L’analyse du moniteur chirurgical peropératoire est toujours un grand défi dans les chirurgies de résection tumorale, car elle nécessite un outil de diagnostic pour confirmer l’excision complexe du tissu cancéreux avec précision et rapidité. Il est alors possible d’éviter les chirurgies répétées en raison d’une marge chirurgicale positive. Notre microscopie photoacoustique ultraviolette à toit ouvert à grande vitesse peut fournir des images histologiques marquées d’échantillons de tissus en 18 minutes avec une zone d’imagerie de cinq millimètres sur cinq millimètres carrés, montrant un grand potentiel pour l’analyse de marge chirurgicale peropératoire.
La démonstration de la procédure sera faite par Xiufeng Li, un doctorant de dernière année de mon laboratoire. Commencez par régler l’éclairage optique du système microscopique en utilisant un laser à semi-conducteurs pompé par diode Q-switch d’une longueur d’onde de 266 nanomètres comme source d’excitation. Installez deux lentilles convexes pour étendre le faisceau laser et placez un sténopé près du point focal de la première lentille convexe pour le filtrage spatial.
Utilisez un miroir galvanométrique 1D pour réfléchir le faisceau laser vers le haut. À l’aide de la lentille de l’objectif, focalisez le faisceau laser sur un échantillon. Fixez l’UT focalisé en forme d’anneau avec la zone active tournée vers le haut dans un réservoir d’eau de laboratoire avec une fenêtre optiquement transparente au fond recouverte d’un mince couvercle en quartz, puis fixez le réservoir d’eau à un étage manuel à deux axes du microscope pour contrôler la position latérale de l’UT. Lorsque vous avez terminé, allumez le laser UV et ajustez la position de l’UT pour permettre au faisceau laser de traverser le centre de l’UT, puis éteignez le laser UV et remplissez le réservoir d’eau avec de l’eau désionisée pour immerger complètement l’UT. Connectez la sortie de l’UT à deux amplificateurs pour obtenir un gain total de 56 décibels, puis connectez la sortie du deuxième amplificateur à une carte d’acquisition de données, ou DAQ, installée dans l’ordinateur.
Ensuite, fixez un porte-échantillon à un étage manuel de l’axe Z connecté à des étages motorisés xy, puis placez quatre morceaux de ruban adhésif double face entourant le trou vide du porte-échantillon. Plus tard, continuez à aligner le système en attachant du ruban noir à une glissière en verre, puis en plaçant la glissière en verre pour couvrir le trou du porte-échantillon avec le ruban noir tourné vers le bas. Après avoir appuyé sur la lame de verre sur le porte-échantillon, abaissez le porte-échantillon pour immerger la lame de verre dans l’eau.
Déconnectez l’UT en forme d’anneau et les amplificateurs, puis connectez l’UT au pulseur/récepteur et la sortie du pulseur/récepteur à un oscilloscope. Faites fonctionner le pulseur/récepteur en mode écho d’impulsion avec une amplitude d’impulsion de six et un gain de 20 décibels. Une fois les paramètres définis, ajustez la position z du porte-échantillon, définissez la position du plan focal acoustique où les signaux ultrasonores sont maximaux.
Réglez l’impulsion/récepteur en mode de transmission avant de régler le gain à 60 décibels, puis activez la sortie laser et ajustez la position z de l’objectif pour maximiser les signaux photoacoustiques ou PA mesurés par l’oscilloscope. Pour rendre le signal PA généré symétrique et maximal, ajustez la position latérale de l’UT en forme d’anneau, puis ajustez la position z du porte-échantillon pour maximiser les signaux PA. Répétez les réglages pour la position z de l’objectif et du porte-échantillon afin d’optimiser la symétrie et l’amplitude des signaux PA.
Lorsque les signaux PA sont optimisés, enregistrez le délai ou le temps nécessaire aux ondes PA pour atteindre l’UT sur l’oscilloscope. Déplacez le porte-échantillon pour imager différentes positions du ruban noir. Ajustez la planéité des porte-échantillons de manière à ce que les signaux de sonorisation générés à partir de chaque position de la bande noire aient le même délai que celui mesuré précédemment.
Une fois l’alignement du système terminé, éteignez le laser et connectez l’UT aux deux amplificateurs. Pour préparer une tranche de cerveau de souris fixée au formol et incorporée à la paraffine, fixez le cerveau récolté dans du formol tamponné neutre à 10%. Après 24 heures, traiter le cerveau fixe par déshydratation avec de l’alcool gradué, élimination avec du xylène et incorporation avec de la paraffine.
Utilisez un microtome pour obtenir des tranches de cinq micromètres d’épaisseur du cerveau intégré. Placez les tranches d’échantillon sur les lames de quartz pour les sécher dans un four à 60 degrés Celsius pendant une heure. Plus tard, désaffinez les sections du cerveau avec un agent de nettoyage pour éviter les signaux de fond élevés de paraffine.
Pour préparer une nouvelle tranche de cerveau de souris, lavez le cerveau de souris récolté avec du PBS, puis coupez une tranche de cinq millimètres d’épaisseur de l’échantillon de cerveau à la main, puis lavez la tranche de cerveau avec du PBS pour enlever le sang sur la section transversale. Pour le placement de l’échantillon, préparez un réservoir d’échantillon fabriqué en laboratoire avec une membrane en polyéthylène transparent UV d’une épaisseur de 10 micromètres, puis ajoutez une goutte d’eau à la membrane et placez l’échantillon biologique sur le réservoir d’échantillon pour couvrir l’eau. Ensuite, placez le réservoir contenant l’échantillon sur le porte-échantillon en veillant à couvrir le trou vide du porte-échantillon.
Réglez le laser UV sur le mode de déclenchement externe et utilisez le programme de vue de laboratoire construit en laboratoire pour définir les paramètres de numérisation comme décrit dans le manuscrit. Commencez l’analyse d’essai sur une petite région en définissant le nombre d’étapes mobiles des moteurs des axes x et y, puis ajustez l’étage manuel de l’axe Z pour placer l’échantillon sur le plan focal afin d’obtenir un maximum de signaux de sonorisation. Après avoir déplacé les moteurs des axes x et y vers le point de départ souhaité et défini la région de numérisation en définissant les valeurs xn et yn, démarrez le programme d’acquisition d’images.
Lorsque les images sont nécessaires, éteignez le laser et retirez le porte-échantillon. Conservez les tissus biologiques frais dans du formol tamponné neutre à 10 %. Utilisez les signaux PA collectés pour reconstruire l’image de projection d’amplitude maximale à l’aide d’un algorithme de traitement d’image construit en laboratoire.
L’analyse représentative montre les images UV-PAM et H&E d’une tranche de cerveau de souris FFPE. Dans l’image UV-PAM zoomée, les noyaux cellulaires individuels ont pu être résolus. Les noyaux cellulaires correspondants ont été trouvés dans les images colorées H & E standard, montrant la grande précision du système actuel pour l’imagerie cellulaire.
Un algorithme d’apprentissage profond a été appliqué pour transférer l’image UV-PAM en échelle de gris vers une image virtuelle colorée H & E. Il est important d’ajuster la position du transducteur à ultrasons en forme d’anneau pour permettre à la lumière UV de traverser un centre pendant l’alignement du système. Cela garantit qu’un signal photoacoustique détectable peut être obtenu et optimisé davantage lorsque le laser est allumé.
Notre algorithme de classification peut être incorporé pour classer les tumeurs et les régions normales dans les images, servant d’imagerie d’assistance et de plate-forme de diagnostic pour les professionnels de la santé.
