Nous présentons ici des protocoles améliorés pour préparer des échantillons cryo-EM avec des films de support à l’aide d’un nouveau bloc de flottation qui facilite la manipulation de films aussi délicats. Le principal avantage de cette méthode est que l’échantillon est protégé de l’interface air-eau où des effets dommageables tels que la dénaturation peuvent se produire. L’un des protocoles présentés ici évite tout type de traitement coûteux pour rendre la graphographie hydrophile, augmentant ainsi son accessibilité à l’ensemble de la communauté EM.
Les petits dispositifs de flottaison ne sont pas encore largement utilisés par l’électromicroscopie pour une bonne préparation. Ces démonstrations visuelles peuvent donc fournir une référence pour leur utilisation. Pour commencer, lavez les grilles TEM avec de l’eau distillée double et de l’acétate d’éthel, puis un nettoyage au plasma.
Ajoutez ensuite 10 à 12 microlitres de l’échantillon dans le puits d’échange tampon, le bloc de flottation et 10 à 12 microlitres de solution d’acétate d’urinoir à 2% dans le puits d’échange non tampon adjacent pour une coloration négative. Il est essentiel de prendre les précautions de sécurité appropriées lorsque vous travaillez avec une tache. Coupez soigneusement deux petits morceaux de mica avec un film de carbone prédéposé sur le dessus.
Assurez-vous que les fragments de mica sont suffisamment larges pour s’insérer dans le puits et plus longs que la longueur du puits, de sorte que le fragment puisse reposer sur le puits pendant que le carbone flotte et qu’il y ait suffisamment d’espace pour manipuler le fragment avec la pince à épiler. Plongez le mica dans le puits avec un angle approximatif de 45 degrés jusqu’à ce que le mica se trouve sur la rampe du puits et que la couche de carbone soit observée à la surface de l’échantillon liquide. Après avoir incubé le carbone avec l’échantillon, retirez la feuille de mica très lentement pour récupérer le film de carbone et minimiser la rétention résiduelle de l’échantillon de viscus.
Épongez soigneusement le mica en tapotant la surface inférieure sans carbone avec un papier filtre pour éliminer l’excès de liquide et immerger le fragment de mica dans le puits opposé contenant une solution d’acétate d’urinoir à 2% pour échanger la couche de carbone avec la tache négative. Récupérez la couche de carbone flottante avec le côté recouvert de carbone sacré de la grille EM lavée et nettoyée au plasma. Laissez ensuite les grilles sécher à l’air libre jusqu’à l’imagerie sur le TEM, de préférence en les recouvrant pour éviter toute contamination en suspension dans l’air.
Après avoir nettoyé les grilles TEM comme démontré précédemment, préparez la suspension d’oxyde de graphène juste avant utilisation et vortexez soigneusement. Ajoutez ensuite 10 à 12 microlitres de suspension d’oxyde de graphène dans les quatre puits d’échange non tampon. le long du bloc de flottaison.
Ajouter 10 à 12 microlitres d’eau double distillée ou d’eau ultra pure dans les quatre puits d’échange tampon restants du bloc. Déposer doucement quatre grilles sur la suspension d’oxyde de graphène de chaque puits et incuber pendant une minute pour s’assurer que le côté recouvert de carbone sacré est en contact avec la solution. Après une minute, récupérez soigneusement chaque grille en faisant glisser la pince à épiler dans la rainure de la pince de chaque puits d’échange non tampon.
Poussez doucement et brièvement le côté recouvert de cuivre non carboné de chaque grille avec l’eau distillée double dans le puits adjacent jusqu’à ce que la goutte d’eau soit visible sur la grille. Ensuite, maintenez soigneusement la goutte d’eau de la grille à l’envers contre un morceau de papier filtre. Couvrez les grilles et laissez-les dans la pince à épiler pour sécher à l’air.
Placez quatre grilles de lavage sur une feuille graphique en cuivre déposée sur une lame de verre et recouvrez chaque grille d’une goutte d’isopropanol pour permettre un contact intime entre le graphène monocouche et la grille. Après l’évaporation complète de l’isopropanol, faire flotter la feuille de graphène de cuivre avec des grilles sur la solution de chlorure ferrique dans la boîte de Petri en verre. Ensuite, couvrez le plat pour éviter la contamination en suspension dans l’air et laissez-le graver à température ambiante pendant la nuit.
Utilisez une boucle d’un diamètre supérieur à la taille de la grille TEM pour extraire les grilles flottant sur la monocouche de graphène et transférez-les soigneusement dans une boîte de Petri en verre contenant de l’eau distillée double pour le lavage. Lavez les grilles deux fois dans de l’eau et transférez-les dans une boîte de Petri contenant un tampon d’échantillon jusqu’à la préparation de l’échantillon et la congélation. Ajouter 10 à 12 microlitres de l’échantillon dans un puits du bloc de flottation.
Lorsque l’échantillon est prêt dans le bloc, choisissez la grille enduite de graphène dans la solution tampon à l’aide d’une pince à épiler propre et placez-la sur la surface de l’échantillon contenant le puits. Après une période d’incubation appropriée, ramassez la grille avec une paire de pinces à épiler propres et procédez à l’effacement et à la vitrification. Les grilles colorées négativement préparées avec le bloc de flottation de support sont généralement recouvertes de carbone amorphe sur toute la surface de la grille.
Bien que la rupture du film de carbone se produise dans certains cas, un grand nombre de carrés de grille sont immaculés et donc applicables à des fins de coloration négative. De même, une bonne couverture de film est régulièrement obtenue sur l’ensemble de la grille en utilisant le protocole d’oxyde de graphène. Les grilles d’oxyde de graphène peuvent être préparées rapidement à partir de matières premières et sont très protectrices de l’échantillon.
Garder le graphène humide et l’application de l’échantillon in situ juste avant la congélation est suffisant pour générer des couches de glace appropriées pour la cryo-EM. Ce protocole ne nécessite pas d’équipement pour rendre le graphène hydrophile et offre un avantage pour la récupération de l’échantillon. Le bloc de flottation de support a deux orifices d’aiguille sur le site de chaque puits qui permettent l’extension du tampon en C2, ce qui est très utile pour les échantillons dérivés de gradients de glycérol.
Le bloc de flottation a permis d’explorer des méthodes de purification d’affinité sur grille en utilisant un flux tampon contrôlable de petits volumes, ainsi que des films de support fonctionnalisés.
