Single-צמח, סטרילי מיקרוקוסמוס לNodulation וצמיחה של צמח הקטניות

צמיחה של צמחי truncatula Medicago בסימביוזה עם meliloti Sinorhizobium חיידקי חנקן כמו במיקרוקוסמוס הבודד, סטרילית עשויים מצלחות מעבדה סטנדרטיות מאפשרת בדיקה תכופה של מערכת שורשים וגושים בלי להתפשר על סטריליות. יכולים להישמר צמחים בתאי גידול אלה לתקופה של עד 9 שבועות.

חיידקי Rhizobial יוצרים גושים על השורשים של צמחי קטניות מארח תואמים סימביוטיים, תיקון חנקן. אחת ממערכות המודל הכי המפותחת לחקר אינטראקציות אלה הוא הצמח Medicago truncatula קורות חיים. Jemalong A17 וחיידק Sinorhizobium rhizobial meliloti 1021. הדמיה חוזרת ונשנית של שורשי צמח וניקוד של פנוטיפים סימביוטיים דורשת שיטות שאינן הרסניים לשני צמחים או חיידקים. פנוטיפים הסימביוטי של כמה צמחים ומוטציות של חיידקים לעין לאחר תקופות קצרות יחסית של צמיחה, ואינו דורשים תצפית ארוך טווח של האינטראקציה המארח / סימביונט. עם זאת, הבדלים דקים בפנוטיפים יעילות והזדקנות גולה הסימביוטי שאינם נראות לעין בשלבים המוקדמים של תהליך nodulation השלבים דורשים תקופות צמיחה ארוכות יחסית לפני שהם יכולים להיות קלע. כמה שיטות פותחו לצמיחה לטווח ארוך ותצפית של זוג המארח / סימביונט זה.עם זאת, רבים של שיטות אלה דורשים השקיה חוזרת ונשנית, דבר המגדילה את האפשרות של זיהום על ידי חיידקים אחרים. שיטות אחרות דורשות שטח גדול יחסית לצמיחה של מספר רב של צמחים. השיטה מתוארת כאן, צמיחה הסימביוטי של מ ' truncatula / S. meliloti במיקרוקוסמוס סטריליים, חד צמח, יש לו כמה יתרונות. לצמחים יש במיקרוקוסמוס אלה לחות וחומרים מזינים מספיק כדי להבטיח השקיה שאינה נדרשה לתקופה של עד 9 שבועות, מניעת זיהום צולב במהלך השקיה. זה מאפשר לפנוטיפים לכמת שעלולה לפספס במערכות צמיחה לטווח קצר, כגון עיכובים עדינים בפיתוח גולה גולה והזדקנות מוקדמת. כמו כן, הם צפו השורשים וגושים במיקרוקוסמוס קלות באמצעות מכסה הצלחת, אז עד-השתרשות של הצמחים לצורך ההשגחה אינו נדרש.

האינטראקציה בין truncatula הצמח פונדקאי קטניות Medicago A17 וחיידק rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 היא אחת ממערכות המודל הצייתניות ביותר ללימוד פיתוח גולה שורש וסימביוזת קיבוע חנקן. הגנום של שני בני הזוג הסימביוטי היה רצף ^1,2 וגם הצמח וחיידק נוחות ^ל3,4 מניפולציה הגנטי. ניתוח של פנוטיפים של שני צמחים וחיידקי מוטציות דורש היכולת להתבונן שלבי התפתחות גולה ולכמת את הפרודוקטיביות סימביוטיים לאורך זמן. כאן אנו מתארים שיטה להתבוננות בפיתוח גולה שורשו של מ ' truncatula קורות חיים. A17 Jemalong מחוסן עם ס ' meliloti 1021 בתוך מיקרוקוסמוס הבודד עשוי מרגיל, בקוטר 100 מ"מ עגול, צלחות מעבדה עמוקות 15 מ"מ (איור 1 א). לירות חשוף וצומח דרך פורטל מחורצים בצד השני של הצלחת (figures 1B, 1C, ו1E). שורשים נמצאים בתוך מיקרוקוסמוס והמשיכו סטרילי, תוך מתן אפשרות לתצפית באמצעות המכסה של הצלחת (1D איור). מאז הצילומים הוא נגישים, הצמיחה שלה אינה מוגבלת וניתן למדוד אותו בפרקי הזמן מבלי להתפשר על סטריליות של השורש. השיטה של יצירת מיקרוקוסמוס מחורצים הצלחת פותחה במקור על ידי לי, et al. ⁵ לגידול צמחי אספסת, אבל זה לא אומץ באופן נרחב למרות היתרונות הרבים שלה על פני שיטות אחרות. וריאציה על שיטה זו פותחה גם היא לניתוח של האינטראקציה בין שורשי צמח וmycorrhizae ^6. עכשיו יש לנו להתאים ומותאם בשיטה זו לצמיחתו של מ ' צמחי truncatula. היתרונות של פרוטוקול זה על פני יותר נפוץ שיטות מתוארים להלן.

ישנן מספר שיטות שנמצאות כיום בשימוש רחב ללימודי nodulation של מ ' truncatula inoculated עם ס ' meliloti ^7. השיטה הנפוצה ביותר להכנה בקנה מידה גדולה של שורשי nodulated היא צמיחה בcaissons aeroponic ^7. בשיטה זו, צמחים מושעים על כלי גדול ושורשי מוגזים בתערובת של ס meliloti ופתרון תזונתי ^7. שיטה זו היא מעשית אם רק אחד גנוטיפ של ס ' meliloti הוא להיבדק. מכיוון שהוא דורש aerosolization של ריכוזים גבוהים של חיידקים, יש הסתברות גבוהה של זיהום צולב בין caissons מחוסן עם זני חיידקים שונים. שיטה נוספת המשמשת לעתים קרובות כדי להכין כמויות גדולות של צמחים מחוסן היא צמיחה באמבטיות או סירים של פרלייט, vermiculite, חול או חימר calcined שהם חדורים עם פתרון תזונתי ומחוסן עם ס ' meliloti ^7. שיטה זו מחייבת שימוש באמבטיות או סירים פתוחים, ודורשת השקיה וחידוש מלאי של הפתרון התזונתי. חסרון נוסף של סירים הוא שצמחיםיש להסיר מן מטריצת חלקיקים זה לבחינה של השורשים וגושים. חסרון נוסף של שיטה זו הוא ששטח גדול של שטח חממה דרוש בעת ש 'רבים ושונה גנוטיפים meliloti הם להיות בהשוואה, בגלל סיר נפרד יש להשתמש עבור כל גנוטיפ חיידקים. "צנצנת לאונרד" היא וריאציה על ^8,9 בשיטה זו. צנצנת לאונרד מורכבת משני כלי מעוקרים נערמו אחד על גבי השני ומחוברים על ידי פתיל. מדיום גידול ממוקם בכלי הנמוך ונמשך דרך הפתילה ידי פעולת נימים לתוך מטריצת צמיחה של פרלייט, vermiculite, חול או חימר calcined בכלי העליון. השתיל (ים) ממוקמים במטריצת הצמיחה ומחוסנת עם ס ' meliloti. שיטה זו אינה דורשת השקיה, אבל בחינה של שורשים וגושים דורשת כי השתיל יוסר ממטריצת צמיחת החלקיקים.

ישנן מספר שיטות שמאפשרות בדיקה קלה של רוts. אחד מהם הוא "כיס צמיחת" פלסטיק השקוף ^7. חסרון של שיטה זו הוא שהשקיה תכופה נדרשת שכן רק ≤ 10 מיליליטר המדיום נוזלי הוא אופטימלי לגידול מ truncatula בשקיות ^7. ניסויי פאוץ גם בדרך כלל מוגבלים ל~ 2 שבועות ^7, עקב התמוטטות של פתיל נייר בתוך הכיס. שתי שיטות אחרות המשמשות בדרך דומות לשיטה שלנו שבצמחים גדלים על אגר והשורשים גלויים לעין, אך שיטות אלה יש גם חסרונות, כי ההליך שלנו נמנע. בשיטות אלה, צמחים כלולים לחלוטין בתוך 24.5 סנטימטר x 24.5 צלחות אגר סנטימטר אטום סביב החלק העליון עם קלטת כירורגית נקבובית או גדלו בצינורות אגר שיפוע פקוק עם תקעי כותנה או כובעי פלסטיק ^7. שתי שיטות אלה מאפשרים בדיקה קלה של שורשים ויכולים להישמר סטרילי. עם זאת, צינורות השיפוע אגר בדרך כלל גדלו עם רק 20 מיליליטר אגר בינוני ⁷ ודורשים השקיה ומזיןddition לצמיחה לטווח ארוך של צמחים. צמחים הגדלים בתוך 24.5 סנטימטר x יש לי 24.5 מיקרוקוסמוס הצלחת אגר סנטימטר לחות וחומרים מזינים לצמיחה לטווח ארוך מספיק, אבל לירות במהירות הגוברת הופך מוגבל בתוך המיקרוקוסמוס הצלחת הסגור וגז אתילן יכולים להצטבר עיכוב nodulation ^7. בהליך שתואר כאן, לירות חשוף וגדל באופן חופשי מחוץ למיקרוקוסמוס המכיל ~ 70 מיליליטר של תקשורת, המאפשר צמיחה לטווח ארוך.

ההליך המתואר כאן עשוי להיות שימושי לא רק ללימוד nodulation של צמחי קטניות, אלא גם לחקר פנוטיפים שורש של צמחים בגודל בינוני אחרים. ההבדל בין מיקרוקוסמוס אלה וצנצנת רקמות תרבות צמח פוליקרבונט מסורתית הוא כי שורשים במיקרוקוסמוס הצלחת מתוארים כאן גדלים על המשטח האנכי של אגר ולא למטה לתוך שכבה אופקית של אגר בתחתית הצנצנת. זה מאפשר לשורש שהמריא מהמשטח אגר עם ד המינימליamage לשערות שורש והידבקות מינימאלית של אגר אל פני השטח השורש, המאפשר הבחינה של שערות שורש על ידי מיקרוסקופ.

ביצוע שלבי 1, 2, 4, ו -6 בזרימה למינרית סטרילי מומלץ.

1. הכנתו של מ ' שתילי A17 truncatula

שים לב: מ ' זרעי truncatula A17 המשמשים במחקרים אלה מיוצרים בתנאי חממה מקוררים ב ~ 22 מעלות צלזיוס, או בחדר גידול צמחים נשמר ב-C ° 22-26 עם ~ 150-400 מילימול / מ ^-2 s ^-1 אור.

1. יוצקים צלחות נביטת זרעים: השתמש 100 מ"מ צלחות מרובעות (15 מ"מ עמוק) ויוצקים 1.1-1.2% autoclaved w / v מטוהר אגר ¹⁰ עד לעומק של 3-5 מ"מ. כל צלחת תשמש לנבוט ~ .25-0.5 גרם של זרעים (שווה ערך ל 63-125 זרעים / צלחת).
   שים לב: זה קריטי להשתמש אגר צמח תא נבדק תרבות, מטוהרת לכל הצלחות שתוארו בפרוטוקול זה. הספק ומידע מספר קטלוג לאגר מופיע בטבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים.
2. לשרוט / לעקר את מ ' truncatula A17 זרעs: לשקול זרעים מספיקים למספר הרצוי של שתילים. (מ 'truncatula A17 זרעים הם ~ 4 מ"ג כל אחת) זרעי מקום ב125 מיליליטר צלוחיות סטרילי עם מכסה בנייר כסף סטרילי (0.25-0.5 זרע g / בקבוק, זה ~ 63-125 זרעים) ופיפטה 20 מיליליטר של (96%) מרוכזים H ₂ SO ₄ בצדי הבקבוק.
   הערה: שריטת חומצה תהיה לעקר את הזרעים. כמו כן, על ידי pipetting החומצה לאורך הצדדים של הבקבוק, זה מחדש לעקר את החלק הפנימי של הבקבוק שבא במגע עם זרעי unsterilized.
3. לשבור את הגושים של זרע עם טפטפת זכוכית סטרילית. מערבולת כל בקבוק בתדירות גבוהה ל10-12 דקות. בורות קטנות, בצבע חום תהיה גלויות על הזרעים. אלה הם חורים זעירים במעיל הזרע ^11.
   הערה: משקפי מגן וכפפות בעת עבודה עם H המרוכז ₂ SO _4.
4. הסר H ₂ SO ₄ ולשטוף זרעים: כאשר לפחות 10% מהזרעים יש בורות קטנות בצבע חום, או 12 דקות חלפו, לפימגיע ראשון, להסיר את כל חומצה מהצלוחיות עם טפטפת זכוכית סטרילית. (חומצת בזבוז מקום לתוך מבחנה 1-2 L מכילה לפחות 300 מיליליטר מים ברז. זה יהיה לדלל את החומצה ולמנוע התחממות יתר.) הטה את הבקבוק כדי לאסוף את החומצה שנותרה בעקומה של הבקבוק ולהשתמש פיפטה זכוכית קטנה להסיר את כל החומצה שנותרה. אם חומצה יורית נשארה, הוא יגיב עם מי השטיפה, לחמם את הזרעים ולהרוג אותם.
   1. יש לשטוף את הזרעים על ידי שפיכה במהירות של המים ultrapure סטרילי 100 מיליליטר לכל בקבוק. הנפח העודף של מים יהיה לדלל את החומצה ולמנוע נזק התחממות יתר והזרע במהלך התגובה של החומצה עם המים. יוצקים את המים ולהבה לעקר את שפותיו של הבקבוק.
   2. יש לשטוף את הזרעים 8-10x עם 50 מיליליטר של המים ultrapure סטרילי. לערבל את הבקבוק במהלך כל שטיפה. הבקבוק צריך להיחשב סטרילי בשלב זה ואת השפה של הבקבוק צריכה להיות בערה לפני כל שטיפה.
5. בואו זרעים לספוג לילה: לאחר, השטיפה האחרונה לשפוך 50 מיליליטר מים ultrapure סטרילי לתוך בקבוק אחד, החלף את כיסוי נייר כסף סטרילי על כל בקבוק ומקום על 4 מעלות צלזיוס בלילה החשוך.
6. זרעים מניחים על צלחת נביטה:, לאחר זרעים לתת לספוג לילה לשפוך את המים, לשטוף 2x עם ~ 25 מיליליטר מים ultrapure, ולאחר מכן להוסיף 20 מיליליטר מים ultrapure סטרילי, מערבולת resuspend זרעים ושופכים אותם על 1.1-1.2% צלחת נביטה אגר מ צעד 1.1. אם זרעים נשארים בבקבוק, להוסיף יותר מים ושופכים שוב. הפץ את הזרעים מכל בקבוק לצלחת אחת (63-125 זרעים / צלחת).
   1. לערבל את הצלחת כדי להפיץ את הזרעים. הזרעים צריכים להיות מופצים באופן שווה בלהקת 4-5 סנטימטר בקצה אחד של הצלחת. זה יהיה "הראש" של הצלחת. 5-6 סנטימטר "התחתון" צריך להישמר נקי מגרעינים (איור 2 א).
   2. צייר את המים עם פיפטה סטרילית. הטה את הצלחת בזווית של ° 45 לתת לניקוז המים שנותר לתחתית הצלחת. החלף את המכסה על tilצלחת טד ולהגן מפני אור. יש לאפשר צלחות לניקוז 10-20 דקות. (איור 2).
7. הגדר את הנביטה: הסר את כל המים שנאספו בתחתית הצלחת הנטויה עם פיפטה סטרילית.
   1. החלף את המכסה ולאטום את הצלחת עם parafilm. יש להשתמש בכפפות ולשמור סטרילי (איור 2 ג).
   2. סטאק צלחות נביטה ולאחר מכן הפעל את כולם בזווית של ° 90. הזרעים יהיו מונחים על המשטח האנכי של אגר. זרעים ספגו באופן מלא צריכים בקלות לדבוק אגר. השורשים יגדלו כלפי מטה (איור 2 ד).
   3. עטוף את ערימת צלחות נביטה בנייר כסף כדי לחסום את האור ולשמור על 25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.

הערה: אם תמורת נביטה פחות מ 3 ימים, שורשים עשויים להיות קצרים מדי כדי להגיע לאגרה במיקרוקוסמוס. אם נביטה מתקיימת יותר מ -4 ימים לפני ההעברה לצלחות מיקרוקוסמוס, ההישרדות של שתיליםלהיות עני. אם מ ' ecotypes truncatula או מוטציות עם שיעורי נביטה איטיים יותר הן להיות בהשוואה, יש לאפשר ecotype לאט-הנובט לנבוט זמן רב יותר מאשר 3 ימים.

2. הכנת מיקרוקוסמוס פלייט פרט

1. להכין מדיום ¹² (ראה טבלת מס '1 לרכב), המאפשר למדיום של ג'נסן ~ 70 מיליליטר לכל מיקרוקוסמוס. הכן בכדים או צלוחיות, כי הם נוחים למזיגה מהירה (לא יותר מ 1-2 ליטר לקנקן) ולהשאיר את הבר ומערבבים מגנטי בקנקן במהלך מעוקר.
   1. , לאחר בינוני מתקרר ל~ 55-65 C °, תוספים שנוספו, וה-pH נבדקה (ראה טבלה 1) שופך לתוך קוטר 100 מ"מ עגול, צלחות עמוקות 15 מ"מ. צריכים להיות שפך צלחות ~ 0.9-1 סנטימטר (~ 70 מיליליטר / צלחת) עמוקה.
   2. רכיבים של המדיום של ג'נסן יכולים ליצור משקע עכור, ולכן חשוב להחזיר את הכד לצלחת ומערבבים המגנטי מעת לעת כדי למנוע רכיבים מהיישוב החוצה. משקעים עלולים להיות מולible בצלחת אחרי שהם לחזק, ואינם משפיעים על ביצועים, כל עוד הם מופצים באופן שווה בין הצלחות.
   3. סטאק צלחות במהלך לשפוך כדי למנוע היווצרות של עיבוי על המכסים בצלחת.
2. לאחר הצלחות של ג'נסן יש הקרושה, לחרוץ שני צלחות ומכסים עם מרית במשקל כי כבר כפופה ל( איור 3 א) ⁵ U-צורה. מחממים את העיקול של המרית עם מבער עד, צלחות חמות אדומות ברמה גבוהה 5-6 ולאחר מכן לחמם שוב. כאשר מכסה מחורצים מונח על צלחת מחורצים, זה ייצור פורטל סגלגל שדרכו לירות של השתיל יגדל (איור 3 ב). אם צלחות מחורצים הן להיות מאוחסנות, לעטוף בנפרד עם סרט פרפין ..

3. הכנת Sinorhizobium meliloti תרבויות

יומיים לפני החיסונים צמח, להתחיל תרבויות מכל ס meliloti מתאמץ להיות מחוסן על שתילים. Cultuמיל צריך להיות מבוגר בLBMC בינוני (לוריא-Bertani [מילר]) ¹³ תוספת 2.5 מ"מ MgSO _4, 2.5 מ"מ CaCl _2, ואנטיביוטיקה מתאימה (בינוני TY גם עובד היטב). קטן כמו 2-3 מיליליטר של כל תרבות יהיה מספיק.

1. לגדול ב30 ° C עם הרעד במשך 2 ימים עד התאים צפופים.
2. עבור רוב החיסונים צמח, את שלב הצמיחה של ס meliloti אינו קריטי. בדרך כלל, מאוחר להיכנס או תאי שלב נייחים מוקדם משמשים.

4. פריסת מ ' truncatula שתילים במיקרוקוסמוס הפרט

1. לאחר 3 ימים, פתח צלחת נביטה (מוכנה בשלב 1) ומייד להציף במי ultrapure סטרילי. טובלים מלקחיים באתנול ובקצרה להבה לעקר. שימוש במלקחיים סטריליים כדי לדחוף את עצות שורש כל השתילים בעדינות מתחת למים כדי למנוע התייבשות. שורשים ינועו בין 2-6 סנטימטר ארוך. הרוב יהיה 3-4 סנטימטר. בחר שתילים עם שורשים ישרים ולא ברוריםפגמים.
2. בדקו את המכסים של מיקרוקוסמוס הבינוני של ג'נסן להצטברות של עיבוי. פליק את המכסה כדי להסיר את העיבוי או להחליף אותו עם מכסה מחורצים חדש. אם יש עודף של עיבוי על המכסה, שורש השתיל עשוי לדבוק את המכסה ואז למות לאחר העיבוי מתייבש.
3. באמצעות המלקחיים, בעדינות להרים שתיל מצלחת הנביטה על ידי הפסיגים ולהניח את השורש במיקרוקוסמוס הבינוני של ג'נסן. ודא שקצה השורש הוא במגע עם אגר.
4. בעדינות להסיר את מעיל הזרע אם הוא עדיין קיים. מעילי הזרע צריכים להיות משוחררים לאחר השרייה במים ל5-10 דק '. בעדינות להקניט מעיל הזרע עם המלקחיים עד שהוא מפנה את מקומו, וזורקים. הפסיגים וכ 0.5 סנטימטר של לירות צריכים לבלוט החוצה של U-החריץ בצלחת (איור 4 א). בזהירות להחליף את המכסה של הצלחת עם U-החריץ של המכסה על השתיל, יצירת פורטל לשתיל (איור 4).הגדר צלחות בצד בערימות אופקית עד שכל השתילים הוצבו במיקרוקוסמוס.
5. השתמש בכל השתילים מכל צלחת נביטה שנראות בת קיימא ויש שורש ישר. (אם אפשר, להשאיר צלחת אחת של שתילים הסגורים לשימוש כתחליף לשתילים נבולים רק לפני החיסון.)
6. לאחר הנחת את כל השתילים, לאפשר להם לשבת על מיקרוקוסמוס של ג'נסן האופקי בעוד ס השעיות הבידוד meliloti נמצאים בהכנה.

5. הכנת ס השעיות הבידוד meliloti

1. בדוק ס meliloti תרבויות מעת לעת לאחר חיסון כדי להיות בטוח שהם גדלים. לאחר צמיחה של 2 ימים, ₆₀₀ OD צריכים להיות בין 2 ל 4.
2. פיפטה 0.5 מיליליטר של כל תרבות לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות לגלולה. הסר supernatant.
3. שטוף תאים פעמיים בשני 0.85% מים ultrapure NaCl או סטרילי סטרילי. Resuspend תאים בSTE 0.5 מיליליטר 0.85%להרגיז NaCl או מים ultrapure.
4. מדוד את OD של ₆₀₀ 1/10 דילול של ס resuspended meliloti תרבויות מצעד 5.3. בהתבסס על קריאה זו, להפוך את השעיה של כל תרבות במי ultrapure סטרילי בOD ₆₀₀ = 0.05. אם צפיפות התא גבוהה מדי, nodulation עשוי להיות מעוכב. לעשות מספיק של ההשעיה לדלל כדי שניתן יהיה מחוסן 100 μl על כל שתיל. עננות של ₆₀₀ = 0.05 ההשעיה OD צריכה להיות כמעט לא מורגשות על ידי העין.

6. חיסון ואיטום של מיקרוקוסמוס

1. בסמוך למועד חיסונים מתחילים, בדוק עבור שתילים נבולים שלא שרדו את המעבר למיקרוקוסמוס הבינוני של ג'נסן. להחליף שתילים אלו עם שתילים טריים מצלחות נביטה.
2. פתח כל מיקרוקוסמוס ולחסן של ס המתאים 100 μl meliloti השעיה על שורש השתיל. החזר את המכסה ומניח בצד בSTAC האופקיKS של 6-10 מיקרוקוסמוס. לכל ס זן meliloti להיות בהשוואה, לחסן לפחות 15 צמחים. לזנים שיש להם הבדלים דקים בפריון סימביוטיים, לחסן 30-35 צמחים. השאר לפחות 10 צמחים uninoculated כביקורת שלילית. לחסן 30-35 צמחים עם ס ' meliloti 1021 או זן פראי סוג מתאים אחר לשמש כביקורת החיובית.
3. לאחר ס ההשעיה meliloti יש לו זמן לספוג על פני השטח השורש ונוזל ההשעיה ספג לתוך אגר (לפחות 20 דקות.), לעטוף כל צלחת בנפרד עם סרט פרפין. צריכה להיות עטופות פלטות עד הקצה של החריץ, אבל סרט פרפין לא צריך לחסום את הצמיחה של השתיל (איור 4C).
4. בזמן הגלישה, לבצע בדיקה סופית לשורשים דבקו בחלק הפנימי של מכסה הצלחת. כדי להסיר שורשים דבקו מהמכסה, להניח את צלחת שטוחה על הספסל והקש או קפיצי המכסה לדפוק השורש בחזרה למטה, אל אגר surface.
5. בשורה פורטלי השתיל של כל ערימה של 6-10 צלחות. הנח את המחסנית בזווית של ° 90 עם השתילים מצביעים כלפי מעלה (איור 4D). הדביקות של סרט פרפין תחזיק את הצלחות במקום מספיק זמן כדי לעטוף את הערימה כולה בנייר כסף, והשאירה רצועת 1-2 סנטימטר באריזתו המקורית שבו השתילים לצוץ (איור 4E). הרדיד יהיה להגן על השורשים מפני אור.
6. מניחים את ערימות נייר הכסף עטוף בחדר צמיחה מואר או בחדר צמיחה ב21-25 ° C, 60-70% לחות יחסית ו100-175 ^-2 של μmol / מ ^-1 אור על חושך מחזור 16 שעות אור / שעה 8 ( איור 1 א). בתנאי גידול אלה, דגירה ממושכת ברמות אור ^-2 ים גבוה יותר מאשר 200 μmol / מ ^-1 יכולה להיות השפעה מזיקה על גידול צמחים.

7. בחינת שורש המערכות וQuantitation של פנוטיפים הסימביוטי

יכולים להישמר בצמחיםמיקרוקוסמוס לתקופה של עד 9 שבועות.

1. מספר גולה ניתן לכמת בסדרה של נקודות זמן על ידי מסיר את עטיפת נייר הכסף מכל ערימה ולספור גושים. פיתוח גושים על צמחים מחוסן עם ס ' סוג בר meliloti 1021 הם לכאורה על ידי 10-14 ימים לאחר חיסון.
2. הפרודוקטיביות הסימביוטי גם ניתן למדוד בכל נקודת זמן על ידי מדידת האורך של לירות המתעוררות.
3. quantitation הסופי של הפרודוקטיביות סימביוטיים מבוצע בדרך כלל בגיל 7 שבועות לאחר חיסון על ידי ניתוק לירות ומדידת המשקל הטרי של לירות. ניתן לבצע את הצעד הזה מאוחר ככל 9 שבועות אם צמיחה ארוכה יותר היא רצויה.

ההכנה וההרכבה של מיקרוקוסמוס הצלחת אלה היא פשוטים יחסית בהשוואה למרבית השיטות האחרות שתוארו במבוא. שימוש במיקרוקוסמוס אלה גם מאפשר צמיחה ממושכת צמח (עד 9 שבועות) ללא השקיה או בתוספים תזונתיים, שמירה על סטריליות שורש, הן בדיקה קלה של שורשים והגנה על השורשים מן האור, צמיחה בלתי מוגבלת של צמח יורה גישה קלה, לצילומים עבור מדידת אורך, והסרה של צמחים ממיקרוקוסמוס עם נזק מינימאלי לשערות שורש. איור 1 א מציג שתילים צעירים הגדלים במיקרוקוסמוס באינקובטור. התמונות בנתונים מראה 1B-1E כמה תצוגות שונות של מיקרוקוסמוס המכיל מ ' צמחי truncatula A17 מחוסן עם הסוג בר ס meliloti 1021. אם צפוף,> 220 מיקרוקוסמוס יתאים 73.8 סנטימטר x 67.5 מדף חממת סנטימטר. איורים 1B ומיקרוקוסמוס מופע 1C במחסנית עם צמחים המתעוררים מהפורטלים במיקרוקוסמוס עטוף בנייר אלומיניום. 1D איור מציג מיקרוקוסמוס יחיד עם הרדיד הוסר והשורש וגושים מראים דרך החלק הקדמי של הצלחת. איור 1E מציג את אותו מיקרוקוסמוס שוכב עם הצמח העולה מתוך הפורטל בצלחת. האורך לירות ניתן למדוד מנקודת היציאה מהמיקרוקוסמוס (איור 1 ג) מבלי להפריע למפעל. איור 5A מציג נתונים אורך לירות למ ' צמחי truncatula A17 מחוסן עם הסוג בר ס meliloti 1021 לעומת צמחי uninoculated בגיל 7 שבועות ו9 שבועות לאחר חיסון. הצמיחה במיקרוקוסמוס היא אידיאלית לאיסוף סדרה של נקודתי זמן של פיתוח גולה ואורך צילומים. בtimepoint הסופי, יורה נחתכים מחוץ למדידת משקל הטרי לירות (איור 5). איור 6 מציג דוגמאות של 3 פנוטיפים סימביוטיים בקופת 7 שבועותt-חיסון. הפרודוקטיביות סימביוטיים היחסית של מ ' צמחי truncatula A17 מחוסן עם ס 'שונה זני meliloti הוא לכמת לפי אורך לירות (איור 6 א) ולירות במשקל טרי (איור 6). מספר גושי שורש בצמחים מחוסן עם זנים אלה מוצג באיור 6C. צבע ורוד עקב הייצור של leghemoglobin מצביע על כך שגושים הם פונקציונליים ומסוגלים קיבוע חנקן, ואילו גושים לבנים קטנים הם בדרך כלל מתפקדים ו / או בוטל וגושים חומים הם מזדקנים ונימקים ^14-18. ההשוואה באיור 6 מראה כי הפרודוקטיביות הסימביוטי של מ ' צמחי truncatula A17 מחוסן עם ס ' meliloti 1021 נושאים את הפלסמיד pstb-LAFR5-exoY, שoverexpresses פופספוטרנפראז גלקטוז undecaprenyl פוספט ExoY, הוא גדול יותר מזה של סוג בר ס meliloti 1021 וזנים שנשאו ג השלילי ontrol פלסמיד pstb-LAFR5. זני להביע מעל אלה ExoY לייצר יותר של exopolysaccharide סימביוטיים succinoglycan מאשר זני השליטה. היכולת לכמת הבדלים בפנוטיפים הסימביוטי שלוקחים מספר שבועות כדי להגשים היא יתרון עיקרי של שיטה זו. לכל אמצעי הפרודוקטיביות סימביוטיים על M. truncatula A17, Sinorhizobium Medicae זני WSM419 וABS7 ביצועים טובים יותר מאשר ס meliloti 1021 (דמויות 6A-6C). (נתונים מהאיור 6 הופיעו במקור בג 'ונוס (2012) ^19.) בעת שהמיקרוקוסמוס הוא מפורק ולירות משקולות טריות נמדדים, יכולים גם להיות צילמו שורשים על ידי מיקרוסקופ. איור 7 מציג תצוגות נציגו של מ' truncatula A17 שורשים לאחר ההסרה ממיקרוקוסמוס. שערות השורש חוו נזק מינימאלי מאז השורשים שכבו על פני השטח של אגר והם לא משכבה אופקית של אגר מושרש עד.

טבלת 1. הפרוטוקול של ג'נסן אגר בינוני למיקרוקוסמוס צלחת. הוראות הכנה למדיום של ג'נסן.

צעדים:

1. להוסיף מעל מרכיבים, ולערבב עם בר ומערבב מגנטי.
2. דקות החיטוי 45, מחזור נוזלי, עם בר ומערבבים בקנקן.
   הערה: ₄ CaHPO וFeCl ₃ יזרזו במהלך מעוקר. מערבבים כדי לקבל אותם בחזרה להשעיה; תקשורת עדיין תישאר מעונן
3. מגניב עם ערבוב עד שזה לא כואב להרים את הכד עם ידיים חשופות.
4. הוסף 1 מיליליטר מינרלים לליטר (ראה בהמשך למתכון) מה עלי לעשותערבוב ile
   הערה: הקפד resuspend המשקע במינרלים לפני מחלק.
5. הוספת 0.25 מיליליטר 4 N NaOH לליטר, תוך ערבוב.
6. בדוק pH על ידי הסרת ~ 100 תקשורת μl עם פיפטה סטרילית ויישום לנייר pH
   הערה: ה-pH 5-10 נייר הטווח עובד היטב. pH צריך להיות ~ 7 אפשר כמה שניות לפיתוח בצבע מלא. אם ה-pH אינו נכונה, שאולי היה טעות הכנה.
7. יוצקים צלחות עבות ככל האפשר, רמיקס בקבוק על ידי חזרה לצלחת ומערבבים המגנטית
   הערה: אם צלחת היא יתר על המידה (כלומר הנוזל מבאס את על החלק התחתון של המכסה),
   הערה: מצפה לקבל ~ 15 צלחות לליטר.

מינרלי L מניית 1 (לעקר ידי מעוקר)

איור 1. צפיות של מיקרוקוסמוס המכיל צמחים מחוסן עם ס ' meliloti 1021) צמחים בצלחות מיקרוקוסמוס גדלה בחממה. ב ') מ' צמחי truncatula A17 מחוסן עם ס ' תצוגת meliloti 1021 סוג בר גדל דרך החריץ בחלק העליון של מיקרוקוסמוס אגר של ג'נסן. C) נוסף תקריב של הצלחות בB מראה גידול צמחים דרך חריצים במיקרוקוסמוס. ד ') אחד מצלחות מיקרוקוסמוס מ-B ו-C עם השורש גושי הדמיה באמצעות המכסה. ה) הצלחת הלוך ושובמ 'ד' בשכיבה עם לירות מתעוררים מהרמה הגבוהה ביותר.

איור 2. צלחת נביטת זרעי ההגדרה. א) זרעים מופצים על פני מחצית מ100 מ"מ צלחת מרובעת. ב ') משטח אגר מנוקז על ידי המאפשר למים כדי לאסוף בתחתית צלחת נטויה. C) צלחות עטופות בסרט פרפין, שנערמו וD) המחסנית פנה בזווית של 90 ^o ועטופה בנייר כסף.

איור 3. בניית מיקרוקוסמוס בחרוק הצלחות של ג'נסן עם מרית כפופה. א) מרית מתכת במשקל כי כבר התכופפה כדי ליצור אליפסה היא להבה מחוממת ומשמשת ללחרוץ חור בצורת U בצד השני שלצלחת ובצד השני של המכסה. התחתון של U-החריץ בצלחת צריך להיות בחלק העליון של פני השטח אגר. התחתון של U-החריץ במכסה צריך להיות כל הדרך בחלק העליון של המכסה. ב ') החלפת המכסה לצלחת יוצרת פורטל סגלגל שדרכו השתיל יכול לבלוט.

איור 4. כניסה של שתילים למיקרוקוסמוס. א) שתי תצוגות להראות כיצד שורש השתיל צריך להניח על המשטח אגר עם הפסיגים ו~ 0.5 סנטימטר של צילומים בולטים מתוך U-החריץ שבצלחת. B) ו-C) הצבת את המכסה על הצלחת עם חריצים בשורה ייצור פורטל סגלגל לשתיל. עוטף את הצלחת הדוקה עם סרט פרפין ישמור את המכסה מהנעים ולמנוע ייבוש. ד) אז יכולות להיות מוערמות צלחות יחד בקבוצות של 6-10, ו-E) עטוף בנייר כסף. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 5. פנוטיפים סימביוטיים נציג לאחר צמיחה של 7 שבועות וצמיחת 9 שבועות של מ ' truncatula A17 במיקרוקוסמוס הבודד.) אורך Shoot של צמחים מחוסן עם ס ' meliloti 1021, ואורך צילומים של צמחי uninoculated נמדדו בגיל 7 שבועות מבלי להסיר את הצמחים ממיקרוקוסמוס. בשעה 9 שבועות לאחר החיסון, אורך לירות נמדד (), ולאחר מכן יורה קוצץ ונשקל (ב ').

. Jpg "/>
איור 6. פנוטיפים סימביוטיים נציג לאחר צמיחה של 7 שבועות של מ ' A17 בtruncatula מיקרוקוסמוס הבודד. ExoY-ביתר זנים של ס meliloti 1021 הגבירו סימביוזה על A17 truncatula הצמח הפונדקאי Medicago. הפרודוקטיביות הסימביוטי של ס ' meliloti 1021 על M. truncatula A17 הוא השתפר בזני שביטוי יתר של פופספוטרנפראז גלקטוז undecaprenyl פוספט המקודד על ידי exoY. הפרודוקטיביות סימביוטיים נמדדת כ() אורך לירות בס"מ ו( ב) לירות במשקל טרי בגרמים. המספרים של גושים ורודים, תפקודיים (בר גרף תחתון); גושים לבנים, לא יעילים (בר גרף אמצעי), וגושים חומים, נמקים (בר גרף העליון) מוצגים ב( C). מספר הפרודוקטיביות והגולה הסימביוטי של צמחים מחוסן עם ס ' Medicae זני WSM419 וABS7 מוצגים גם. כוכביות מעל סורגי גרף מציינות סטטיסטיותהבדל ly משמעותי מזן התייחסות הסוג בר 1021 במבחן t מזווג. צמחים מחוסן עם מוטציה null exoY :: Tn5 שלא מייצרת שום succinoglycan היו אורכים דומים לירות ומשקל טרי לצמחי uninoculated, ומיוצרים רק גושים לבנים, לא יעילים. הגרפים ב (א) ו (ב) פורסמו במקור ^ב19. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 7. שורשים צילמו במיקרוסקופ לנתח לאחר ההסרה ממיקרוקוסמוס. ניתן להסיר בקלות משורשי מיקרוקוסמוס להדמיה עם נזק מינימאלי לשערות שורש כי הם שוכבים על פני השטח של אגר. תמונות מראות את שורשיו של מ ' truncatula A17 ב10 ימים לאחר חיסון (A, B) ו14 ימים לאחר החיסון (C). השורשים הראו היו מחוסן עם ס ' meliloti 1021 סוג בר (א), ס ' זן meliloti ביצוע היתוך eglC :: גאס (ב '), וס זן meliloti ביצוע SMc00911 :: גאס היתוך ²⁰ (C). מכתים גאס של ס ' תאי meliloti ביצוע היתוך SMc00911 :: גאס גלויים על שערות שורש ואת פני השטח השורש בE. בר מתאים ל100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

ישנם מספר צעדים לפרוטוקול כי הם קריטיים להצלחה: 1) שיש הצורך בשימוש בתרבית תאים מטוהר, צמח נבדק אגר לא יכול להדגיש יתר על מידה. זה לא קריטי עבור שתילי אספסת, אבל את זה הוא קריטי לצמיחתו של מ ' truncatula A17. 2) חשוב לנבוט שתילים על צלחות אגר אנכיות כפי שמתואר בשלב 1. הטכניקה בשימוש נרחב של נובט שתילים על משטח אופקי הפוך בצלחת עמוקה 15 מ"מ ⁷ לא מומלץ עבור פרוטוקול זה, כי שורשי השתיל יהיו קצרים מדי ו / או לא ישר. שתילים עם שורשי צמיחה ישרה של 2-4 סנטימטר באורך הם אידיאליים עבור העברה מצלחות נביטה למיקרוקוסמוס. שלושה ימים של צמיחה בצלחות הנביטה האנכית הוא בדרך כלל אידיאליים לשורשים להשגת אורך זה. 3) זה גם קריטי כדי למנוע זיהום של שתילים עם rhizobia לפני החיסון. לפני ההעברה של שתילים מצלחות הנביטה microcoSMS, אזור העבודה יש ​​לנקות ביסודיות עם אתנול וכל המכשירים המשמשים בהעברה צריכים להיות בתדירות גבוהה להבה מעוקרת. מקור אפשרי נוסף לזיהום יכול להימנע על ידי הכנת ס מתלי מתח meliloti עבור חיסון של מיקרוקוסמוס בפינת עבודה נפרדת מזו המשמשת להכנת שתיל. זיהום פטרייתי של מיקרוקוסמוס גם יכול להימנע על ידי הסרת כל השאריות של מעיל הזרע מהפנים של המיקרוקוסמוס, שכן נבגי פטריות עשויים להיות מוטבעים במעיל. 4) הישרדות שתילים יכולה להיות מוגדלת על ידי שמירה על שורשי שתיל לחים ובמגע עם אגר בכל העת, ועל ידי טיפול עדין מאוד בעת ההעברה. כל שתיל עם השורש לכוד באגר בצלחת הנביטה צריך להיות נכרת בזהירות כדי למנוע נזק לשורש. תשואה גבוהה של צמחים ברי קיימא יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע בדיקה סופית לשתילים נבולים בערימות של מיקרוקוסמוס לפני חיסונים מתחילים, ולהחליף אותם שנינותהשתילים החדשים h. אם שתילים הם במצב טוב ולא פעל בהתאם לחלקו הפנימי של מכסה הצלחת, פחות מ -5% משתילים צריכים צריכים להיות מוחלפים בשלב זה. חסימה של צמיחה לירות מהמיקרוקוסמוס ניתן למנוע על ידי לוודא כי אין שאריות של מעיל הזרע הם מגבילים את הפסיגים ושהמיקרוקוסמוס הוא בזהירות, כך שהצילומים לא יהיו חסומים ועטוף parafilm.

אנו משתמשים באופן שיגרתי בשיטה זו כדי ללמוד סימביוזה בצמחי המארח מ ' A17 truncatula ואספסת, ואנחנו כרגע אופטימיזציה של הטכניקה לצמיחתו של מ 'האחר זני truncatula, מינים אחרים של Medicago ומינים של Melilotus (sweetclovers). יש לנו עדיין לא נבדקו בשיטה זו עם מ ' truncatula A20, שהוא ecotype המשמש כשותף מיפוי גנטי עם A17. מצאנו כי מ ' truncatula קורות חיים. R108 לא לגדול גם על AG צמח תרבית תאים שנבדק מטוהרתar אנו משתמשים כעת ואנו מנסים לזהות עוד הכנה אגר או אגר תחליף לשימוש כמצע גידול-מיקרוקוסמוס לזן זה.

בהשוואה לשיטה שתוארה כאן עם שיטות נפוצות בשימוש אחרות לניתוח של מ ' truncatula A17 / S. meliloti סימביוזה, מצאנו את זה כדי להיות ספק השיטה הטובה ביותר עבורו זמנית השוואת הביצועים הסימביוטי של מספר רב של ס meliloti זנים. אנו שגרתי להגדיר 250 מיקרוקוסמוס בכל פעם (10 זנים שונים של ס meliloti מחוסן על 25 צמחים כל אחד.) כאשר רק אחד גנוטיפ של ס ' meliloti או ס Medicae היא לשמש, וזיהום צולב הוא לא סיכון, caissons aeroponic או שקיות צמיחה עשוי להיות שיטה מתאימה יותר. שיטת מיקרוקוסמוס צלחת זו גם השיטה הטובה ביותר לביצוע תצפיות תקופתיות של ההתקדמות של פיתוח גולה ופריון סימביוטיים על פני תקופה של זמןזמן. פנוטיפים שבאים לידי ביטוי בשלבים מאוחר יותר של סימביוזה, כגון הזדקנות גולה, ניתן ללמוד בקלות רבה יותר בשיטה זו מאשר עם פרוטוקולים אחרים.

יש המחברים אין לחשוף.

עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי למשרד חקלאות מזון והחקלאות, חקלאות ומזון מענק מחקר יוזמה 2010-65,108 - 20582 לKMJ אנו מודים לבריאן ק וושבורן לבדיקה ביקורתית של כתב היד.