在体外化培养基层小鼠结肠肿瘤

一个简单的方法来建立初级小鼠结肠肿瘤类器官。这种方法利用的功能，结肠肿瘤细胞含有生长因子有限的媒体生存和发展成类器官，而正常结肠上皮不。

几个人类和小鼠结肠癌细胞系已经建立，结肠肿瘤，如多细胞层，基底顶端极性，分化能力和失巢凋亡的生理完整性不保持在结肠癌细胞系。目前的研究表明原代培养小鼠结肠肿瘤类器官改编自佐藤T 等人 ^，保留了重要的生理功能，结肠肿瘤的方法。这种方法包括小鼠结肠肿瘤组织收集，相邻的正常结肠上皮解离，结肠肿瘤细胞消化成单个细胞，基底膜嵌入结肠肿瘤细胞，选择性培养的原则基础上，肿瘤细胞保持增长限制比较正常营养条件上皮细胞。

原发肿瘤类器官，如果从转基因小鼠中分离，提供了非常有用的系统，来评估肿瘤自治区此功能特定基因的离子。此外，肿瘤类器官适合病毒预谋基因传递的遗传操作，也可以被广泛的研究，因此在结肠肿瘤发生的信号通路参与过表达或击倒。原发肿瘤类器官培养提供了有关的生理和可行的手段来研究结肠肿瘤的发生机制和治疗方式。

肠上皮细胞增殖，并以惊人的速度，超过了所有其他组织在脊椎动物体内^2,3。分裂的细胞，包括肠干细胞（ISC）和中转放大细胞分化（高脚杯，潘氏和肠内分泌）分为分泌细胞或肠^3。国际学习中心坐落在该基地的地穴。潘氏细胞向下移动到隐窝底部，寿命长，而其他谱系向上迁移的绒毛^3,4。在这里，细胞暴露于肠道内容包括微生物群，并通过的脱落凋亡诱导的细胞凋亡的机制从绒毛提示脱落。虽然结肠没有绒毛和帕内特细胞，能维持体内平衡机制，是相似图^4。

有牵连的Wnt信号通路发挥了至关重要的作用在肠道增殖和ISC维护^4。删除THê转录因子TCF4，Wnt信号通路的下游效应，导致肠道干细胞的损失和随后的崩溃组织^5。同样，转基因的表达，Wnt信号抑制剂DKK1时间上皮细胞增殖和耗尽分泌细胞谱系^6。相反，过度的Wnt受体激动剂R-脊椎蛋白1诱导强有力的和快速的肠隐窝细胞增殖的^7。

鉴于Wnt信号肠道动态平衡的重要性，Wnt信号通路的突变常常可以观察到在结肠癌^8。结肠癌是第三大死因，癌症在美国^9。红肉和酒精，过量饮食摄入量与体力活动减少，并继承和体细胞突变被认为是结肠癌的危险因素^10,11。腺瘤性息肉病（APC）基因，一个关键Wnt信号因子，在大多数PA突变患者家族性的，零星的，和结肠炎相关性结肠癌^12,13。其他因素参与Wnt信号通路包括AXIN2和β-连环蛋白的突变也观察到在结肠癌^14,15。但是，确切的机制和有效的治疗结肠癌仍然缺乏。为方便调查为结肠癌的分子机制已经建立，代表不同的癌的进展阶段，从良性积极的细胞类型的人类结肠癌细胞株^16-18。小鼠结肠癌细胞株具有不同转移特性也^19,20。然而，原代细胞或优于类器官文化转化的细胞系，因为它们紧密地模仿体内状态，并产生更多的生理相关数据^21。最受欢迎的结肠癌衍生细胞系生长附着板的单分子层，或作为细胞悬浮液，缺位克顶端基底取向和细胞间紧密连接。此外，正常和肿瘤的肠上皮细胞在体内经过一个自发的形式，被称为细胞凋亡脱落凋亡，分化的细胞到达绒毛的提示和脱落^22。这些功能是困难的，扼要重述在细胞系，但结肠癌²³的发展过程中是很重要的。这些初级类器官的功能得到维护。此外，肿瘤类器官培养提供了一个有效的系统，以评估肿瘤的自主功能的基因相比， 在体内研究。遗传操纵体内的肠道是一个耗时的过程，主要是通过建立转基因和/或基因敲除小鼠肠道特定的驱动程序。然而，肿瘤类器官易于病毒介导的遗传操作和一个伟大的工具，用于评估精确的分子机制。原发性小肠肿瘤类器官培养甲肝已经证明是一个可行的和强大的技术。原发性肠细胞培养可以建立肠道功能的类器官体外隐窝绒毛结构从单一的成人LGR5 +干细胞^24。这些类器官可移植和嫁接到受损的结肠组织再生^25。进一步适应的文化条件作出了类似的上皮组织体小鼠结肠和人类小肠和结肠可行^1。主正常结肠上皮细胞培养，基础培养基以及生长因子EGF，Noggin与中，R-脊椎和Wnt3a的是必不可少的，而基础培养基和EGF是足够的增长的主要小鼠结肠肿瘤类器官^1。在这里，我们描述了一个详细的协议，分离，培养，并产生结肠肿瘤类器官。

1。结肠癌的分离和细胞分离

1. 肠道肿瘤或治疗引起的任何零星结肠癌模型可以隔绝。应的小鼠安乐死与CO _2。冒号然后收集，用冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，并沿纵向打开。识别区，其中包含肿瘤，利用体视显微镜，解剖用一把剪刀，用冷PBS洗。
2. 孵育肠片段：含有肿瘤EDTA螯合缓冲液（2 mM的EDTA，5.6毫摩尔/ L的Na ₂ HPO _4，8.0毫摩尔/ L KH ₂ PO _4，96.2毫摩尔/ L的NaCl，1.6毫摩尔/ L的KCl，43.4毫摩尔/ L蔗糖， 54.9 mmol / L的D-山梨糖醇，0.5毫摩尔/ L的DL-二硫苏糖醇在蒸馏水中）在冰上60分钟。
3. 螯合作用后，正常的肠上皮细胞脱落，而肿瘤细胞的间充质细胞将保持附着。螯合缓冲吸含有正常的上皮细胞洗净残余肿瘤碎片一个更多的时间与5毫升冷螯合缓冲。
4. 吸螯合缓冲区，用5毫升冷1X PBS洗涤肿瘤碎片。
5. 吸出的1倍PBS，孵育肿瘤片段消化缓冲液中（2.5％胎牛血清，1单位/ ml青霉素，1微克/毫升链霉素，和2.5毫微克/毫升的两性霉素B，200 U / ml的Ⅳ型胶原酶， 125微克/毫升分散酶II型的Dulbecco改良的Eagle培养基）2小时，在37℃下
6. 允许肿瘤片段来解决正常重力下1分钟，收集上清液在15毫升猎鹰管。颗粒的单细胞瘤悬浮液上清，通过离心分离，在200×g离心3分钟，并以200×g离心3分钟，用5ml PBS洗一次。

2。肠道肿瘤文化

1. 用500μlPBS重悬肿瘤细胞沉淀，孤立的单个肿瘤细胞使用血球计数。
2. 颗粒肿瘤细胞占rifuging 3分钟后，以200×g，并重新悬浮在5 mg / ml的基底膜上的冰和板在24孔培养板中，每孔15000个细胞每50μl的基底膜。
3. 让基底膜在37℃下聚合反应15分钟，并加入500微升/孔的基础培养基（1单位/ ml青霉素，1微克/毫升链霉素，和2.5毫微克/毫升两性霉素B，10 mmol / L的HEPES N2补充2mm GLUTAMAX的，1个，1个B27的补充，1 mmol / L的N-乙酰半胱氨酸高级贝科的修改鹰Medium/F12）含有50毫微克/毫升鼠表皮生长因子。

3。维护既定的组织体

1. 改变基底含有表皮生长因子的培养基中每星期一次，每2天及通过类器官1:5。
2. 传代，更换新鲜的基础培养基培养基。机械破坏的类器官和基底膜使用P1000的吸管切断与技巧，并转移到15毫升猎鹰管。进一步的机械分离是通过使用火抛光的巴斯德管TTE。
3. 洗离解类器官的基础培养基中，并在200×g离心2分钟离心，用5毫升。
4. 弃去上清液，将沉淀重悬于与基底膜和如上所述的培养基中添加。

4。存储和恢复既定的组织体

1. 对于长期储存，冻结液体N ₂类器官的稳定，至少2年。对于冻结类器官，扰乱使用P1000的吸管与技巧切断，并转移到15毫升猎鹰管。
2. 洗离解类器官的基础培养基中，并在200×g离心2分钟离心，用5毫升。
3. 弃去上清液，将沉淀重悬于含20％胎牛血清（FBS）和10％二甲亚砜（DMSO）的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）。
4. 传输到1.5毫升冻存管细胞，然后把管一个的Nalgene雾先生冷冻集装箱和储存在-80℃的冰箱中实现了冷却速率以-1℃/分钟。过夜培养后，转成液态N ₂管。
5. 对于恢复，迅速解冻冷冻类器官在37°C的热水浴，用基础培养基，降速，重悬在基底膜和文化与上述条件。

5。提取RNA，蛋白质的提取及免疫组化

1. RNA的提取：收集细胞，按上述通路。 RNA分离与PicoPure ^TM RNA提取试剂盒，根据制造商的指示。
2. 蛋白质提取方法：如上所述，并溶解在100μl放射免疫沉淀法测定缓冲液（RIPA，收集细胞沉淀，50 mmol / L的pH为7.5的Tris-HCl，150毫摩尔/ L的NaCl，2毫摩尔/ L的EDTA，1％NP-40，0.1 ％SDS）中与1倍的蛋白酶抑制剂。
3. 免疫组化：吸细胞培养液中，P1000移液器转移肿瘤组织体切断成低温模具的提示，并立即冻结那朵用干冰冷冻介质（OCT）提起诉讼。在7μm切片，切片冷冻染色按如前所述^，26。

从3个月大的APC ^{分钟/ +}鼠标如图1所示的结肠肿瘤类器官形成的时间过程。单细胞在第0天，可以观察到几个小时后镀（ 图1A）。在第1天，存活结肠癌上皮细胞难治核可以观察到。在第3天，细胞的大小增加一倍。在第6天，类器官的大小扩大超过10倍，表现出细胞凋亡在中间。在第14天，的orgnoids会生长成不规则的车厢（ 图1B）。在这里，我们不得不39.33±22.05类器官/ 200 U / ml的胶原酶2小时的消化条件下形成的，比较没有在这项研究中30分钟（ 图1C）75 U / ml的胶原酶消化条件下形成的类器官。

为了显示这一类器官培养模型可用于功能研究，免疫荧光染色β-美食年Wnt信号通路的一个组成部分， 如图2所示。 β-连环蛋白的阳性染色的细胞为位于输出层的类器官，这证实的增长模式与中央管腔提出的博士Clevers组^24。

图1。一位代表类器官形成从3个月大的APC ^{分钟/ +}小鼠结肠肿瘤来源于培养（A）0，1，3，6，（B）14天。 （C）类器官形成两个不同的胶原酶消化条件下成功率。

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图2。从3个月大的APC ^{分钟/ +}鼠标从结肠肿瘤派生的类器官的β-连环蛋白免疫荧光染色。使用4'，6 -二脒-2 -苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色细胞核。

在这个协议中描述的实验程序将允许分离培养初级小鼠结肠肿瘤。该协议是改编自做开创性的工作由博士Clevers组^1,24,27。我们优化的消化时间和胶原酶浓度的肿瘤组织体，以获得更好的收益率。关键步骤包括肿瘤细胞消化成单个细胞，基底膜再悬浮，选择性培养。对于肿瘤细胞的消化中，为了获得有效的结肠肿瘤的离解，并维持其生存能力，胶原酶的消化和浓度应根据经验得出和优化。例如，当使用胶原酶在75 U / ml和孵化时间为30分钟，我们没有获得单个肿瘤细胞悬浮液和无类器官在这种条件下形成的，在我们手中。维持细胞-细胞接触，据报道，培养癌细胞^28的关键，在这里使用胶原酶300 U / ml和incubation次也观察到3个小时，基质细胞污染。同样，基底膜再悬浮，浓度和凝固时间也可以根据经验来确定。类器官的肿瘤上皮细胞进行准确的评估。肠道肿瘤成立的组织体能够长期培养。我们已供建立类器官数个月，没有明显的差异，增殖和分化。所建立的类器官可以击倒和过度表达基因操纵。此外，肿瘤组织体可以产生从人类肿瘤活检样品，因此，该培养技术可用于研究在患者体内的具体方式的基本机制。 Wnt信号通路是肠胚胎发育的关键。成人小肠的Wnts都正常增殖的关键中转放大细胞和Wnt信号通路的失调是至关重要的结肠肿瘤^29。选择性培养无线个EGF是足以维持结肠肿瘤类器官的生长。然而，当与Wnt3a的补充，类器官更有效地增长。因此，细胞是响应Wnt配体的作用，不同于几个结肠衍生的细胞系的生长。

组织体更紧密地模仿比肠上皮细胞建立结肠癌衍生系，我们相信这将提供更准确和生理相关的数据。如上所述，这种技术是有用的调查结肠癌的起始和进展的机制。此外，肿瘤类器官结肠癌治疗的疗效评估时，将提供更准确的数据。

我们什么都没有透露。

这项研究得到补助YMS从美国国家卫生研究院（CA148828），密歇根胃肠肽中心大学，杰弗里A.科尔比结肠癌研究的美国密歇根大学综合癌症中心的汤姆刘纪念基金。