用于单个内溶酶体囊泡分析的膜片钳技术

内溶酶体区室是细胞中最小的细胞器。传统的电生理技术无法直接测量其电压和电流变化。内溶酶体膜片钳技术可实现直接记录，使我们能够在离子通道中进行先前的研究。

主要的实验挑战是并非所有化合物都能有效地扩增溶酶体。识别合适的细胞很困难，即使使用理想的溶酶体，也不能保证成功的离子通道记录。我们开发了内溶酶体膜片钳技术，可实现来自内溶酶体膜的直接电生理记录。

这一突破使我们能够表征离子通道，例如 TRPML 和 TPC，揭示它们在病原体防御、神经元变性和代谢紊乱中的作用。我们的方法能够直接记录溶酶体离子通道，克服全细胞膜片钳大小限制，并在整合基于荧光的技术的同时改进囊泡选择。首先，将毛细管安装到极轴中。

按下键盘上的绿色拉动按钮。松开夹紧旋钮，从极性中取出拉出的移液器。接下来，将拉取的贴片移液器放入 Microforge 支架中。

使用 35 倍物镜和 15 倍目镜检查移液器吸头，总放大倍数为 525 倍。使用微型纵器将贴片移液器靠近灯丝。将温度旋钮设置为 80。

加热器打开后，按住脚踏开关 1 到 2 秒钟以施加短暂的热脉冲。抛光后，将抛光后的移液器放入密封盒中，以防止灰尘污染。向腔室中加入 1 毫升浴液。

从 24 孔板中取出装有处理过的 HEK 293 细胞的盖玻片。将盖玻片转移到显微镜室中。使用自制的塑料填充针将移液器溶液填充到隔离移液器中。

将装满的移液器安装在膜片钳装置的前端。在具有 40 倍物镜和 10 倍目镜的显微镜下，将分离移液管移动到足够扩大的内体或溶酶体附近。使用微型纵器降低隔离移液器，直到它接触到质膜边缘。

快速移动移液器以撕下一小块膜。使用相同的移液管，从另一侧按压细胞，以从细胞中挤出约 2 微米的内体/溶酶体。用适当的移液器溶液填充新抛光的补片移液器。

将移液器安装在放大器的前端。对移液器施加 20 至 50 毫巴的正压，并通过锁定阀门来保持压力。接下来，将移液器吸头移入浴液中，并将其置于视野的中心。

应用重复电流脉冲以确定移液器电阻、密封电阻和串联电阻。监测移液器吸头尺寸、密封形成和整个内溶酶体配置的建立。快速将移液器靠近目标囊泡的顶部。

观察由于液体从移液器流出而产生的囊泡移动或滚动。将移液器的偏移电压调整为零毫伏。立即释放正压，将囊泡拉向移液器，在一秒钟内形成 gigaseal。

对于整个囊泡记录，使用 2 到 5 毫秒的高压短脉冲来破坏移液器和细胞器之间接触点处的膜。将电压设置为 500 到 1000 毫伏。为了记录电流，使用宽范围的输入电压进行溶酶体电压钳实验，以评估膜特性。

在 gigaseal 形成过程中，电流响应迅速降低，表明溶酶体连接模式成功建立。重复施加连续输入电压记录了穿过内溶酶体膜的电流，显示基础电流、激动剂激活电流和泄漏电流。