בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

שיטה פשוטה להקמת organoid גידול במעי העכברי העיקרי מתוארת. שיטה זו מנצלת את התכונה שתאים סרטניים במעי הגס לשרוד ולגדול לתוך organoids בתקשורת המכילות גורמי צמיחה מוגבלים, ואילו מעי גס נורמלי אפיתל לא.

כמה שורות תאי סרטן מעי גס אנושיות ועכבריות כבר הוקמו, יושרה פיזיולוגית של גידולים במעי גס, כגון מספר שכבות של תאים הבזליים, קוטביות-apical, יכולת להבחין וanoikis אינה נשמרת בשורות תאים שמקורם בסרטן מעי גס. המחקר הנוכחי מדגים שיטה לorganoids culturing העיקרי עכבר הסרטניים במעי הגס המותאמים מסאטו T et al. ^1, השומר על תכונות הפיזיולוגיות חשובות של גידולים במעי גס. שיטה זו מורכבת מאוסף עכבר מעי גס גידול רקמות, מעי גס הנורמלית הסמוכה האפיתל דיסוציאציה, מעי גס גידול עיכול תאים לתאים בודדים, הטבעת תאים סרטניים במעי הגס לmatrigel, והתרבות סלקטיבית המבוסס על העיקרון שתאים סרטניים לשמור על צמיחה בהגבלת תנאים תזונתיים בהשוואה למצב נורמלי תאי האפיתל.

את organoids הגידול הראשוני אם בודדו מעכברים מהונדסים גנטי לספק מערכת שימושית מאוד להעריך funct אוטונומי גידוליון של גנים ספציפיים. יתר על כן, את organoids הסרטניים ניתן למניפולציה גנטית על ידי וירוס המדיטציה מסירת גן; מסלולי איתות ולכן מעורבים בגידול במעי הגס יכולים להיות גם נחקרו בהרחבה על ידי ביטוי יתר או מציאה. תרבות organoids גידול הראשונית מספקת אמצעי רלוונטי ואפשרי פיסיולוגיים ללמוד את המנגנונים ושיטות טיפוליות לגידול במעי גס.

תאי אפיתל במעי להתרבות ולהתהפך בקצב בלתי רגיל, outpacing כל רקמות אחרות בגוף חוליות ^2,3. את התאים המתחלקים, כולל תאי גזע מעיים (ISC) ותאי מעבר-הגברה להתמיין גם הפרשה (גביע, פנט וenteroendocrine) תאים או enterocytes ^3. ISC ממוקם בבסיס קריפטה. תאי פנט לרדת לעומקו של מאורות והם האריכו ימים, ואילו משפחות אחרות להעביר כלפי מעלה לסיסים ^3,4. כאן התאים נחשפים לתוכן המעיים, כולל חיידקים ולשפוך מהקצוות סיסי באמצעות מנגנון אפופטוטיים-Induced anoikis. אמנם חסר סיסי המעי הגס ותאי פנט, המנגנון לשמירה על הומאוסטזיס דומה ^4.

מסלול איתות Wnt היה מעורב במשחק תפקיד מכריע בהתפשטות מעיים וISC תחזוקה ^4. מחיקה של הדואר גורם שעתוק TCF4, מפעיל במורד הזרם של איתות Wnt, מוביל לאובדן של תאי גזע במעי ולאחר מכן פירוק של הרקמה ^5. בדומה לכך, ביטוי מהונדס של DKK1 מעכבי Wnt מפחית את התפשטות אפיתל וכלה את שושלות תאי הפרשה ^6. לעומת זאת, ביטוי יתר של אגוניסט Wnt R-spondin-1 פרוליפרציה חזקה ומהירה של תאי הקריפטה מעיים ^7.

לאור החשיבות של איתות Wnt להומאוסטזיס מעיים, מוטציות מסלול Wnt הם נצפו לעתים קרובות בסרטן מעי גס ^8. סרטן המעי הגס הוא הגורם שלישי למוות מהסרטן בארצות הברית ^9. הצריכה תזונתית עודפת עם בשר אדום ואלכוהול, פעילות גופנית מופחתת, ועוברת בירושה ומוטציות סומטיות נחשבות לגורמי סיכון לסרטן מעי גס ^10,11. Coli (APC) גן polyposis adenomatous, גורם איתות Wnt מפתח, הוא מוטציה ברוב של הרשות הפלסטיניתtients עם משפחתי, סדיר, וסרטן מעי גס קוליטיס הקשורים ^12,13. מוטציות של גורמים אחרים שהיו מעורבים במסלול איתות Wnt כולל Axin2 וβ-catenin הם נצפו גם בסרטן מעי גס ^14,15. עם זאת, המנגנון המדויק והטיפול יעיל לטיפול בסרטן המעי הגס הם עדיין חסרים. כדי להקל על החקירה של המנגנונים המולקולריים לסרטן מעי גס, שורות תאי סרטן מעי גס אנושיות המייצגות את השלבים השונים של התקדמות הסרטן שונים משפיר לסוג תא אגרסיבי כבר הוקם ^16-18. שורות תאי סרטן מעי גס גרורתי עכבר עם מאפיינים שונים זמינות גם ^19,20. עם זאת, תאים ראשוניים או תרבויות organoid עדיפים על שורות תאים שינו כי הם מחקים באופן הדוק במצב vivo ולייצר יותר רלוונטית מבחינה פיזיולוגית נתונים ^21. רוב שורות תאים שמקורם מעי גס, סרטן לגדול כmonolayer מחוברת לצלחת או כהשעיות תא, lackinגרם של נטייה הפסגה-basolateral והדוקים צמתים בין תאים. כמו כן, תאי אפיתל במעי רגילים וגידול in vivo לעבור צורה ספונטנית של anoikis מכונה אפופטוזיס כמו התאים המובחנים להגיע לטיפים והסיסיים הם לשפוך ^22. תכונות אלה קשה לסכם בשורות תאים, אבל הם חשובים בתהליך ההתפתחות של סרטן מעי גס ^23. תכונות אלה נשמרות בorganoids הראשוני. בנוסף, תרבויות organoid הסרטניים לספק מערכת יעילה להערכת תפקודים אוטונומיים של גנים סרטניים בהשוואה במחקרי vivo. מניפולציה גנטית in vivo של המעי היא תהליך גוזל זמן בעיקר באמצעות יצירת מהונדס ו / או עכברים בנוקאאוט באמצעות נהגי מעי ספציפיים. עם זאת, את organoids הסרטניים הם בקלות נוחה למניפולציות גנטיות נגיפיות בתיווך ובכך כלי נהדר להערכת מנגנונים מולקולריים מדויקים. תרבויות hav organoid סרטניים במעי העיקרידואר הוכח כטכניקה אפשרית ורבת עוצמה. תרבית תאי מעי העיקרית יכולה להקים organoids מעיים פונקציונלי עם קבר ובעל מבנה סיסים במבחנה ממבוגר יחיד Lgr5 + תאי גזע ^24. ניתן להשתיל organoids אלה וengrafted לרקמת מעי פגום להתחדשות ^25. הסתגלות נוספת של תנאי התרבות עשתה organoids אפיתל דומה ממעי גס ובמעי הדק עכבר אנושי ומעי גס אפשרי ^1. לתרבות העיקרית נורמלית מעי גס האפיתל, מדיום התרבות בסיסית, כמו גם גורמי גדילה כולל EGF, Noggin, R-spondin וWnt3a הם חיוניים, ואילו מדיום התרבות בסיסי וEGF מספיק לגידול organoids גידול במעי עכבר העיקרי ^1. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד, תרבות, וליצור organoids גידול במעי הגס.

1. בידוד גידול במעי גס ודיסוציאציה הסלולרי

1. יכול להיות מבודד מכל גידולים במעי מודל סרטן מעי גס או ספורדי מושרה טיפול. העכברים צריכים להיות מורדמים עם CO _2. נקודתיים נאספות אז, סמוקות קר מלוח פוספט שנאגרו (PBS) ונפתחו longitudinally. זהה את האזורים המכילים גידולים תוך שימוש בסטראו, לנתח עם זוג מספריים, ולשטוף עם PBS הקר.
2. דגירה שברי מעיים המכילים גידולים במאגר קלאציה EDTA (2 מ"מ EDTA, 5.6 mmol / L Na ₂ HPO _4, 8.0 mmol / L KH ₂ PO _4, 96.2 mmol / L NaCl, 1.6 mmol / L KCl, סוכרוז 43.4 mmol / L, 54.9 mmol / L-D סורביטול, 0.5 mmol / L DL-dithiothreitol במים מזוקקים) למשך 60 דקות על קרח.
3. לאחר כלצים, רוב תאי אפיתל במעי הנורמלי יהיה מנותק, ואילו תאים סרטניים יישארו מחוברים לmesenchyme. לשאוב את חיץ קלאציה המכיל תאי אפיתל נורמליםולשטוף את גידול השריד שברים עוד פעם אחת עם 5 חיץ קלאציה קר מ"ל.
4. לשאוב את חיץ קלאציה, לשטוף ברים סרטניים עם 5 מ"ל הקר 1x PBS.
5. לשאוב את PBS 1X, דגירה ברים סרטניים בחיץ עיכול (2.5% בסרום שור עוברי, יחידה / 1 מ"ל של פניצילין, מיקרוגרם / 1 מ"ל של סטרפטומיצין, ו -2.5 ng / ml של amphotericin B, 200 U / מיליליטר הסוג IV collagenase, 125 מיקרוגרם / מיליליטר הסוג II dispase בשינוי הנשר בינוני של Dulbecco) במשך שעה 2 ב 37 ° C.
6. לאפשר שבר הגידול להתיישב תחת כובד נורמלי דקות 1, ולאסוף את supernatant בצינור פלקון 15 מ"ל. גלולה supernatant ההשעיה גידול התא הבודד על ידי centrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות ולשטוף פעם עם 5 מ"ל PBS על ידי centrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות.

2. תרבות של גידול מעיים

1. Resuspend התא גלולה גידול עם 500 PBS μl, לספור תאים סרטניים בודדים מבודדים באמצעות hemocytometer.
2. תאים סרטניים גלולה ידי סנטrifuging ב XG 200 במשך 3 דקות, וresuspend אותם 5 מ"ג / מיליליטר Matrigel על קרח וצלחת ב24 גם צלחות ב15,000 תאים לכל 50 μl של Matrigel בכל טוב.
3. בואו Matrigel פלמר במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף 500 מדיום תרבות μl / גם בסיס (יחידת 1 / מ"ל ​​של פניצילין, מיקרוגרם / 1 מ"ל של סטרפטומיצין, ו -2.5 ng / ml של amphotericin B, 10 HEPES mmol / L , 2 המ"מ Glutamax, תוסף N2 1x, 1x תוסף B27, mmol / L N-acetylcysteine ​​1 בנשר Medium/F12 השינוי של מתקדם Dulbecco) המכיל 50 ng / EGF עכברי מ"ל.

3. תחזוקה של Organoids הוקם

1. שינוי התרבות בינונית בסיסית המכילים EGF כל 2 ימים והמעבר organoids 01:05 פעם בשבוע.
2. לpassaging, החלף את מדיום התרבות עם התרבות בינונית בסיסית טריות. מכאני לשבש organoids וMatrigel באמצעות פיפטה P1000 עם טיפים נותקו ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. ניתוק מכאני נוסף מושגת באמצעות אש מלוטש פסטר צינורטטי.
3. שטוף organoids ניתק עם 5 מ"ל של מדיום התרבות הבסיסית וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 2 דקות.
4. בטל supernatant, resuspend את הכדור עם Matrigel ולהוסיף מדיום התרבות כפי שתואר לעיל.

4. אחסון ושחזור של Organoids הוקם

1. עבור אחסון לטווח ארוך, להקפיא organoids בנוזל N ₂ שהם יציבים במשך לפחות 2 שנים. לorganoids המקפיא, לשבש באמצעות פיפטה P1000 עם הטיפים לחתוך ולהעביר לתוך צינור פלקון 15 מ"ל.
2. שטוף organoids ניתק עם 5 מ"ל של מדיום התרבות הבסיסית וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 2 דקות.
3. בטל supernatant, resuspend את הכדור עם השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 20% בסרום שור העובר (FBS) ו -10% sulfoxide דימתיל (DMSO).
4. תאים להעביר לתוך 1.5 cryotubes מ"ל, ואז לשים את הצינורות במכל Nalgene מר פרוסטי מקפיא ולאחסן במקפיא -80 מעלות צלזיוס כדי להשיג קצב קירורשל -1 מעלות צלזיוס / דקה. לאחר דגירה הלילה, להעביר צינורות לנוזל N _2.
5. להתאוששות, organoids הקפוא מופשר במהירות ב37 מעלות צלזיוס במים אמבטיה, לשטוף עם מדיום התרבות בסיסי, ספין למטה, resuspend בMatrigel והתרבות בתנאים שתוארו לעיל.

5. RNA מיצוי, מיצוי חלבון ואימונוהיסטוכימיה

1. RNA הפקה: תאים נאספים כמתואר לעיל למעבר. רנ"א הוא מבודד עם PicoPure ^TM-RNA בידוד ערכה לפי הוראות יצרן.
2. מיצוי חלבון: כדורי תא נאספים כמתואר לעיל וlysed במאגר 100 assay radioimmunoprecipitation μl (Ripa; 50 mmol / L טריס-HCl pH 7.5, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 1% NP-40, 0.1 % SDS) עם מעכב פרוטאז 1x.
3. אימונוהיסטוכימיה: לשאוב את מדיום תרבות תא, להעביר organoids הסרטניים עם P1000 פיפטה עם טיפים נחתכו לCryo-עובש ולהקפיא באופן מיידי בTISלתבוע את מדיום הקפאה (אוקטובר) עם קרח יבש. חלקים קפואים נחתכו ב -7 מיקרומטר ומוכתם כפי שתוארו לעיל ^26.

מהלך הזמן של היווצרות organoid גידול במעי גס ^מדקות APC בן שלושת חודשים ^{/ +} עכבר מוצג באיור 1. ביום 0, תאים בודדים יכולים להיבחן כמה שעות לאחר ציפוי (איור 1 א). ליום 1 ביום, שרדו תאי האפיתל גידול במעי הגס עם גרעינים עקשן יכול להיבחן. ביום 3, בגודל של תאים הוכפל. בשעה 6 ביום, בגודל של יותר מ organoid התרחב פי עשר והראה סימנים של אפופטוזיס באמצע. ביום 14, את orgnoids יגדל לתוך תאים חריגים (איור 1). כאן היו לנו 39.33 ± 22.05 organoids / בנוי היטב, בתנאי העיכול של collagenase 200 U / מ"ל לשעה 2, בהשוואה לשום organoids נוצר בתנאי העיכול של collagenase 75 U / מ"ל למשך 30 דקות במחקר זה (איור 1 ג).

להראות מודל תרבות organoid זה יכול לשמש למחקר פונקציונלי, מכתים immunofluorescent של β-קייט נין, מרכיב בלתי נפרד למסלול איתות Wnt מוצג באיור 2. התאים המוכתמים החיוביים עבור β-catenin נמצאים בשכבות מתוך organoid, אשר אישר את דפוס גדילה עם לומן מרכזי שהוצע על ידי הקבוצה 'ד"ר Clevers ^24.

איור 1. היווצרות organoid נציג נובעת מגידול במעי גס שנלקח ^{מ/ +} עכבר ^דקות APC בן שלושת חודשים הייתה לתרבית () 0, 1, 3, 6 ו (ב) 14 ימים מוצגים. (ג) השיעור המוצלח של היווצרות organoid תחת שני תנאי עיכול collagenase שונים.

50210fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50210/50210fig2.jpg "/>
איור 2. מכתים Immunofluorescent של β-catenin לorganoids הנגזר מגידול במעי גס שנלקח ^מדקות APC בן שלושת חודשים ^{/ +} עכבר מוצג. 4 ',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) שימש להכתים גרעינים.

הפרוצדורות שתוארו בפרוטוקול זה תאפשר לבידוד והתרבות של גידולים במעי גס עכבריים ראשוניים. הפרוטוקול מותאם מעבודת הזרע נעשתה על ידי ד"ר קבוצת Clevers ^1,24,27. אנו מותאמים זמן העיכול וריכוז collagenase לקבל תשואה טובה יותר של organoids הסרטניים. השלבים הקריטיים כוללים עיכול תאים סרטני לתאים בודדים, resuspension Matrigel, ותרבות סלקטיבית. לעיכול של תאי גידול, על מנת לקבל ניתוק יעיל של גידולים במעי גס ולשמור על יכולת הקיום שלהם, את מערכת העיכול והריכוז של collagenase צריכים להיגזר באופן אמפירי ומותאמים. לדוגמה, כאשר משתמשים בcollagenase 75 זמן U / מ"ל ​​ו דגירה של 30 דקות, אנחנו לא קבלנו השעיות תא סרטניים בודדות ואין organoids נוצרו תחת מצב זה בידיים שלנו. שמירה על קשר תאי תאים הוא דיווחה להיות קריטי לתאים סרטניים culturing ^28, הנה בעת שימוש בcollagenase 300 U / מ"ל ואינקובטוריםזמן n של שעות, זיהום תאי סטרומה 3 הוא ציין גם. באופן דומה, resuspension Matrigel, הריכוז, וזמן התמצקות צריכים גם להיקבע באופן אמפירי. את organoids לאפשר הערכה מדויקת של אפיתל הגידול. את organoids הוקם מגידולים במעי מסוגל תרבות לטווח הארוך. יש לנו להשתמש בקלות organoids הוקם לכמה חודשים, ללא הבדלים ניכר בריבוי והתמיינות. Organoid הוקם ניתן להשפיע מבחינה גנטית למציאה וביטוי יתר. יתר על כן, יכול להיות שנוצר בorganoids הסרטניים מדגימות ביופסיה סרטניים אנושיות, ולכן טכניקת culturing יכולה לשמש כדי לחקור את המנגנון בסיסי באופן ספציפי מטופל. מסלול Wnt הוא קריטי להתפתחות עוברית מעיים. במעי מבוגר Wnts הם קריטי לשגשוג של תאים הנורמלי מעבר-הגברה וdysregulation של מסלול Wnt הוא קריטי לגידול במעי גס ^29. סלקטיבי התרבות wiה EGF מספיק לשמירה על צמיחת organoid גידול במעי גס. עם זאת, כאשר השלים עם Wnt3a, את organoids לגדול ביעילות רבה יותר. לכן, התאים מגיבים לצמיחת קידום השפעות של ligands Wnt, שלא כמו כמה שורות תאים שמקורם במעי גס.

את organoids לחקות באופן הדוק יותר מאשר קווי אפיתל המעיים סרטן מעי גס שנקבעו נגזרים, ואנחנו מאמינים שנספק נתונים מדויקים יותר ורלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. כפי שתואר לעיל, הטכניקה זו שימושית לחקר מנגנוני הייזום והתקדמות לסרטן מעי גס. גם את organoids הסרטניים יספק נתונים מדויקים יותר בעת הערכת היעילות הטיפולית של טיפולים בסרטן מעי גס.

יש לנו מה למסור.

מחקר זה נתמך על ידי מענקים לYMS מהמכונים הלאומי לבריאות (CA148828), האוניברסיטה של ​​מרכז מישיגן העיכול פפטיד, ומחקר ג'פרי א קולבי סרטן מעי גס ואת קרנות טום יו הזיכרון של המרכז לסרטן של אוניברסיטת מישיגן.