Assay הפשוט לכימות חברתיות הימנעות ב

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

מטרתה של שיטה זו היא לכמת היבט חדש של התנהגות פשוטה חברתית בmelanogaster דרוזופילה, עצמאית מחיזור ותוקפנות בקלות.

אינטראקציות חברתיות הן קריטיות להתפתחות התקינה ובריאותו של אדם בחברה, כמו גם את הפונקציונליות של קבוצה חברתית בכללותו. המורכבות גבוהות של אינטראקציות אלה מחייבים גדלי מדגם גדולים ומערכת המאפשרת לפישוט של ההתנהגות כבסיס הגנטי ועצבי של התנהגות חברתית עדיין לא נחקרו מספיק. Melanogaster תסיסנית הוא מודל גנטי רב עוצמה שיכול לשמש לזיהוי הגנטי ו בסיסים עצביים של אינטראקציות חברתיות. ואכן, ד ' יש melanogaster רפרטואר של התנהגויות חברתיות מורכבות וכמה מדידות ישירות של סוציאליזציה כבר נעשו ^1-7. עם זאת, רוב המאמצים האלה כבר התמקדו התנהגויות חברתיות מורכבות יחסית, כגון aggresאינטראקציות sive ^3,6, היבטים שונים של חיזור ^3,8-12, וכיצד משפיעים על התנהגויות חברתיות ניסיון אחרים כגון למידה, או קצב היממה ^13-17. בנוסף, רב של מבחני אלה מסתמכים על ניתוח דפוסי אינטראקציה מורכבים של קבוצות של זבובים, באמצעות מעקב וידאו ותוכנת מחשב כדי לנתח את השפע של נתונים וכתוצאה מכך. ניתוח כזה הוא לא יסולא בפז, ולהוביל לתובנות חדשות וחשובות כמו הדינמיקה של אינטראקציות לטוס לטוס בקבוצות ^7. מגבלה אחת, לעומת זאת, היא הנגישות של מבחני אלה לקהילה בכללותה, והידע המוגבל של המנגנונים העומדים בבסיס הכרה של אחרים. במילים אחרות, הבסיס של הפליטה של אות על ידי אדם אחד וההכרה שלה על ידי אחר עדיין הבין היטב ^18.

בניגוד לכך, זבובים גם תערוכת התנהגות פשוטה, הימנעות חברתית, שבו אנשים להתרחק מאות הנפלטת על ידי זבובים הדגישו: ד Melanogaster מתח odorant או DSO ^19. בassay תפוקה גבוהה, התנהגות זו ניתן לכמת כהימנעות מאות מתח הנפלטת על ידי זבובים אחרים, או הימנעות חברתית ^19. זבובים ממוקמים במנגנון T-מבוך וניתנו להם האפשרות להימנע מבקבוקון המכיל DSO. שימוש assay זה, CO ₂ הוצג להיות מרכיב של DSO, וחלק מהמעגלים העצביים ההכרחיים להגיב ל- CO ₂ היו גזורים ^19.

Assay ההימנעות החברתי שהוצג כאן הוא דומה מבחינה רעיונית למבחני התנהגות הפשוטים שפותחו במעבדתו של סימור Benzer שאפשרו דורות של חוקרים לנתח התנהגויות מורכבות ^20. ניתוח של הימנעות חברתית יכול להתבצע בצורה חסכונית באמצעות assay T-המבוך, ומאפשר למחקר נרחב יותר של התנהגות חברתית. לדוגמא, באמצעות assay זה אנו הוכיחו לאחרונה כי יש לי סיכונים גנטיים שונים לאוטיזם השפעות מנוגדות בb החברתיתמבחני ehavior. מוטציות לגן מועמד לאוטיזם - neurobeachin ^21,22 - ליקויים הנוכחיים הן במרחב חברתי (שתוארו במקום אחר ²³⁾ והימנעות חברתית ^24. איתות דופאמין חריגה היא גם הציעה לשחק תפקיד באטיולוגיה של אוטיזם בבני האדם ^25,26. בניגוד לתוצאות שהושגו עם neurobeachin, מצאנו כי ביצועי הימנעות חברתיים היו מושפעים מעלייה או הירידה ברמות של דרוזופילה לפוחי מונואמין Transporter (VMAT) בתאי דופאמין, למרות שהמרחב חברתי הראה המתאם גבוה לרמות של ²⁷ VMAT אלה. התוצאות המנוגדות שהושגו עם neurobeachin וVMAT מדגישות את האפשרות של זיהוי צורות שונות של התנהגות א-סוציאלית, ובכך circuitries העצבי הבסיסי שונה ויסות התגובה לאחרים.

1. ציוד וריאגנטים שנוצרו בבית (ראה רשימה של חומר לאחרים)

1. הכן מנגנון הרדמה קרה תסיסנית לבצע עבודת זבוב.
   1. חותך גיליון פוליאתילן נקבובי כדי לכסות קופסא קטנה מפלסטיק (12.7 סנטימטרים, רוחב 10.2 סנטימטרים), בדרך כלל את המכסה העליון של תיבת טיפים פיפטה (12.7 סנטימטר, רוחב 10.2 סנטימטר, 3.8 סנטימטרים עומק).
   2. למלא את התיבה עם קרח כתוש, מכסה בגיליון פוליאתילן הנקבובי.
2. הכן מנגנון T-מבוך; להתאים את המנגנון שתואר קודם לכן בפרטי ^28-31.
3. הכן aspirator לטוס כמתואר ^32.
4. הכן מנגנון תגובת Phototaxis לעקור זבובים ובמתוך בקבוקוני מבחן בלי לחץ:
   1. השתמש במנגנון נגדי, כפי שתואר על ידי ^29,33.

הערה: גם T-המבוך יכול לשמש למטרות אחרות, כפי שתואר על ידי ^28.

5. ודא Homתנאי תאורת ogeneous: לבצע את הניסוי על ספסל מכוסה בכיסוי ספסל לבן, ומול לוח לבן.
   הערה: בניסויים אלה, זנים לטוס השתמשו היו דרוזופילה melanogaster wild-סוגים: קנטון-S, אורגון וסמרקנד עף ממניות המעבדה שלנו ^34; זבובי אלווד נאספו בסתיו 2011 בשכונת אלווד של הנטינגטון, בלונג איילנד, ניו יורק, ארה"ב.

2. הכנת הזבובים לפני הניסוי

1-2 ימים לפני ביצוע הניסוי:

1. לשמור על זבובים בקמח תירס-אגר-מולסה-שמרים בינוניים סטנדרטי של 25 מעלות צלזיוס בשעתי אור 12 / מחזור כהה.
2. לאסוף את הזבובים מגיבים בהרדמה קרה 1-2 ימים לפני ביצוע הניסוי
   1. העבר את הזבובים מהבקבוקים שבו הם הועלו לצינורות 50 מיליליטר פלקון, תוך שימוש במשפך.
   2. מניחים את הצינור הבז עם הזבובים מתחת לרמת קרח, לדלי קרח מבודד.
   3. מניחים את מנגנון ההרדמה הקר עם קרח כתוש ב-4 ° C לצנן.
   4. חכה 5 דקות לזבובים להיכנס לתרדמת צינה.
   5. העבר את הזבובים על גיליון פוליאתילן הנקבובי של מנגנון ההרדמה הקר.
   6. לאסוף את הזבובים מגיבים על מנגנון ההרדמה הקר. ב RT, תחת סטראו, להפריד גבר בן 3-7 ימים מזבובים נשיים ולשמור על זבובים אלה בקבוצות של 40.
3. לאסוף את זבובי פולט 1-2 ימים לפני ביצוע הניסוי.
   1. בעדינות לאסוף מעורב-מין קנטון-S עף מהבקבוקים שלהם, באמצעות aspirator פה, שליטה על מספרם.
   2. לשמור על זבובים אלה בקבוצה של 60-100, כפי שיהיה קרינה.
   3. הכן דגימות רבות של קרינה כנקודות הנתונים דרושות.
4. אפשר לפחות לילה של התאוששות לאחר איסוף המגיבים והקרינה, כדי למזער את ההשפעה של בלבול ההרדמה הקרהואוסף הפה aspirator על התנהגות.
5. פתח את התיק של בקבוקוני בדיקה, כדי לאפשר לאוויר ריח פלסטיק המעופש בתיק להיות מוחלף על ידי אוויר צח, לפחות יום 1 לפני הניסוי.

2 שעות לפני ביצוע הניסוי:

6. ודא שהטמפרטורה בחדר שבו הניסוי מתבצע היא סביב 23-25 ​​מעלות צלזיוס, עם אפילו אור, ולחות מעל 30%.
7. העבר את המגיבים וזבובי פירות קרינה לתוך צלוחיות מזון טריות על מנת להבטיח כי זבובים אלו אינם מורעבים.
8. בואו זבובי הפירות להסתגל לסביבה לשעה 2, על הספסל שבניסוי יבוצע.

3. ביצוע הניסוי החברתי ההימנעות

1. לבצע כל ניסוי באותו הזמן של היום, בטווח של 3-4 שעות בשעתי אחר הצהריים בין הפעם צייטגבר ZT5 וZT9.
2. הנח את T-המבוך על משטח הכתישה, ולהדק את הבורג קליפ כל כך tהוא המעלית הוא יציב.
3. העבר את הזבובים מגיבים לתוך בקבוקון בדיקה טרי. הצמד בקבוקון זה מכיל את הזבובים מגיבים על החלק העליון של T-המבוך.
4. שיפוע מנגנון T-המבוך והקש עליו על המזרן ההולם כל כך זבובי הפירות נופלים במעלית.
5. הזז את החלק העליון של המעלית כלפי מטה, כך הזבובים הם בין החלק העליון ותחתון של T-המבוך, אבל לשים לב כדי לשמור על המעלית מעל נקודת הבחירה - כדי למנוע הזבובים לברוח.
6. להשיג בקבוקונים עם DSO (ראה סעיף 5 ליצירת בקבוקוני DSO-החופשי שנכבשו בעבר על ידי זבובים).
   1. בעוד הזבובים מגיבים להסתגל לסביבה חדשה זו, למקם את זבובי הפולט בבקבוקון מבחן.
   2. מניחים פיסת צמר גפן כדי לסגור את הבקבוקון כך זבובי פירות שלא יברחו.
   3. מכאני להתסיס בקבוקון זה על מיני-מערבולת כדלקמן: מערבולת במשך 15 שניות, הסר את הבקבוקון מהמערבולת במשך 5 שניות. חזור 3 פעמים עבור הסכום כולל של 55 שניות.
   4. ראםאובת זבובי הפולט מתוך הבקבוקון הטרי - על ידי העברה בבקבוקון מזון - ועד מהרה את מקום הבקבוקון זה מילא DSO לאחת משני צידי מכשיר T-המבוך.
   5. החלף את הצד של מיקום לבקבוקון מולא DSO בכל סיבוב חדש.
7. הנח בקבוקון מבחן טרי בצד השני של T-המבוך האחר.
8. להביא את המעלית לגמרי, כך זבובי הפירות יכולים לבחור בין בקבוקון בדיקה הטרי ובקבוקון הבדיקה עם DSO, ולהתחיל את הטיימר.
9. בואו הזבובים לבחור בין הבקבוקון הטרי ובקבוקון DSO, 1 דקות, אלא אם צוינו אחרת.
10. לאחר 1 דקות, להעביר את המעלית עד להפריד את הזבובים בבקבוקון הטרי, בקבוקון DSO, ואלה תקועים במעלית.
11. לספור את מספר הזבובים בכל בקבוקון, ובמעלית.
12. חזור על פעולה זו עבור כל גנוטיפ / מצב.

4. ניתוח נתונים החברתי ההימנעות

1. לספור את מספר זבובי פירות בכל בקבוקון לכל חנוטype, ולהעביר את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
2. שימוש בתוכנת גיליונות אלקטרוניים, לחשב את מדד ביצועים (PI) עבור כל גנוטיפ על ידי הפחתת מספר הזבובים בבקבוקון DSO ממספר הזבובים בבקבוקון DSO-חופשי, ולאחר מכן על ידי חלוקת המספר הכולל של זבובים.
3. שקלו את האמצעים "החוקרים הפרטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית לניתוח התוצאות.
   1. באופן אידיאלי, להכין 2-3 חזרות פנימיות עבור כל ניסוי, ו -3 חזרות עצמאיות, ביצע בימים שונים, עם בקבוקים שונים או חוצה ^30.
   2. השתמש במבחנים סטטיסטיים הפצת גאוס, כנתונים מתפלגים נורמלי.
   3. כאשר בודק השפעה אחד (כלומר, צפיפות - איור 2), להשתמש בכיוון אחד ANOVA, עם פוסט-מבחן להשוואה מרובה (עמודה על ידי טור), או מבחן t פשוט להשוות כל תוצאה לשליטה.
   4. כאשר ניסויי קבוצה מבוצעים, לבדוק שני תנאים ומינים (בקבוקונים ריקים, הדגישזבובים-הדגיש un ד; והשפעת מגדר - איור 1), באמצעות דו-כיוונית ANOVA.

5. צור בקבוקים כבושים בעבר על ידי זבובים unstressed - בצע במקום 3.5-3.6

1. השתמש Phototaxis להכין בקבוקונים שנכבשו על ידי זבובים שלא היה לחוץ, כביקורת.
2. העבר את הזבובים בבקבוקון בדיקה, והצמדת אותו למנגנון נגדי, עם בקבוקונים ריקים טריים במיקום ההפוך.
3. הנח את המכשיר בצורה אופקית עם בקבוקון דיסטלי ישירות מול אור מגניב-לבן 15 ניאון W, ולכסות בבד שחור.
4. בואו הזבובים בעדינות להזיז בבקבוקון הטרי. זה עלול לקחת כמה דקות. ברגע שרוב הזבובים הולכים לכיוון האור בבקבוקון דיסטלי, להפעיל את הטיימר דקות 1.
5. הוצא בעדינות את הבד השחור, לעבור את מיקומו של האור, להתאושש עם הבד השחור, ולאפשר לזבובים לעזוב את בקבוקון המבחן.
6. באותו זמן, אניnitiate ניסוי הבחירה כמו ב3.2-3.5. דלג על 3.6 ו -3.7.
7. הזז את המחוון של המנגנון, כדי להפריד את הזבובים שפינו את בקבוקון המבחן מהצד השני.
8. השתמש בבקבוקון המבחן שהתפנה בT-המבוך מייד לניסוי הבחירה, כמו ב3.7.

Assay ההימנעות החברתי הוא מבחן חזק כימות היכולת של דרוזופילה melanogaster להכיר אות מתח (DSO) הנפלטת על ידי זבובים אחרים, ובכך להעריך היבט אחד של אינטראקציות חברתיות. Assay מתבצע באמצעות מנגנון נפוץ במבחני התנהגות שונים המכונים T-מבוך, המציג את הזבובים עם בחירה בין שתי אפשרויות שונות - ימין או שמאל ^19,28-31. במקרה זה, את היעילות שבה הזבובים להימנע DSO היא לכמת על ידי חישוב והשוואת ביצועי מדדם (PI). PI של אפס מציין הפצה 50-50 או לא הימנעות, ואילו לצרכן של 100 מצביע על כך שכל הזבובים להימנע DSO. וPI של -100 היה מציין כי כל הזבובים נכנסו פנימה בקבוקון DSO.

הזבובים מוצגים עם בקבוקון המכיל DSO הנפלט על ידי זבובים מכניים נסערים, ובקבוקון אחד טרי (DSO-חינם). נציגי תוצאות שהוצגו כאן מדגישות את החוזק,שעות של assay זה, כמו גם כמה תנאים ידועים דרושים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

הימנעות מDSO היא לא מין ספציפי אבל תלויה בזבובים שהדגישו. המין של זבובים מגיבים אין כל השפעה על הימנעותם של DSO (איור 1). עם זאת, זה לא מספיק לזבובים שכבשו את בקבוקון הבדיקה כדי לעורר הימנעות מבקבוקון ש, הזבובים בוודאי הדגישו - במקרה זה נסער (איור 1) באופן מכאני. אם לא זבובים כבשו את בקבוקון הבדיקה, או אם הזבובים נכנסו ויצאו הבקבוקון בלי לחץ באמצעות Phototaxis, המגיבים לעורר אין העדפה כפי שדווח בעבר ^19.

למרות שהאיור 1 מתרבה תוצאות ידועות, הוא גם דוגמא לסוג של נתונים המתקבלים בתנאים תת-אופטימלי. עם רק 2 עד 5 חזרות פנימיות, ולא נערך מחקרים עצמאיים, הברים השגיאה מייצגים את הטווח. עם זאת, יש משמעותי שונהence בין הבקבוקונים הכבושים בעבר על ידי זבובים הדגישו וזבובים-הדגיש שאינם או ריק, כפי שדווח בעבר ^19. בהקשר זה, הזבובים עדיין להציג PI חזק של הימנעות. זה מדגיש את חוסנו של assay. בנוסף, PI לבחירה בין שני בקבוקונים טריים הוא שלילי (שונה מ -0, לp נקבות <0.05, p ונקווה מין <0.01). הדבר זה מצביע על העדפה לצד אחד של T-המבוך, או הטיה בשל גודל מדגם קטן. מגבלה זו יכולה להיות השיבה על ידי לסירוגין בצד שבו בקבוקון הבדיקה מושם על T-המבוך בחזרות הפנימיות, כפי שנעשה בניסויים הבאים מוצגים.

למרות חוסר השפעת המין בתגובה לDSO, מגיבים הופרדו לפי מין כדי למנוע תופעות של בלבול אפשריים. לדוגמא, במקרה של מוטציות שיכולות לגרום למין ספציפי, כגון אלה המשפיעים על גני המעורבים בריח איתות ^36. Representati הבא ve תוצאות להתמקד במגיבי גברים, ופולטי מין מעורבים.

הימנעות מDSO אינה תלויה במספר הזבובים מגיבים נבדקו.

ניסויים קודמים ¹⁹ השתמשו סטנדרטי של 40 קנטון S-עף בבדיקת הימנעות חברתית, אשר הראתה PI גבוה, מצביע על כך שרוב הזבובים העדיפו את בקבוקון DSO נטול הטרי. כדי לבדוק את השפעת גודל קבוצה על PI של המגיבים, מגוון של 10-80 זבובים היה assayed, כפי שניתן לראות באיור 2. מינימום של שני ניסויים בלתי תלויים ושלוש חזרות פנימיות למשפט בוצע. מבחן t לא הראה מובהקות סטטיסטיות בהשוואה לצרכן של כל אחד מהמספר השונים של זבובים מגיבים למדד ביצועים של השליטה (ארבעים זבובים מגיבים). לפיכך, מספר הזבובים מגיבים אין כל השפעה על הצרכן של הימנעות DSO ועל ההשפעה שיש לי מוטציות על הימנעות ניתן לבדוק גם אם מוטציות זמינות במספרים קטנים.

כדי לקבוע את המידה שבה מספר זבובי פולט השפיע על DSO והימנעותה, אנחנו גם בדקנו את ההשפעה של כמות הזבובים הדגישו. בניסויים האחרונים ^19, ופרוטוקול זה, השתמש סטנדרטי של 70 זבובי קנטון-S. עכשיו בדקנו 10-160 זבובי פולט (איור 3). הביצועים של הימנעות קשור ישירות למספר פולטים, על אף שאין גידול בהימנעות עם יותר מ -80 קרינה. מעניין, הימנעות משמעותית עדיין מזוהה עם רק 10 הדגישו זבובים. שוב, זה יאפשר בדיקת יכולות הפליטה של ​​כמה זבובים בכל פעם.

רקע גנטי משפיע על ביצועי הימנעות DSO.

דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל חזק למחקרים גנטיים. כך זה היה חשוב כדי לקבוע אם assay יכול לשמש כדי discriminate רקע גנטי שונה. התגובה של ארבעה סוגים שונים פראיים נמדדה (קנטון-S, אורגון-R, סמרקנד ואלווד) ביחס להימנעות מDSO נפלטת על ידי קנטון-S (איור 4). יש לי קנטון-S ואלווד PI גבוה יותר בהשוואה לאורגון וסמרקנד (p <0.05). תוצאות אלו מראות כי יש מרכיב גנטי העומד בבסיס ההימנעות מDSO, ושיש לי assay זה את הכח לבצע מחקר של השפעה גנטית זו.

משך זמן בחירה להשפיע על ביצועים.

הקבוצה של נתונים נציג המוצגת באיורים 1, 2, 3 ו -4 גם להמחיש את ההשפעה של משך זמן שניתן למגיבים להחליט איזה בקבוקון הם נמנעים. כאשר ניתנים מגיבי קנטון-S 30 עד 45 שניות לבחור הבקבוקון המועדף עליהם, שהם בדרך כלל מגיעים להופעות ברחבי PI = 55 (איור 2, בהתאמה הזכרים PI= 57 ± 2; ו -52 ± 11). כאשר ניתנו 60 שניות, הביצועים שלהם הוא גבוהים יותר, כפי שניתן לראות באיור 4 (PI = 77 ± 6.5).

הימנעות איור 1. של DSO היא לא מין ספציפי אבל תלויה בזבובים שהדגישו. גרפים בר לייצג את מגוון ± הממוצע של PI של הימנעות מבקבוקון ריח המתח שהותיר זבובים נסערים (DSO). זכרים (באדום), ונקבות (כתום) נבדקו יחד (חום), ולאחר מכן ספרו לאחר הניסוי. הזבובים שבוצעו באופן דומה, ללא קשר למינם (דו-כיווני ANOVA). אבל הם נמנעו מבקבוקון מלא-DSO שבטס כבר הדגיש בעבר (באופן מכאני נסער), ולא בקבוקון שבזבובים לא היה הדגיש (רק כניסה ויציאה מהבקבוקון ידי Phototaxis, p <0.05, שלאחר ההשוואה מרובה של Tukey מבחן), או בקבוקון טרי (p <0.001, לאחר בדיקת ההשוואה מרובה של Tukey). בבנוסף, לא היו הבדלים סטטיסטיים בין הבקבוקון הטרי ותנאים שאינם תנאים הדגישו-זבובים, למרות הטיה ניסוי הבקבוקון הטרי - n = 2-5 משכפל עם 40 מין מעורב עף כל אחד, עם זמן בחירה 45 שניות (n = 3 לטרי בקבוקונים, n = 2 לבקבוקון עם קבצים שאינם מתח, n = 5 לבקבוקון עם זבובים הדגישו).

הימנעות איור 2. של DSO אינה תלויה במספר הזבובים שנבדקו. נציגי נתונים מראה כי מספר הזבובים מגיבים קנטון-S בT-המבוך אין כל השפעה על הימנעות חברתית של DSO. זבובים מגיב ניתנו 30 שניות להחליט בין בקבוקון טרי ובקבוקון המכיל DSO (n = 2-6 חזרות פנימיות למשפט, 1-2 ניסויים, מינימום של 5 נקודות נתונים לכל מצב, גרפים בר לייצג ± SEM הממוצע)

מספר איור 3. מוגברת של קרינה מוביל להגדלת הימנעות DSO. נציגי נתונים מראה כי מספר זבובי פולט קנטון-S משפיע על DSO והימנעותה (הגדלת צל של צבע אדום מציין הגדיל מספר זבובי פולט, עם 70 משדרים שתוארו בכחול ). בהשוואה ל -70 קרינה, רק הבקבוקונים שהכילו 10 קרינה או באוויר הראו הבדל משמעותי בביצועים (עמ 'ANOVA חד-כיווני = 0.0001, לאחר בדיקת ההשוואה מרובה של Dunnett). הזבובים מגיבים 40 קיבלו 1 דק '. להחליט בין בקבוקון טרי ובקבוקון המכיל DSO (n = 3 חזרות פנימיות למשפט, 3 ניסויים בלתי תלויים, גרפים בר לייצג ± SEM הממוצע)

איור 4. בחירה זמן ורקע גנטי של זבובי פירות משפיעים על התגובה לDSO. קנטון-S וגנוטיפים אלווד להציג הימנעות חזקה של DSO מ אורגון וSamarkand (p <0.05 *, מבחן t השוואה לקנטון-S). זבובים מגיב ניתנו 1 דק '. להחליט בין בקבוקון טרי ובקבוקון המכיל DSO (n = 4-5 חזרות פנימיות למשפט, 2 ניסויים עצמאיים, גרפים בר לייצג ± SEM הממוצע)

פרוטוקול זה מתאר נוהל מפורט לassay ההימנעות החברתי. קנטון-S רק להימנע מבקבוקון שבטס כבר בעבר באופן מכאני הדגיש, וכי יחסי מין ומספר המגיבים אינם משפיעים על ביצועי שהימנעות חברתיים. עם זאת, רקע גנטי של המגיבים יש השפעה גדולה.

להלן כמה צעדים קריטיים לביצוע ניסוי זה בהצלחה: 1) תמיד להעביר את זבובי שעה 2 לפני הניסוי ולוודא שלא להפריע לסביבתם; 2) לבצע את הניסוי תמיד באותו הזמן של היום, באופן אידיאלי בין זמן צייטגבר ZT5 (שעות לאחר תחילת האור) וZT9 להפחית וריאציה בביצועים קשור לקצב היממה ווריאציה אפשרית ולכן ברמות תנועה והפעילות; 3) שים לב לתנאי הטמפרטורה ולחות בעת ביצוע הניסוי; טמפרטורה סביב C ° 23-25 ​​ולחות מעל 30% הן הטוב ביותר; 4) לוודא שלא דisturb מנגנון T-המבוך בזמן החלטת זבובים; 5) הקפד לאוורר את הבקבוקונים הטריים לפחות 24 שעות לפני השימוש בהם; ו 6) במהלך הניסוי חשוב תמיד לשנות את המיקום של בקבוקון המבחן במנגנון T-המבוך כדי להימנע מהעדפה לצד אחד של T-המבוך. למרות בדיקות נוספות צריכים לעשות כדי לאשר את זה, באופן אמפירי נראה כי DSO בורח בקבוקון "מתח" בפחות מ -5 דקות. בניגוד לכך, נראה כי זבובים מסוגלים לפלוט DSO עד שעה 1 לאחר שהדגיש.

ישנם מספר שיקולים שיש לקחת בחשבון בפרוטוקול. המתאם בין גיל הימנעות הזבוב וחברתי אינו ידוע כרגע. לכן, מומלץ לבצע את הניסוי ללא זבובים ישנים יותר משני שבוע של 25 מעלות צלזיוס, כמו שינויים בהתנהגות הקשורות להזדקנות אינו מופיעים לפני גיל ³⁷ ש. זבובי הזדווגו (מינים מעורבים שוכנו) נאספים לניסוי כלא ידוע איך פליטת DSO מושפעת ממעמד ההזדווגות של הזבובים. למרות שתפוקת ההתנהגות של הימנעות DSO אינה מושפעת מיחסי מין, חשמלי במוח הבסיס עשוי להיות מיני דימורפית, ורצוי לא לערבב זכר ונקבת זבובים. לבסוף, ירידה במספר של פולט עפה מובילה לירידה בהימנעות, ככל הנראה קשורה לירידה בDSO הכולל הנפלטת. עם זאת, מספיק DSO עדיין קיים עם רק 10 זבובים, שמוביל להימנעות חזקה ושחזור.

הפחתה של זמן החלטה של ​​הזבובים מגיבים מ -60 שניות ל -30 שניות, גם תוצאות הפחתה של PI לקנטון-S זבובים. זה יכול לשמש ככלי ללהיפלות לתנאים או מוטציות שבטסו ביצועים טובים יותר מאשר קנטון-S. לפיכך, במצבו הנוכחי, assay ההימנעות החברתי יכול לשמש כפרדיגמה התנהגותית כדי לבדוק את ההשפעה של גנים והסביבה בהימנעות DSO. לאחר השליטה בטכניקה, צעדים שניתן לנקוט בעתידלשלב את זמן החלטה האידיאלי להימנעות DSO ומספר זבובי פולט שיש להשתמש כדי לקבל את assay ההימנעות החברתי לעבוד בצורה אופטימלית המדויק.

מגבלה שהיה מתעוררת במוטציות בדיקה יכולה להתרחש אם יש לי המגיבים תנועה עניה. קביעה ניסיונית זמן ארוך יותר לבחירת מוטציות אלה עשויים לסתור תנועה עניה כזה. באופן דומה, עף עם ליקויים תחושתיים שימנעו זיהוי של CO ₂ - מרכיב עיקרי של DSO, או הרכיב לא ידוע האחר של DSO לא יוכל להיבדק בassay זה.

אין כרגע assay אחר המאפשר כימות של תגובה זו. למרות שזה היה הראה כי CO ₂ הוא רכיב של DSO ^19, רכיבים אחרים של האות, כמו גם נוירוטרנסמיטורים מעורבים בבחירה שנעשתה כדי למנוע אנשים הדגישו אחרים טרם נקבע. באופן דומה, המנגנון שמניע את לנשורs לפלוט DSO אינו ידוע. assay זה כרגע יכול לשמש כassay אבחון העליון ספסל נוסף לקביעת פרופיל ההתנהגות החברתית והכולל של מוטציה, או טיפול סביבה. לדוגמא, אפשר להשוות לעומת הכימות של מרחב חברתי, כלומר, המרחק לשכן הקרוב ביותר ^23, להימנעות החברתית של זבובים הדגישו. שני ההתנהגויות דורשות מגיבות לנוכחות של אנשים אחרים, וקבלת ההחלטה להתקרב או להימנע מהם. אלו הן דרכים עדיין חזקות מאוד פשוטות לנתח חשמלי במוח ונוירוטרנסמיטורים מעורבים. פרדיגמות התנהגות אלה יש גם פוטנציאל עצום לשימוש למטרות הקרנה.

The authors declare that they have no competing financial interests.

We thank Rachelle Kanippayoor for her help in identifying the new wild-type strain as being of the melanogaster species. R.W.F, O.F. and A.F.S were responsible for research design; R.W.F, M.N. and O.F. performed the experiments. R.W.F, M.N., O.F. and A.F.S. analyzed the data; R.W.F., I.S.M. and A.F.S. wrote the manuscript.

This work was supported by PSC-CUNY research awards, jointly funded by The Professional Staff Congress and The City University of New York to A.F.S.; by internal funding from Western University to A.F.S. and I.S.M.; by a training support from the National Alliance for Hispanic Health’s Alliance/Merck Ciencia (Science) Hispanic Scholars Program and a University Fellowship from the Yale Graduate School of Arts and Sciences to R.W.F.