Este protocolo describe cómo inducir la autofagia en el cuerpo de grasa larvaria de Drosophila melanogaster a través del agotamiento de aminoácidos y cómo analizar las diferencias en la autofagia entre clones mutantes. Como la autofagia es altamente sensible a la disponibilidad de nutrición en condiciones de cultivo, el análisis clonal, un método que analiza células mutantes frente a células de tipo salvaje en el mismo tejido, tiene una ventaja en la disección de defectos de autofagia. Comience introduciendo tres machos y 15 hembras de mosca adulta en un vial de cultivo con harina de maíz estándar o melaza o agar Drosophila media a 25 grados centígrados para el apareamiento.
A las 48 horas después de la inducción, golpee el vial de apareamiento hasta que las moscas estén aturdidas y caiga sobre el medio en la base del vial. Desenchufe el vial de apareamiento y cubra su boca con un vial de cultivo invertido desenchufado con medios frescos. Luego voltee y golpee los viales para transferir las moscas al vial de cultivo fresco.
Tapar el vial de cultivo fresco y desechar el vial viejo. Coloque el vial de cultivo fresco en una incubadora de 25 grados centígrados para la puesta de huevos en el medio fresco. Retire las moscas después de seis horas de puesta de huevos y deseche las moscas vertiéndolas en un matraz que contenga 75% de etanol.
Incubar el vial con embriones en un baño de agua de 37 grados centígrados durante una hora para inducir la expresión de flippasa. Posteriormente, colóquelos en una incubadora de 25 grados centígrados y permita que los embriones continúen desarrollándose. Usando una espátula de laboratorio, saque los medios que contienen las larvas en desarrollo en una placa de Petri 75 horas después de la puesta de huevos.
Agregue 1X PBS al plato y separe suavemente los medios de cultivo y las larvas con pinzas largas. Luego seleccione de 10 a 15 larvas tempranas del tercer estadio. Llene los pocillos de una placa de depresión de vidrio de nueve pocillos con 1X PBS y coloque las larvas separadas del tercer estadio en los pozos usando pinzas largas.
Lave bien las larvas para eliminar todos los residuos de medios. Tome cinco mililitros de solución de sacarosa al 20% en un vial vacío y coloque las larvas limpias del tercer estadio en esta solución usando fórceps largos. Incubar este vial en una incubadora de 25 grados centígrados durante seis horas antes de cosecharlos para la disección.
Agregue 1X PBS en cada pocillo de la placa de depresión de vidrio de nueve pocillos y transfiera las larvas a los pozos con pinzas largas. Coloque una larva en un pozo con el lado dorsal hacia arriba. Agarre la cutícula de la larva con dos 5 pinzas en el medio del tronco larvario y abra suavemente las cutículas.
Los cuerpos grasos expuestos, junto con otros tejidos internos larvales, todavía estarán unidos a la carcasa de la larva. Tire lo suficiente para exponer los órganos internos tanto como sea posible. Repita este paso para todas las larvas.
Transfiera la carcasa larval a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de PFA al 4% e incube durante 30 minutos a 25 grados centígrados sin agitar los tubos. Después de 30 minutos, pipetear la solución de PFA. Agregue 500 microlitros de 1X PBS en el tubo.
Agite suavemente el tubo en un rotador plano durante 10 minutos y luego deseche la solución 1X PBS. Repita esto tres veces. Usando fórceps largos, transfiera la canal larval fija y lavada a un pocillo en la placa de nueve puntos de depresión llena de 1X PBS.
Retire todos los tejidos corporales no grasos con 5 fórceps. Finalmente, monte las piezas del cuerpo graso en un portaobjetos de microscopio utilizando 80% de glicerol como medio de montaje y coloque un cubreobjetos en la parte superior. El mutante uno y el mutante dos son dos mutantes letales independientes en el cromosoma X y las moscas FRT 19A blancas amarillas isogenizadas sirven como control aquí.
Los patrones GFP-Atg8a se analizaron en los cuerpos de grasa larvales de control, mutante o mutante de dos larvas en mosaico, y los clones mutantes o clones de control fueron marcados negativamente por RFP. En los clones de control, los patrones de GFP-Atg8a Puncta fueron similares a los de las células RFP positivas circundantes. En los clones mutantes de un mutante, los GFP-Atg8a Puncta se redujeron considerablemente.
Y en dos clones mutantes, los números y el tamaño de GFP-Atg8a Puncta aumentaron. La etapa de desarrollo de las larvas es crítica aquí. El tiempo de desarrollo y la duración de la inanición deben modificarse de acuerdo con las recetas del medio de cultivo de cada laboratorio.
Este procedimiento se puede aplicar para explorar la autofagia selectiva. Por ejemplo, la mitofagia se puede monitorear en cuerpos de grasa de mosca uniendo una proteína fluorescente a una secuencia de orientación mitocondrial.
