Notre protocole permet l’introduction reproductible de micro-organismes et d’agents thérapeutiques dans l’œil de souris pour étudier la pathogénie de l’infection intraoculaire et l’efficacité du traitement nouveau. Notre technique permet d’établir des infections intraoculaires dans un modèle murin et facilite la quantitation des micro-organismes, des réponses immunitaires de l’hôte, de l’expression des gènes de l’hôte et des pathogènes liés à l’infection, et de l’efficacité du traitement. La visualisation du site d’injection, l’angle de l’aiguille et la livraison sont essentiels à la réussite de l’exécution de cette technique et une bonne récolte oculaire est essentielle à la quantification des paramètres d’infection.
Dans une installation de niveau de biosécurité deux, ajouter cinq millilitres de bouillon BHI à un tube à bouchon de 10 millilitres et utiliser une boucle stérile pour transférer une seule colonie de B.cereus d’une culture de plaque d’auger en cinq millilitres de bouillon. Après un bref vortex, incuber l’échantillon dans un incubateur rotatif de 37 degrés Celsius à 200 révolutions par minute pendant 18 heures. À la fin de l’incubation, diluer la culture à une concentration de 200 unités de formation par microlitre dans 10 millilitres de BHI frais, et après le vortex, ajouter un millilitre de la culture fraîchement diluée à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre sur la glace.
Pour l’injection intravitreal, allumez le microinjecteur et ouvrez la valve de gaz sur le réservoir d’air comprimé attaché au microinjecteur. Appuyez sur Le mode sur le microinjecteur jusqu’à ce que l’écran affiche l’équilibre. Appuyez sur Balance et placez la souris d’ordinateur sur la table d’opération.
Connectez le support de pipette en acier inoxydable au tube attaché à la sortie de remplissage sur l’injecteur et vissez fermement le connecteur de support de pipette autour d’une aiguille capillaire biseauté de pointe de pipette de verre pour permettre l’insertion de l’aiguille capillaire dans l’autre extrémité du support de pipette. Allumez le microscope ophtalmique et réglez l’intensité lumineuse à 50% Placez le microscope sur le site de la procédure et ajustez le microscope à la mise au point désirée. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, placez la souris anesthésiée sur son côté gauche sur les dessous médicaux avec le nez pointé vers la droite.
Localiser l’œil droit à travers l’objectif du microscope ophtalmique et placer les pinces des forceps d’action inverse de chaque côté de l’œil pour exposer le site d’injection. Cliquez à gauche sur la souris connectée au microinjecteur pour remplir l’aiguille capillaire préparée avec la solution de bactéries diluées, et fixer la tête avec la main gauche, placer la pointe de l’aiguille, côté biseauté vers le haut, dans le limbe de l’œil. Avec l’aiguille à un angle de 45 degrés, percer l’œil, en prenant soin que seulement 0,5 millimètres de la pointe pointue de l’aiguille est inséré.
Une fois que la pointe de l’aiguille a été insérée, utilisez la main gauche à droite cliquez sur le tapis de souris pour injecter 0,5 microlitres de la solution B.cereus. Pour éviter les fuites, laissez la pointe de l’aiguille à l’intérieur de l’œil de la souris pendant deux à trois secondes avant de retirer, puis relâchez les forceps et l’œil retournera dans la prise par lui-même. Transférer la souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète.
Au point de terminaison expérimental approprié, ajouter 400 microlitres de PBS complétés avec l’inhibiteur de protéase dans un tube de récolte étiqueté et autoclavé par oeil sur la glace et placer les forceps fins ouverts d’extrémité de chaque côté de l’oeil infecté. Poussez les pointes vers le bas vers la tête pour proptose l’oeil. Une fois que les pinces sont derrière le globe oculaire, presser les pinces ensemble et tirer les forceps loin de la tête pour détacher le globe oculaire.
Placez immédiatement le globe oculaire dans le tube de récolte dûment étiqueté. Dans les 60 minutes qui ont pris la collecte de l’échantillon, placez les tubes de récolte fermés dans un homogénéisateur tissulaire et homogénéisez les échantillons pendant deux périodes d’homogénéisation d’une minute avec une période de repos de 30 secondes entre les deux. Après homogénéisation, placez les échantillons sur la glace et utilisez 20 aliquots microlitres d’homogénéité pour diluer périodiquement les échantillons dans 180 microlitres de PBS par dilution, jusqu’à ce qu’un facteur de 1 fois 10 à 8 négatifs soit atteint.
Ensuite, étiquetez chaque rangée d’une plaque BHI préchauffée carrée avec la concentration appropriée de dilution, et avec la plaque inclinée à un angle de 45 degrés, ajoutez 10 microlitres de chaque dilution en rangées individuelles en haut de la plaque. Laissez chaque échantillon courir jusqu’à ce qu’il atteigne presque le fond de la plaque avant de poser la plaque à plat. Lorsque les échantillons ont été absorbés dans l’agar, transférez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius.
Les colonies devraient commencer à être visibles après huit heures d’incubation. Pour une représentation précise de la concentration dans l’échantillon, comptez la ligne qui a entre 10 et 100 colonies. La construction d’une pointe biseauté d’aiguille en verre est essentielle pour livrer les bactéries dans le milieu-vitré de l’oeil de souris.
Dans ces images, Bacillus cereus se développe sur une plaque d’agar de sang et dans des tubes de culture de bouillon sont montrés. Comme l’illustre ce graphique des dénombrements bactériens interoculaires de cinq yeux de souris différents à 10 heures après l’infection entre une fois 10 à la cinquième et une fois 10 à la septième colonie formant des unités de bactéries peuvent généralement être récupérés à partir d’un seul œil infecté. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est d’injecter ce volume approprié de bactéries dans l’œil de la souris.
Après cette procédure, nous pouvons étudier l’inflammation par l’histologie, les médiateurs inflammatoires par ELISA, et l’expression de gène par le séquençage élevé d’ARN de débit pour faciliter une meilleure compréhension de la pathogénie de cette maladie.
