסוימים) התאים הופיעו קיימא יותר באמצעות MACS ולא תאי מיון FACS. שימוש בפרוטוקול העשרה חיובית שני שלבים בעמודות MACS (חרוזים אנטי-PE) של טוהר TEC השתפר גם CD80 + mTECs.
להתקנת OTC זה חיוני כדי לוודא ושיסקוזה, חומר סיבי לא ארוג היא לחתוך לעיגולים חדים, מסומנים היטב בלי שברים רופפים או משוננת קצוות כאמור לעיל שיתאימו בדיוק ל -12 מוסיף גם התרבות. לחלופין, יכולים לשמש גם פיגומים כגון מגב ויסקוזה BEMCOT- M-3 (http://www.bemliese.com). הגודל כן לOTC הוא גם קריטי וצריך להיבדק, אם יש להשתמש בפורמטי צלחת אחרים מאשר פורמטי 6 היטב ו- 12 היטב.
ג'ל הפיברין צריך להיות מוכן באופן שרכיבי פיברינוגן ותרומבין לא מגיעים לאנשי קשרלא אחד עם השני לפני שנקבע על OTC, הקפד להחליף את קצה פיפטה. מערבבים את שני מרכיבים יסודי בצלחת מעל הפיגום ליצירת משטח עליון חלק. תמיד להכין ג'ל מבחן לצד ובללא פיגום כדי לבדוק היווצרות קריש דם תקינה ויש הערכה טובה של הזמן הדרוש לקרישת. ודא כי ג'ל הפיברין בOTC יש קרוש לחלוטין לפני אספקת התרבויות עם תקשורת.
עם סיום התרבויות mTECs זרע יכול להאסף בקלות על ידי עיכול אנזימטי (collagenase / dispase) של הג'ל הפיברין, אשר יכול לשמש לאפיון של mTECs התרבותי למשל, על ידי cytometry זרימה או PCR.
יש OTCs 3D המתואר במסמך זה הפוטנציאל ללמוד או לתפעל מספר פרמטרים TEC כלומר: 1) ללמוד ו / או לתפעל (באמצעות siRNA, oligos morpholino) מסלולים ופונקציות ההתפתחותי של mTECs; 2) כדי ללמוד את התפקיד של mTECs בתא T לפתחment; 3) לcTECs התרבות; 4) על מנת לבחון את פוטנציאל האב של תאי גזע המופק הרתי; 5) לTecs אדם התרבות ותאי גזע; 6) לבצע מבחני משובטים TEC יחידים. 3D OTCs מייצג טכניקת תרבות משוכללת חיקוי חלק מin vivo microenvironment התימוס. יודגש כי כל מבחני נוספים להחיל Tecs בהתקנת OTC הנוכחי יצטרכו להיבדק ביסודיות ומותאמת בנפרד.
המחברים מצהירים שום ניגוד כספי או מסחרי של עניין.
This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium “Tolerage”, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-Württemberg.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pregnant C57BL/6 mice | Charles River WIGA | ||
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
CD45 Microbeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
Anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin) | Ref. 12 | ||
CD80-PE antibody | BD Pharmingen | 553769 | |
CD45-PerCP antibody | BD Pharmingen | 557235 | |
Ly51-FITC antibody | BD Pharmingen | 553160 | |
CDR1-Pacific Blue | Ref. 15 | ||
Keratin 14 antibody | Covance | PRB-155P | |
Vimentin antibody | Progen | GP58 | |
Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-003 | |
Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 106-546-003 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes (Invitrogen GmbH) | A-11008 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Invitrogen | C10339 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10425 | |
12-well filter inserts (thincerts) | Greiner bio-one | 657631 | |
12-well plate | Greiner | 665180-01 | |
Jettex 2005/45 | ORSA, Giorla Minore, Italy | ||
Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno | Baxter | ||
PBS | Serva | 47302.03 | |
DMEM | Lonza | BE12-604F | |
DMEM/F12 | Lonza | BE12-719F | |
HEPES | Gibco | 15630-049 | |
FBS Gold | GE Healthcare | A11-151 | |
Aprotinin (Trasylol) | Bayer | 4032037 | |
Cholera toxin | Biomol | G117 | |
Hydrocortisone | Seromed (Biochrom) | K3520 | |
L-ascorbic acid | Sigma | A4034 | |
TGF-ß1 | Invitrogen | PHG9214 | |
RANKL | R&D systems | 462-TR-010 | |
Thermolysin | Sigma Aldrich | T-7902 | |
OCT Compound | TissueTek | 4583 | |
Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction) | Invitrogen | 10296028 | |
FastPrep FP120 | Thermo Scientific | ||
Collagenase Type IV | CellSystems | LS004189 | 0.2 mg/ml and 57U/ml final conc. |
Neutrale Protease (Dispase) | CellSystems | LS002104 | 0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc. |
DNase I | Roche | 11 284 932 001 | 25 µg/ml final conc. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved