ייצוב שיטה חדש להפקת חוליות פגיעה בחוט השדרה Contusive

ייצוב השדרה הוא הכרחי לצמצום שונות, ולהפקת פגיעות בחוט השדרה עקבית ניסיונית. באמצעות מנגנון ייצוב מותאם אישית בשילוב עם מכשיר Impactor NYU / MASCIS, יש לנו הפגנו כאן הציוד ונוהל התקינים ליצירת פציעות שחזור חמי-contusive צוואר רחם (C5) בחוט השדרה בחולדות מבוגרות.

פציעה בצוואר הרחם בבעלי חיים מבחינה קלינית רלוונטי חוט השדרה דגמים (SCI) הם חיוניים לפיתוח ובדיקת טיפולים פוטנציאליים; עם זאת, הפקת SCI צוואר רחם אמין קשה בשל חוסר שיטות מספקות של ייצוב השדרה. השיטה המקובלת לייצוב עמוד השדרה היא להשעות את עמוד השדרה הצווארי מקורי ואת הזנב באמצעות מלחציים מצורפים לתהליכי spinous צוואר רחם. עם זאת, שיטה זו של ייצוב אינה מונעת רקמת מניב בחבלה כתהליכי השדרה הצווארי הם קצרים מדי כדי להיות מאובטח בצורה יעילה על ידי מהדק (איור 1). כאן אנו מציגים שיטה חדשה לייצב את חוליית הצוואר לחלוטין באותה הרמה של פגיעת ההשפעה. שיטה זו יעילה ממזערת תנועה של עמוד השדרה באתר של השפעה, אשר משפר באופן משמעותי את הייצור של SCIs העקבי. אנו מספקים תיאור חזותי של הציוד (איור 2-4), שיטהים, ופרוטוקול צעד-אחר-צעד לייצוב החוליה 5 צוואר הרחם (C5) של חולדות מבוגרות, לבצע laminectomy (איור 5) ולייצר SCI contusive לאחר מכן. למרות שאנחנו רק להפגין חמי-חבלה בצוואר הרחם באמצעות מכשיר Impactor NYU / MASCIS, טכניקת ייצוב השדרה זה יכול להיות מיושמת על אזורים אחרים של חוט השדרה, או להיות מותאמת למכשירי SCI אחרים. שיפור חשיפת חוט השדרה וקיבוע באמצעות ייצוב חוליות עשויה להיות בעל ערך להפקת פציעות עקביות ואמינות לחוט השדרה. גם שיטת ייצוב השדרה זה יכול לשמש עבור זריקות stereotactic של תאים וקליעים נותבים, והדמיה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במחקרי נוירו-ביולוגיים שונים.

כוח מכאני עקבי ושכפול ברקמות השדרה יעד הוא קריטי למזעור השתנות פונקציונליות והיסטולוגית ולהקמת מודלים מוצלחים פגיעה בחוט השדרה contusive (SCI) ^1-7. כמות הכוח להחיל אזור יעד של חוט השדרה תלויה בשיטות מנוצלות לייצוב עמוד השדרה. הסטה במיקום של עמוד השדרה היעד במהלך קשר בין בוכנת ההשפעה ואת חוט השדרה משנה את כוח פגיעה כתוצאה. מודל SCI contusive צוואר הרחם הוא יותר רלוונטי מבחינה קלינית מודל מאשר צורות אחרות של SCI, ככ -50% מהמקרים אדם SCI להתרחש ברמה זו ^8, ומספר מחקרי SCI בוצעו תוך שימוש במודלים של בעלי החיים פציעה בצוואר הרחם ^9-14. למרות שדגמי SCI contusive לעתים קרובות להשתמש בסוג כלשהוא של התייצבות על ידי כיווץ קדמי תהליכי השדרה ואחורית למקום הפגיעה, הכנה זו היא קשה לייצור צוואר רחם SCI. ו# 160; כפי שניתן לראות בהפגנה זו, שיטת הייצוב שפיתחנו היא יתרון ביכולתה להגדיל הן את האיכות ושחזור של פגיעת חבלה. במיוחד, שיטה זו של ייצוב השדרה הוקמה בניסיון לתקן את הליקויים ואתגרים של מודלים אחרים: 1) השתנות בחוליות מניב תחת כוח ההשפעה עלולה להתרחש על ידי כיווץ תהליכי spinous גב סמוך מקורי ואת הזנב לlaminectomy. מידת הסטת השדרה תלויה במספר המפרקים בעמוד השדרה בין ההשפעה והחוליות שהתייצבו (איור 1). לכן, יותר מפרקים מעורבים פחות יציבים בעמוד השדרה הופכת; 2) תהליכי גב spinous הם כישלון מהדק שביר וסיבה כתוצאה של שבר זיזים קוצי או המהדק מחליק את התהליך; ו 3) תהליכי spinous בחוליות אלה הם קצרים ביותר בין C3 לT1 חוליות בהשוואה לאלו של Verte בית החזהבראק, שהופך אותו קשה באמצעות מהדק מסורתי לתפוס את תהליכי spinous לייצוב עמוד השדרה הצווארי.

כאן אנו מתארים שיטה חדשה של ייצוב עמוד השדרה לייצור C5 contusive SCI בSprague-Dawley חולדות נקבה בוגרת. שיטה זו יכולה לשמש לייצוב רמות האחרות של עמוד השדרה וחוט השדרה, וconjugates גם עם מכשירי SCI contusive אחרים, כולל כבל אוניברסיטת ניו-יורק / Multicenter בעלי החיים פגיעה בעמוד השדרה המחקר (אוניברסיטת ניו יורק / MASCIS) Impactor ¹⁵ (איור 2) , מכשיר Precision מערכות ומכשור, LLC Infinite אופק (IH) ^16, אוניברסיטת אוהיו / חוט השדרה פגיעה התקן ¹ אלקטרומגנטית, והמכשירים לואיוויל מערכת הפגיעה (LISA) ^17, המאפשרים לשימוש נרחב במחקר SCI.

1. חשיפה של צוואר הרחם השדרה הרבדים

1. נקה את המשטח כירורגית עם 70% אתנול, חימם מראש עם כרית חימום. מכסה את פני השטח עם וילון ניתוח סטרילי לפני הצבת גזה סטרילית, צמר גפן, וכלים כירורגיים autoclaved באזור הניתוח. השתמש מעקר microbead עבור עיקור בין-ניתוח של כלים כירורגיים.
2. להרדים את העכברוש עם קטמין (87.7 מ"ג / קילוגרם) / xylazine (12.3 מ"ג / קילוגרם) intraperitoneally (IP). המטוס התקין של הרדמה הוא הגיע כאשר החיה מפסיקה להגיב לגירוי קמצוץ הבוהן. תת עורי להזריק 0.01-0.05 מ"ג / קילוגרם עצירות ו5 מ"ג / קילוגרם carprofen לפני הליך כירורגי. עצירות אז צריכים להינתן בכל שעה 8-12 וcarprofen פעם ביום, ל4-7 הימים הראשונים שלאחר ניתוח.
3. החל משחה מגן לעיניו של בעל החיים כדי למנוע התייבשות של קרנית במהלך ניתוח.
4. לגלח את אזור הניתוח על הגבפני השטח של העכברוש מאזור אמצע החזה-לחלקו האחורי של הראש עם קוצץ. הסר פרווה מגולחת באמצעות ואקום מצויד במסנן HEPA.
5. החל פתרון בבטאדין לאזור המגולח כלקרצף כירורגית לאחר מכן לנקות את האזור עם מגבוני אלכוהול איזופרופיל 70%.
6. השתמש בלהב סכין המנתחים לבצע חתך קו האמצע 3-4 סנטימטר בעור מהבסיס של הראש caudally עד אמצע חזה.
7. זהה את קו האמצע של קדמי fascia ושרירים תת עורי לבלוטה לשנת החורף בצוואר התחתון; לחתוך את שריר הטרפז ושרירים אחרים לאורך קו האמצע כדי להפחית דימום.
8. מצא את קו האמצע של שני אזורים של רקמת שומן שבבסיס השרירים; לחתוך את שרירי paraspinous caudally קפדנות לאורך קו האמצע, ושכבות שרירים נפרדות באמצעות מפשק רקמה קטן עד לרמה של T2 החזה הוא הגיע תהליך spinous.
9. לזהות וחתך את השרירים הקשורים לתהליך spinous T2 לנצל thiמבנה של כנקודת ציון אנטומיים.
10. הסר את קצה הסחוס של תהליך spinous T2 כדי לשפר את הנראות של חוליות צוואר.
11. הפרד את שרירי paraspinal רוחבי מהתהליכים והרבדים של C4-T1 spinous; עם זאת, לחוס על השרירים המכסים על lamina C3 כדי למנוע דימום.
12. חותך את השרירים על הרבדים מC4-T1 רוחבי כלפי ההיבטים משני צידי עמוד השדרה.
13. לאחר רבדי השדרה חשופים, המקום חי על פני השטח הגחון שלה בערוץ בצורת U של המייצב.
14. זהה את החוליה C5 על ידי ספירת תהליכי spinous rostrally מאתר T2 לT1, C7, C6, ולבסוף C5.

2. ייצוב החוליות וביצוע פגיעה ההשפעה

1. מקם את שתי זרועות פלדת אל-חלד של המייצב להשעות את בעלי החיים על ידי הצבת את הקצוות המשוננים של הנשק מתחת לLateraהיבטי l של C5-6 החוליות (איור 1 ג). לאחר הבטחת הנשק עם חוליות במקום (איור 2), להתאים את מנגנון הייצוב כדי להבטיח את עמוד השדרה הוא ברמה ומרוכזת. לבסוף, לנעול את הנשק על ידי הידוק הברגים של המייצב.
2. חותך את הרצועות בין תהליכי השדרה והרבדים בC4-5 וC5-6 לזהות את השוליים של lamina C5.
3. שימוש במייקרו-rongeur, קליפ משם חצי מlamina בצד הימין בC5 כמיועד לSCI (איור 5 ג-E). אחרי laminectomy, להעביר את החיה עם המייצב תחת מכשיר פציעה. אבטח את בעלי החיים יחד עם מייצב בהר (איור 3 א-ג) כדי ליישר בדיוק את הבוכנה על יעד חוט השדרה באמצעות מיקרו-מניפולטור לרוחב (איור 3).
4. בהגדלה גבוהה, לאתר את אזורי C5 ו C6 כניסת שורש הגבי (DREZs) על פני השטח בחוט השדרה הגבי החשוף ללא durotomy. כוון את הבוכנה באמצע שני DREZs המזוהה ובאמצע הדרך בין קו האמצע והקצה לרוחב של חוט השדרה (איור 5).
5. שימוש במכשיר Impactor NYU / MASCIS עם קצה קוטר 2.5 מ"מ (איור 3 א וב), לייצר חמי-חבלת C5 (איור 5 & E) על ידי ירידה בגובה 10 מוט g x 12.5 מ"מ (איור 2 א).
6. ודא הפגיעה חזותית על ידי חבורות על חוט השדרה (איור. 5E, חץ) ולבדוק את הפרמטרים פגיעה הניתנים על ידי התוכנה באוניברסיטת ניו יורק ^12,17 (איור 6).
7. שרירי תפר ורקמות רכות עם תפר 4-0 vicryl סטרילי, אז לסגור את החתך בעור עם סיכות כירורגי (קליפים EZ).
8. החל משחה אנטי-בקטריאלי לאתר כירורגית.
9. נהל 5.0 מיליליטר של תת עורי מלוח 0.9% סטרילי לבעלי החיים לטיפול בהתייבשות.
10. מניחים את החיה בחוםסביבת -controlled (הסירקולציה המחודשת padcage מים חם על כרית חימום)) עם מזון לח הניתן על המצעים (שינו יומי), ובקבוק מים עם זרבובית ארוכה לגישה קלה מונחת על הרצפה של הכלוב. לספק טיפול על מנת להבטיח התאוששות נאותה לפני החזרת בעלי החיים לכלוב בבית.
11. היות שמדובר בפציעה contusive צוואר רחם חד צדדית, בעלי החיים צפויים לאבד את הפונקציה של forelimb ipsilateral, זמנית, אשר מתחילה להתאושש בשבועות הראשונים לאחר פציעה. עם זאת, פונקציה הנגדית צריכה להישאר שלמה, ובכך בעלי החיים צריכים להיות מסוגלים לאכול ולשתות בלי ירידת ערך, ויש לי ירידת ערך קטין רק בתנועה וטיפוח.

על בעקבות פרוטוקול זה, SCI חמי-צוואר רחם contusive העקבי והשחזור מופק (איור 5 ו -6). השימוש במייצב השדרה כדי לייצב את התהליכים הרוחביים של אותה החוליה ברמה המיועדת לSCI מאפשר לתוצאות משביעות רצון כזה. באמצעות שיטה זו, לא רק החוליה יעד C5, אלא גם C4 הסמוך וC6 הן קבועות ונוקשה.

התוכנה באוניברסיטת ניו יורק / MASCIS מספקת לקריאה עם גרף שנקבע על x וציר y, ותומכת בשימוש בשיטת ייצוב השדרה שלנו, וציוד (איור 6). שיטה זו של ייצוב מפחיתה שונות פציעה שיכול להיגרם כתוצאה מההסטה כלפי מטה של רקמת המטרה ועמוד השדרה (איור 1). בעקבות פציעה, שטף דם כחלחל חד-צדדי ברור מרוכז בין C5 ו C6 DREZs הוא (5E איור) הגלוי. הפרמטרים פציעה אלה עולים בקנה אחד מבעלי החיים לanimal פי הקריאה הניתנת על ידי התוכנה באוניברסיטת ניו יורק / MASCIS (איור 6).

כחמה-החבלה בצוואר הרחם מייצרת גירעונות forelimb ברורים, מודל זה הוא אידיאלי להערכת יכולות forelimb פונקציונליות כגון לכת, טיפוח ^13, ומתנגד מניפולציה ^18-19. כגירעונות מנוע hindlimb פחות בולטים, באסו, ביטי וBresnahan (BBB) ​​בקנה מידה הניקוד של תנועה ⁴ אינו מתאימה לשימוש במודל זה. התוצאה התפקודית בעקבות פציעה היא בולטת ביותר בגירעונות פושטי כף ipsilateral, שבו העכברוש מציג "אלות" אגרוף עם כל הספרות מכווצת ^18. כל בעלי החיים שנחשפו לאותה חומרת פציעה ורמה של חוט השדרה צריכים להפגין גירעונות דומים לforelimb ipsilateral המאויר בפרוטוקול זה, על פציעה נכונה. בעלי חיים פצועים בצורה לא נכונה עשויים להציג עם ביטוי ומשך שונים מאוד של הגירעונות ^13,18.

בהיסטולוגיה, מודל זה מייצר נזק חומר אפור ולבן נרחב במוקד הפגיעה והמקורי ואת הזנב לאתר של פציעה, שמוביל להיווצרות נגע והחלל ניכרת הכיל כמעט אך ורק בצד הפצוע של חוט השדרה. גדולות צורות, והתבסס בעיקר על astrocyte צלקת גליה בגבולות הנגע עם מוות עצבי מסיבי ^18.

איור 1: איור של גמישות עמוד השדרה במהלך SCI contusive עם שיטות הידוק שונות. דמויות וגמישות B תכנית או "תשואה" של עמוד השדרה כאשר תהליכי spinous הם הידקו dorsally, המאפשרים להשפעות בלתי ראויות והנתונים עולים בקנה אחד. האיור שמוצג במציג הרבה יותר גמישות בעת פגיעה (קו אדום מקווקווחצים מעוגלים גדולים בהשוואה למה שמופיע בB) (חיצים מעוגלים קטנים יותר), כמו מלחציים הם רחוקים יותר מהאתר של laminectomy ופציעה. תרשים ג מציג ייצוב לרוחב עם המכשיר שתואר עם הזרוע המייצבת המהודקת היטב מתחת לתהליך הרוחבי של החוליה שבו האתר של השפעה יבוצע. אין גמישות של עמוד השדרה במהלך הליך זה, כחוליה של עניין הוא התייצבה לחלוטין.

איור 2: Impactor NYU / MASCIS ומכל ייצוב מותאם אישית. איור מציג את החלקים ותכונות של מכשיר פגיעה בחוט השדרה באוניברסיטת ניו יורק / MASCIS, עם הגדרות מרובות גובה מוט לחומרת פציעה (הבלעה). דמויות B ו- C להמחיש את המכל בצורת U שמחזיקחולדה, וזרועות הייצוב משוננות זה מאובטח לייצב את עמוד השדרה במהלך ניתוח ופציעה (תוכנן והופק על ידי YP Zhang).

איור 3: הרכבה מותאמת אישית מערכת וmicroadjuster רוחב על Impactor NYU / MASCIS איור מפרט את המרכיבים השונים של מערכת ההרכבה המותאמת אישית עבור מייצב חולדה בצורת U לפגיעה בחוט השדרה.. הערה microadjuster לרוחב בדמות, החיוני ליישור מדויק של חוט השדרה העכברוש לפציעה. איורים B ו- C לספק תיאור נוסף של המייצב ללא (B) ועם המכל בצורת U חולדה (C) ביחס לחשוב אחרים רכיבים של מכשיר פציעה (שתוכנן מערכת הרכבה והופקו על ידי YP Zלהיתקע).

איור 4:. מדידות של הרכיבים הבודדים של מכשיר הייצוב כירורגי וקבצים מצורפים לכל רכיב של מערכת הייצוב המותאם אישית מודגש כדי להראות את הממדים ואת קנה מידה (A, C, ו- D). זרועות חזה ייצוב (B) מוצגות כדי להציג את יישום הפוטנציאל של המכשיר הזה לשימוש בדגמים ניתוחיים עמוד השדרה שונים.

איור 5: ציוני דרך כירורגי והכנה לפגיעה בחוט השדרה חמי-חבלה בצוואר הרחם. דמויות וB להציג את ציוני הדרך הנכונות לImpa הנכוןיישור ct על חוט השדרה העכברוש נחשף. נקודת ההשפעה המתאימה היא ישירות בין שורשי C5 ו C6 גב העצב (מקורי, זנב) וקו האמצע והקצוות לרוחב של חוט השדרה (B). תכנית לספירה דמויות, בהגדלה גבוהה יותר, התהליך של חשיפת המחצית הרצויה של כבל צוואר רחם השדרה לפציעה, באמצעות laminectomy חד-צדדי זהיר. כמו כן, דמויות D ו- E להפגין את הכבל מייד לפני ואחרי פציעת חבלה בחוט השדרה. שים לב לדימום הגלוי (E) הנגרמת על ידי ההשפעה (החץ השחור).

איור 6 :. דוגמאות למקובלות לעומת קריאות נתונים בלתי מתקבלות על הדעת הבאה השפעה עם Impactor NYU / MASCIS. הגרף העליון (A) וערכת נתונים עליונה (C) להמחיש קריאה של השפעה טובה מאוד, עם מדידות נתונים של "שגיאת%" למהירות השפעת מוט, גובה ראשוני, ומתחילים זמן, כפי שצוין בחץ האדום וקו תחתון. כל הערכים ליפול גם בתוך החלון של שגיאה מקובלת. לעומת זאת, הפנל התחתון מראה נתונים שהופקו על ידי השפעה בלתי ראויה הנגרמת על ידי ייצוב לא תקין של עמוד השדרה (B) וטעייה ב" איפוס "של מוט Impactor ולהטות על פני השטח בחוט השדרה, לפני הגדרת הגובה של מוט Impactor (C). שים לב לשגיאה המשמעותית מותווה לגובה הראשוני וזמן התחלה של ירידת Impactor, כפי שצוין על ידי החץ האדום וקו תחתון. התוכנה גם מספקת אזהרת השגיאה שזוהתה לפרמטרים אלה (חלק תחתון של הפנל C).

כאן יש לנו הפגנו שיטת ייצוב עמוד השדרה הצווארי לייצור SCI contusive חד-צדדי בC5. שיטת ייצוב זה מגדילה את הדיוק של הטראומה מבחינה אנטומית ומייצרת ^13,18 גירעונות תפקודיים עולים בקנה אחד. בדגמים אחרים המסתמכים על הידוק גב של תהליכי spinous, את הסיכון לניזק תהליך spinous או ניתוק של מלחציים מהחוליה הוא גבוה למדי. מודלים אלה גם עשויים לאפשר עמוד השדרה ניכרת הסטה וכנועה מכוח החבלה והאופי גמיש של עמוד השדרה וחוליות עמודים (איור 1 א 'וב'). רקמת מניב משנה את זמן מגע בוכנה-רקמה ותוצאות בכוח פגיעה בלתי צפוי (איור 1 א-B & 6B). ייצוב החוליות תאר מספק גם הטבות אחרות להכנה כירורגית: 1) שיטה זו מייצבת את החוליות מרוכזות בC5 תחת מלאהמיקרוסקופ הניתוחי המגדיל את הדיוק של laminectomies (איור 1 ג); 2) בעלי החיים רכובים בתוך המייצב בצורת U ניתן לקחת ישירות מהמיקום כירורגית לקובץ מצורף ההרכבה המותאם אישית, אשר ימנע את ההליך של לתלות שוב את בעלי החיים בהתקני SCI וחוסך זמן; ו 3) ייצוב החוליות ברמת הפציעה וישירות גב וזנב לאתר המיועד לפציעה יכולה לצמצם את תנועת הגוף שנגרמה על ידי נשימה מאוד, אמת מידה נוספת כדי להפחית את השונות.

היתרון העיקרי של שימוש בשיטה זו הוא ייצוב הכמות המופחתת של מניב, או תנועת הגחון של חוט השדרה ועמודה בעת הפגיעה. המבוססים על פיסיקה פשוטה של ​​פגיעת חבלה, הכוח והאנרגיה של ההשפעה יעבירו מהמוט לחוט השדרה, באופן אידיאלי עם הכבל סופג את האנרגיה הזו באתר של השפעה. עם זאת, אם תשואות עמוד השדרה מתחת לכבל, כאפשריותבשיטת הידוק spinous הגב (איור 1 א & B), הכוח האמיתי להחיל את הכבל הוא ירד ומשתנה, בהתאם למידת תשואה.

למרות שהסרטון הזה ממחיש את ההליך כולו של מודל SCI contusive צוואר רחם, את מהותו של מאמר זה היא המבוא של שיטת ייצוב השדרה אנו משתמשים ביישומים שונים במעבדה שלנו, במיוחד ללימודי SCI. גרסה שונה של מכשיר ייצוב זה ושיטה נעשתה שימוש בעכברים SCI ^23. שיטה פשוטה זו של ייצוב עמוד השדרה היא שימושית ביותר עבור מחקר SCI, ויש לנו בעבר השתמש בשיטה זו וציוד לביצוע חבלת חזה וכן מודלים SCI חתך. מעבדה נוספת לאחרונה תיארה וריאציה של צורה זו של ייצוב לפציעה בצוואר הרחם ביומן הזה ^22. לסיכום, אנו מציגים שיטת ייצוב זה רומן חוליות לכמה surgicנהלי אל ליצירת SCI הניסיוני לשחזור החל laminectomy לייצור פציעה. היתרונות של מכשיר ייצוב זה אינם מוגבלים לחבלה בעמוד השדרה הצווארי, כשיטת ייצוב זה הותאמה למגוון רחב של ניסויים כגון זריקות תוך-השדרה, השתלה סלולרית, אוסף CSF מmagna, פציעות hemisection וחיתוך הרוחב Cisterna, פציעות חבלת חזה, בתחום ההדמיה vivo העסקת שני פוטונים במיקרוסקופ, והקלטת אלקטרו השדרה. שיפור האיכות של ניתוחים ופגיעה בעמוד השדרה והפחתת השונות הניסיוניות תעזור לספק תובנה מנגנונים אמיתיים של פציעה והתאוששות, ולהקרין את ההשפעות של טיפולים שונים על ההפרעה ההרסנית של SCI.

יש לנו מה למסור.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות [NS36350, NS52290, וNS50243 לX-MX]; מארי Hulman ג'ורג 'קרן קרן; מדינת אינדיאנה; ולאומי למחקר שירות פרס רות ל 'Kirschstein (NRSA) 1F31NS071863 לCLW