يتيح هذا البروتوكول التنظيم الذاتي التلقائي لكتل الأنابيب الدقيقة باستخدام رابط متقاطع مضاد للتوازي ، MAP65. يمكن أن يساعدنا هذا النظام على فهم تنظيم الأنابيب الدقيقة والأنظمة البيولوجية مثل المغزل الانقسامي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نظام بسيط يمكنه إعادة إنشاء أشكال تشبه المغزل للأنابيب الدقيقة القابلة للتكرار بشكل كبير ويمكن الوصول إليها من قبل العديد من المختبرات.
هذه الطريقة لا تنطبق فقط على الأنظمة الخلوية ، ولكن يمكن أن تكون أيضا بمثابة نموذج لدراسات البلورات السائلة متوسطة النطاق. لتحضير التوبولين ، أخرج أولا أليكوت من التوبولين غير المسمى الذي يحتوي على ملليغرام واحد من التوبولين المجفف بالتجميد من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ به على الجليد. ثم أضف 200 ميكرولتر من PEM-80 البارد.
لإذابة كل الليوفيلات ، احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أخرج أنبوبا من التوبولين المسمى بالرودامين يحتوي على 20 ميكروغرام من مسحوق التوبولين المجفف بالتجميد من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر واحتفظ به على الجليد. ثم ، أضف أربعة ميكرولترات من PEM-80 البارد واحتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق لإذابة كل الليثوفيلات.
بمجرد أن تذوب التوبولين المجمدة بالتجميد ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوبولين المعاد تعليقه غير المسمى إلى محلول التوبولين المسمى بالرودامين المكون من أربعة ميكرولترات. ثم ، امزج المحاليل عن طريق الأنابيب من ست إلى سبع مرات ببطء شديد. لتخزين ال 100 ميكرولتر المتبقية من محلول التوبولين غير المسمى ، أولا ، أدخل الأنبوب في النيتروجين السائل لتجميد المحلول ، ثم احتفظ بالأنبوب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام في المستقبل.
بعد ذلك ، قم بتوزيع مزيج التوبولين في سبعة أنابيب جديدة بإضافة 15 ميكرولتر في كل منها. قم بتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل كما هو موضح سابقا وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في المستقبل. لتجميع غرف التدفق لإجراء التجارب ، أولا ، قم بتنظيف شريحة زجاجية بالماء المقطر المزدوج وجففها بمسح مختبري خال من الوبر.
بعد ذلك ، قم بتنظيف الشريحة أولا باستخدام الإيثانول متبوعا بالماء المقطر المزدوج. لإنشاء مسار تدفق، قم بقص قطعة من الشريط على الوجهين بطول 40 إلى 50 ملم. ثم ، قم بتقسيمه بينهما لإنشاء شريطين أرق من الشريط ووضع الشريطين على الشريحة على بعد خمسة إلى ثمانية ملليمترات.
بعد ذلك ، ضع زلات الغطاء المائلة أعلى مسار التدفق. بعد ذلك ، قم بإغلاق الشريحة والغطاء الذي تم انزلاقه شرائط الشريط على الوجهين عن طريق الضغط برفق على منطقة الشريط باستخدام الجزء الخلفي من القلم. إذا كان الختم مصنوعا بشكل جيد ، فيجب أن يتحول الشريط من شفاف إلى واضح.
لإزالة الشريط الإضافي على الحواف ، قم بقص الشريط بشفرة حلاقة ، تاركا ملليمترا واحدا فقط من مدخل غرفة التدفق. بعد ذلك ، قم بتسمية الغرفة بمعلمات تجريبية مناسبة لإجراء تجارب tactoid ، أولا ، قم بإذابة جميع الكواشف اللازمة على الجليد وتخزينها على الجليد أثناء العمل. بعد ذلك ، قم بتغطية غرفة التدفق ب 20 ميكرولتر من 5٪ من الفاعل بالسطح من البوليمر المشترك غير الأيوني المذاب في PEM-80 مع قطرات صغيرة في طرفي الغرفة لمنع تكوين فقاعات الهواء في الداخل.
بعد ذلك ، احتفظ بغرفة التدفق في غرفة رطبة مصنوعة من طبق بتري مع مسح مختبري رطب خال من الوبر لمدة خمس إلى سبع دقائق على الأقل. بعد ذلك ، امزج PEM-80 و GMPPPPPP و Pluronic F-127 و dithiothreitol و glucose و polyethylene glycol ومزيج tubulin المصنوع في وقت سابق و MAP65 مع GFP MAP65 للتصور في أنبوب معقم عن طريق السحب من خمس إلى ست مرات ، مع الحفاظ على الأنبوب على الجليد. ثم ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخلوط مسبقا من أوكسيديز الجلوكوز والكاتالاز في أنبوب خليط tubulin-MAP واخلطه مرة أخرى عن طريق الأنابيب من سبع إلى ثماني مرات.
قسم الحجم الإجمالي للمحلول إلى جزأين لاستخدامهما في غرف منفصلة. وفي الوقت نفسه ، يجب إزالة السائل المضاف سابقا إلى غرفة التدفق عن طريق العمل الشعري باستخدام مسح مختبري خال من الوبر في الطرف الآخر من الغرفة ، إلى جانب إضافة مزيج tubulin-MAP إلى غرفة التدفق. بمجرد أن تكون العينة داخل الغرفة بالكامل ، قم بإغلاق طرفي الغرفة باستخدام الإيبوكسي لمدة خمس دقائق واحتفظ بها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا لنواة ونمو تاكتويد الأنابيب الدقيقة.
لتصوير اللباقات بواسطة المجهر الفلوري ، استخدم الأهداف ذات الفتحة العددية 1.2 أو أكثر في تكبير 60X أو أعلى لجمع ما يكفي من الضوء في التألق. سجل الصور باستخدام أشباه الموصلات المعدنية المجانية أو كاميرا جهاز مقترنة بالشحن. للحفاظ على العينة، احتفظ بها في غرفة بيئية محددة عند 37 درجة مئوية.
بدلا من ذلك ، يمكن استخدام سخانات المرحلة الأخرى ، بما في ذلك سخانات مرحلة الهواء الساخن والياقات الموضوعية التي يتم التحكم في درجة حرارتها مع الماء الدافئ المتداول ، لهذا الغرض. نظرا لأن مصادر الإثارة المناسبة ضرورية للتألق الصحيح لتوبولين الرودامين ، استخدم ليزر 561 نانومتر مع مللي واط واحد على الأقل من الطاقة في العينة للحصول على صور عالية الجودة. ومع ذلك ، بالنسبة ل GFP MAP65 ، قم بتغيير مصدر الإثارة إلى ليزر 488 نانومتر.
إذا كنت تستخدم مجهر epifluorescence واسع المجال ، فاستخدم مكعب مرشح الرودامين مع إثارة 540 12.5 نانومتر ، وثنائي اللون من 545 نانومتر 12.5 نانومتر قطع ، وانبعاث 575 نانومتر طويل التمرير. بالنسبة ل GFP MAP ، استخدم مكعب مرشح GFP مع إثارة 480 15 نانومتر ، وثنائي اللون من 505 نانومتر 15 نانومتر مقطوع ، وانبعاث 515 نانومتر طويل الممر. بعد التأكد من أن قوة الإضاءة وأوقات التعرض ليست مشبعة بمقياس كثافة الكاميرا ، التقط ما لا يقل عن 10 صور لمناطق مختلفة لتصوير أكثر من 100 تاكتويد في كل من القنوات الحمراء والخضراء ، واحفظها كصور TIFF 16 بت للتحليل.
باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تصور تاكتويد الأنابيب الدقيقة التي يكتمل تكوينها في غضون 30 دقيقة مباشرة تحت المجهر. يمكن رؤية اللباقات باستخدام كل من ليزر 561 نانومتر في قناة توبولين وليزر 488 نانومتر في قناة MAP65. الصور أيضا تتداخل تماما مع بعضها البعض.
في هذه الطريقة ، يمكن قياس طول وعرض tactoids كذلك. تم العثور على ملف تعريف كثافة tactoid يختلف مع عرضه. علاوة على ذلك ، تم إثبات الطبيعة غير المتحركة لكتل الأنابيب الدقيقة من خلال استعادة التألق بعد تجارب التبييض الضوئي أو FRAP ، والتي لم تظهر أي استرداد للتألق بعد التبييض الضوئي.
من ناحية أخرى ، كشفت تجارب FRAP عن طبيعة متنقلة ل MAP65 ، والتي يمكن ملاحظة الانتعاش التدريجي والتألق بعد التبييض الضوئي. يمكن أن يكون هذا الانتعاش الفلوري بواسطة MAP65 مناسبا للاضمحلال الأسي المتزايد للعثور على السعة والنطاق الزمني للانتعاش. يجب إكمال جزء التجربة اللمسية في غضون 10 إلى 12 دقيقة ، حيث يمكن أن يسوء التوبولين على الجليد بسرعة ، مما قد يكون ضارا بنواة اللاكتويدات.
وسيستمر العمل المستقبلي مع مختلف البروتينات المتقاطعة للأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية المترابطة ، وهي إنزيمات يمكنها تحريك الأنابيب الدقيقة ، في الكشف عن معلومات جديدة حول التنظيم الذاتي للمغزل الانقسامي.
