Die intraoperative chirurgische Monitoranalyse ist immer noch eine große Herausforderung bei Tumorresektionsoperationen, da sie ein diagnostisches Werkzeug erfordert, um die komplexe Exzision von Krebsgewebe genau und schnell zu bestätigen. Es ist dann möglich, wiederholte Operationen aufgrund eines positiven chirurgischen Randes zu vermeiden. Unsere Hochgeschwindigkeits-Ultraviolett-Photoakustikmikroskopie mit offenem Deck kann innerhalb von 18 Minuten markierte histologische Bilder von Gewebeproben mit einer Bildfläche von fünf mal fünf Millimeterquadraten liefern, was ein großes Potenzial für die intraoperative chirurgische Randanalyse zeigt.
Das Verfahren wird Xiufeng Li demonstrieren, ein Doktorand im letzten Jahr aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Einstellung der optischen Beleuchtung für das mikroskopische System, indem Sie einen Q-Switch-diodengepumpten Festkörperlaser mit einer Wellenlänge von 266 Nanometern als Anregungsquelle verwenden. Installieren Sie zwei konvexe Linsen, um den Laserstrahl zu erweitern, und platzieren Sie ein Loch in der Nähe des Brennpunkts der ersten konvexen Linse für die räumliche Filterung.
Verwenden Sie einen 1D-Galvanometerspiegel, um den Laserstrahl nach oben zu reflektieren. Fokussieren Sie mit Hilfe der Objektivlinse den Laserstrahl auf eine Probe. Befestigen Sie den ringförmigen, fokussierten UT mit dem aktiven Bereich nach oben in einen im Labor hergestellten Wassertank mit einem optisch transparenten Fenster an der Unterseite, das von einem dünnen Quarz-Deckglas bedeckt ist, und befestigen Sie den Wassertank dann an einem zweiachsigen manuellen Tisch des Mikroskops, um die seitliche Position des UT zu steuern. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den UV-Laser ein und passen Sie die Position des UT an, damit der Laserstrahl durch die Mitte des UT gehen kann, schalten Sie dann den UV-Laser aus und füllen Sie den Wassertank mit deionisiertem Wasser, um die UT vollständig einzutauchen. Schließen Sie den Ausgang des UT an zwei Verstärker an, um eine Gesamtverstärkung von 56 Dezibel zu erhalten, und schließen Sie dann den Ausgang des zweiten Verstärkers an eine im Computer installierte Datenerfassungskarte (DAQ) an.
Als nächstes befestigen Sie einen Probenhalter an einem manuellen Z-Achsentisch, der mit xy-motorisierten Tischen verbunden ist, gefolgt von vier Stück doppelseitigem Klebeband, das das leere Loch des Probenhalters umgibt. Fahren Sie später fort, das System auszurichten, indem Sie schwarzes Klebeband an einem Glasobjektträger befestigen und dann den Glasträger platzieren, um das Loch des Probenhalters mit dem schwarzen Klebeband nach unten zu bedecken. Nachdem Sie den Glasträger auf den Probenhalter gedrückt haben, senken Sie den Probenhalter ab, um den Glasträger in das Wasser zu tauchen.
Trennen Sie den ringförmigen UT und die Verstärker, schließen Sie dann den UT an den Pulser / Empfänger und den Ausgang des Pulsers / Empfängers an ein Oszilloskop an. Betreiben Sie den Pulser/Empfänger im Impulsechomodus mit der Pulsamplitude von sechs und der Verstärkung bei 20 Dezibel. Sobald die Parameter eingestellt sind, passen Sie die Z-Position des Probenhalters an und definieren Sie die Position der akustischen Brennebene, in der die Ultraschallsignale maximal sind.
Wechseln Sie den Puls / Empfänger in den Übertragungsmodus, bevor Sie die Verstärkung auf 60 Dezibel einstellen, aktivieren Sie dann den Laserausgang und passen Sie die Z-Position der Objektivlinse an, um die vom Oszilloskop gemessenen photoakustischen oder PA-Signale zu maximieren. Um das erzeugte PA-Signal symmetrisch und maximal zu machen, passen Sie die laterale Position des ringförmigen UT an und passen Sie dann die z-Position des Probenhalters an, um die PA-Signale zu maximieren. Wiederholen Sie die Anpassungen für die Z-Position der Objektivlinse und des Probenhalters, um die Symmetrie und Amplitude der PA-Signale zu optimieren.
Wenn die PA-Signale optimiert sind, zeichnen Sie die Zeitverzögerung oder die Zeit auf, die die PA-Wellen benötigen, um das UT auf dem Oszilloskop zu erreichen. Bewegen Sie den Probenhalter, um verschiedene Positionen des schwarzen Bandes abzubilden. Stellen Sie die Ebenheit der Probenhalter so ein, dass die von jeder Position des schwarzen Bandes erzeugten PA-Signale die gleiche Zeitverzögerung aufweisen wie die zuvor gemessene.
Nachdem die Systemausrichtung abgeschlossen ist, schalten Sie den Laser aus und schließen Sie den UT an die beiden Verstärker an. Um eine formalinfixierte und paraffineingebettete Maus-Gehirnscheibe vorzubereiten, fixierte das geerntete Gehirn in 10% neutrales gepuffertes Formalin. Nach 24 Stunden das fixierte Gehirn durch Dehydrierung mit abgestuftem Alkohol, Clearing mit Xylol und Einbettung mit Paraffin verarbeiten.
Verwenden Sie ein Mikrotom, um fünf Mikrometer dicke Scheiben des eingebetteten Gehirns zu erhalten. Legen Sie die Probenscheiben auf die Quarzobjektträger, um sie eine Stunde lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius zu trocknen. Später deparaffinisieren Sie die Gehirnabschnitte mit einem Clearing-Mittel, um hohe Hintergrundsignale von Paraffin zu vermeiden.
Um eine frische Mäusegehirnscheibe vorzubereiten, waschen Sie das geerntete Mäusegehirn mit PBS und schneiden Sie dann eine fünf Millimeter dicke Scheibe der Gehirnprobe von Hand, gefolgt von einem Waschen der Gehirnscheibe mit PBS, um das Blut am Querschnitt zu entfernen. Bereiten Sie für die Probenplatzierung einen im Labor hergestellten Probentank mit einer UV-transparenten Polyethylenmembran mit einer Dicke von 10 Mikrometern vor, fügen Sie dann einen Tropfen Wasser zur Membran hinzu und legen Sie die biologische Probe auf den Probentank, um das Wasser abzudecken. Als nächstes legen Sie den probenhaltigen Tank auf den Probenhalter und stellen Sie sicher, dass das leere Loch des Probenhalters abgedeckt ist.
Stellen Sie den UV-Laser in den externen Triggermodus und verwenden Sie das im Labor entwickelte Laboransichtsprogramm, um die Scanparameter wie im Manuskript beschrieben einzustellen. Starten Sie den Testscan in einem kleinen Bereich, indem Sie die Anzahl der beweglichen Schritte der x- und y-Achsenmotoren einstellen und dann den manuellen Z-Achsentisch so einstellen, dass die Probe auf der Brennebene platziert wird, um maximale PA-Signale zu erhalten. Nachdem Sie sowohl x- als auch y-Achsenmotoren zum gewünschten Startpunkt bewegt und den Scanbereich durch Einstellen der xn- und yn-Werte eingestellt haben, starten Sie das Bildaufnahmeprogramm.
Wenn die Bilder benötigt werden, schalten Sie den Laser aus und entfernen Sie den Probenhalter. Lagern Sie frisches biologisches Gewebe in 10% neutralem gepuffertem Formalin. Verwenden Sie die gesammelten PA-Signale, um das Projektionsbild mit maximaler Amplitude mit Hilfe eines im Labor entwickelten Bildverarbeitungsalgorithmus zu rekonstruieren.
Die repräsentative Analyse zeigt die UV-PAM- und H&E-Bilder eines FFPE-Maus-Gehirnschnitts. Im vergrößerten UV-PAM-Bild konnten die einzelnen Zellkerne aufgelöst werden. Die entsprechenden Zellkerne wurden in den standardmäßigen H&E-gefärbten Bildern gefunden, was die hohe Genauigkeit des aktuellen Systems für die zelluläre Bildgebung zeigt.
Ein Deep-Learning-Algorithmus wurde angewendet, um das Graustufen-UV-PAM-Bild in ein virtuelles H&E-gefärbtes Bild zu übertragen. Es ist wichtig, die Position des ringförmigen Ultraschallwandlers so einzustellen, dass das UV-Licht während der Systemausrichtung durch ein Zentrum strömen kann. Dadurch wird sichergestellt, dass ein detektierbares photoakustisches Signal erhalten und weiter optimiert werden kann, wenn der Laser eingeschaltet ist.
Unser Klassifikationsalgorithmus kann weiter integriert werden, um Tumor- und Normalregionen in den Bildern zu klassifizieren und dient als assistive Bildgebung und diagnostische Plattform für medizinisches Fachpersonal.
