Ce protocole décrit comment induire l’autophagie dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster via l’épuisement des acides aminés et comment analyser les différences d’autophagie entre clones mutants. Comme l’autophagie est très sensible à la disponibilité nutritionnelle dans les conditions de culture, l’analyse clonale, une méthode qui analyse les cellules mutantes par rapport aux cellules de type sauvage dans le même tissu, présente un avantage dans la dissection des défauts d’autophagie. Commencez par introduire trois mâles et 15 femelles adultes dans un flacon de culture avec de la semoule de maïs ou de la mélasse standard ou de la gélose Drosophila media à 25 degrés Celsius pour l’accouplement.
48 heures après l’induction, tapoter le flacon d’accouplement jusqu’à ce que les mouches soient assommées et descendre sur le support à la base du flacon. Débranchez le flacon d’accouplement et couvrez sa bouche avec un flacon de culture inversé débranché avec un média frais. Ensuite, retournez et tapotez les flacons pour transférer les mouches dans le flacon de culture fraîche.
Branchez le flacon de culture fraîche et jetez l’ancien flacon. Placez le flacon de culture fraîche dans un incubateur à 25 degrés Celsius pour la ponte sur le support frais. Retirer les mouches après six heures de ponte et jeter les mouches en les jetant dans une fiole contenant 75% d’éthanol.
Incuber le flacon avec des embryons dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant une heure pour induire l’expression de la flippase. Par la suite, placez-les dans un incubateur à 25 degrés Celsius et permettez aux embryons de continuer à se développer. À l’aide d’une spatule de laboratoire, prélever le milieu contenant les larves en développement dans une boîte de Petri 75 heures après la ponte.
Ajouter 1X PBS à la capsule et séparer délicatement les milieux de culture et les larves à l’aide de longues pinces. Sélectionnez ensuite 10 à 15 larves du troisième stade précoce. Remplissez les puits d’une plaque de point de dépression en verre à neuf puits avec 1X PBS et placez les larves séparées du troisième stade dans les puits à l’aide de longues pinces.
Lavez soigneusement les larves pour éliminer tous les résidus du milieu. Prélever cinq millilitres de solution de saccharose à 20% dans un flacon vide et placer les larves propres du troisième stade dans cette solution à l’aide de longues pinces. Incuber ce flacon dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant six heures avant de les récolter pour la dissection.
Ajouter 1X PBS dans chaque puits de la plaque spot de dépression en verre à neuf puits et transférer les larves dans les puits avec de longues pinces. Placez une larve dans un puits avec la face dorsale tournée vers le haut. Saisissez la cuticule de la larve avec deux pinces 5 au milieu du tronc larvaire et déchirez doucement les cuticules.
Les corps adipeux exposés, ainsi que d’autres tissus internes larvaires, seront toujours attachés à la carcasse de la larve. Tirez suffisamment pour exposer les organes internes autant que possible. Répétez cette étape pour toutes les larves.
Transférer la carcasse larvaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de 4% PFA et incuber pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius sans agiter les tubes. Après 30 minutes, extraire à la pipette la solution de PFA. Ajouter 500 microlitres de 1X PBS dans le tube.
Secouez doucement le tube sur un rotateur plat pendant 10 minutes, puis jetez la solution 1X PBS. Répétez cette opération trois fois. À l’aide de longues pinces, transférer la carcasse larvaire fixe et lavée dans un puits dans la plaque de neuf points de dépression remplie de 1X PBS.
Enlevez tous les tissus non gras du corps avec 5 pinces. Enfin, montez les morceaux du corps gras sur une lame de microscope en utilisant 80% de glycérol comme support de montage et posez une lamelle de couverture sur le dessus. Le mutant un et le mutant deux sont deux mutants mortels indépendants sur le chromosome X et les mouches grises blanches isogénées FRT 19A servent ici de contrôle.
Les profils GFP-Atg8a ont été analysés dans les corps graisseux larvaires de la mosaïque témoin, mutante ou mutante, et les clones mutants ou les clones témoins ont été marqués négativement par RFP. Dans les clones témoins, les profils de GFP-Atg8a Puncta étaient similaires à ceux des cellules RFP positives environnantes. Dans les clones mutants un, les GFP-Atg8a Puncta ont été considérablement réduits.
Et chez les clones mutants à deux mutants, le nombre et la taille de GFP-Atg8a Puncta ont augmenté. Le stade de développement des larves est critique ici. Le temps de développement et la durée de la famine doivent être modifiés en fonction des recettes de milieu de culture de chaque laboratoire.
Cette procédure peut être appliquée pour explorer l’autophagie sélective. Par exemple, la mitophagie peut être surveillée dans les corps adipeux des mouches en attachant une protéine fluorescente à une séquence de ciblage mitochondrial.
