Les compartiments endolysosomales sont les plus petits organites des cellules. Les techniques électrophysiologiques traditionnelles sont incapables de mesurer directement leurs changements de tension et de courant. La technique du patch-clamp endolysosome permet des enregistrements directs, ce qui nous permet d’étudier auparavant dans les canaux ioniques.
Le principal défi expérimental est que tous les composés n’élargissent pas efficacement les lysosomes. Il est difficile d’identifier les cellules appropriées, et même avec des lysosomes idéaux, l’enregistrement réussi des canaux ioniques n’est pas garanti. Nous avons développé la technique de clamp endolysososome pour permettre des enregistrements électrophysiologiques directs à partir de membranes endolysosomales.
Cette percée nous a permis de caractériser les canaux ioniques, tels que les TRPML et les TPC, révélant leurs rôles dans la défense des agents pathogènes, la dégénérescence des neurones et les troubles métaboliques. Notre méthode permet d’enregistrer directement les canaux ioniques lysosomaux, en surmontant les limites de taille des patch-clamps de cellules entières et en améliorant la sélection des vésicules tout en intégrant des techniques basées sur la fluorescence. Pour commencer, installez le tube capillaire dans l’polaire.
Appuyez sur le bouton vert du clavier. Desserrez le bouton de serrage et retirez les pipettes tirées de la polaire. Ensuite, placez les pipettes à patch tiré dans le support Microforge.
Inspectez les pointes de pipette à l’aide d’un objectif 35x, combiné à un oculaire 15x pour un grossissement total de 525x. Utilisez le micro-manipulateur pour rapprocher les pipettes patch du filament. Réglez le cadran de température sur 80.
Une fois le radiateur allumé, appuyez sur la pédale de commande et maintenez-la enfoncée pendant une à deux secondes pour appliquer une brève impulsion de chaleur. Après le polissage, placez les pipettes polies dans une boîte scellée pour éviter la contamination par la poussière. Ajoutez un millilitre de la solution de bain dans la chambre.
Retirez une lamelle avec des cellules HEK 293 traitées de la plaque à 24 puits. Transférez la lamelle dans la chambre du microscope. À l’aide d’une aiguille de remplissage en plastique faite maison, remplissez la pipette d’isolement avec la solution de pipette.
Installez la pipette remplie à l’extrémité avant de la configuration de la pince à patch. Sous un microscope avec un objectif 40x et un oculaire 10x, déplacez la pipette d’isolement près des endosomes ou des lysosomes suffisamment agrandis. Abaissez la pipette d’isolement à l’aide du micromanipulateur jusqu’à ce qu’elle touche le bord de la membrane plasmique.
Déplacez rapidement la pipette pour arracher un petit morceau de la membrane. À l’aide de la même pipette, appuyez sur la cellule du côté opposé pour extraire les endosomes/lysosomes à environ deux micromètres de la cellule. Remplissez une pipette patch fraîchement polie avec la solution de pipette appropriée.
Installez la pipette à l’extrémité avant de l’amplificateur. Appliquez une pression positive de 20 à 50 millibars sur la pipette et maintenez-la en verrouillant la valve. Ensuite, déplacez la pointe de la pipette dans la solution de bain et positionnez-la au centre du champ de vision.
Appliquez des impulsions de courant répétées pour déterminer la résistance de la pipette, la résistance d’étanchéité et la résistance en série. Surveillez la taille de la pointe de la pipette, la formation des joints et l’établissement de l’ensemble de la configuration endolysosomale. Déplacez rapidement la pipette près du haut de la vésicule cible.
Observez le mouvement ou le roulement de la vésicule en raison de l’écoulement du fluide de la pipette. Ajustez la tension de décalage de la pipette à zéro millivolts. Relâchez immédiatement la pression positive pour attirer la vésicule vers la pipette, formant un gigaseal en une seconde.
Pour l’enregistrement de la vésicule entière, utilisez une impulsion courte à haute tension de deux à cinq millisecondes pour perturber la membrane au point de contact entre la pipette et l’organite. Réglez la tension de 500 à 1000 millivolts. Pour enregistrer le courant, effectuez des expériences de pince de tension endolysosomale en utilisant une large gamme de tensions d’entrée pour évaluer les propriétés de la membrane.
Au cours de la formation du gigaseal, la réponse actuelle a diminué rapidement, indiquant l’établissement réussi du mode attaché au lysosome. L’application répétée de courants enregistrés de tension d’entrée continue à travers la membrane endolysosomale, montrant des courants basaux, activés par des agonistes et des courants de fuite.
